王亞秀,張妮南,張學(xué)芬,和禹廷,劉小愿,張魯剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

花青素不僅可以賦予蔬菜、水果五彩斑斕的顏色，而且還具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)花青素作為天然的抗氧化劑，也是最強(qiáng)效的自由基清除劑[1]，更有利于預(yù)防疾病等功能[2-4]。相較于普通大白菜，紫色大白菜積累了較多的花青素，能夠在不同的生長環(huán)境和生長階段表現(xiàn)出不同程度的紫色[5]。在研究中發(fā)現(xiàn)，植物組織中是否含有花青素，通常通過肉眼觀察和花青素的測定兩種途徑，肉眼觀察不僅判斷準(zhǔn)確性差，而且觀察者也存在差異?；ㄇ嗨氐臏y定方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但需要專門儀器，如pH示差法，分光光度計(jì)[6]，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀等方法[7-9]，操作過程復(fù)雜，測定成本高，不適宜大量樣品的快速判斷。因此，尋找一種快速檢測植物組織花青素、輔助提高肉眼觀察準(zhǔn)確性的鑒定技術(shù)十分必要。

對(duì)于不同程度紫色大白菜，人眼觀察到的顏色容易受到個(gè)體差異和環(huán)境因素的影響，色差計(jì)可以客觀地定量顏色，并且可以量化評(píng)估顏色[10-11]。近年來，色差計(jì)在蔬菜和水果品質(zhì)上評(píng)定應(yīng)用研究日益廣泛[12]，利用色差計(jì)可以快速檢測西瓜、番茄紅素含量[13]；測定成熟黃瓜果皮色差值，并根據(jù)色差值將黃瓜成熟果皮可分為不同色系[14]；在觀賞辣椒類胡蘿卜素積累特性的研究中，發(fā)現(xiàn)色差值a*與類胡蘿卜素具有較高的相關(guān)性[15]；有研究報(bào)道以色差值L、a、b、c、h和 DA值對(duì)冬棗色澤進(jìn)行判定，發(fā)現(xiàn)色澤與甜度存在相關(guān)性，說明用色差預(yù)測冬棗的甜度是可行的[16]。本研究利用色差計(jì)對(duì)散葉紫色葉脈大白菜的葉脈顏色判定分析，進(jìn)一步探討色差計(jì)在大白菜葉脈花青素含量判斷中的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的散葉大白菜由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院白菜研究課題組提供，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田。3類材料是經(jīng)兩代自交的純合系，在蓮座期葉脈表現(xiàn)出明顯紫色、淺紫色和白色表型，群體內(nèi)單株間性狀表現(xiàn)高度一致。2020-09-01將所有試驗(yàn)材料播種在72孔穴盤，30 d后移栽到露地，35 d后進(jìn)行葉脈顏色調(diào)查，根據(jù)葉脈顏色表型，將散葉大白菜葉脈顏色劃分為紫色(圖1-A)、淺紫色(圖1-B)和白色(圖1-C)，分別用Z、Q和B 表示。

A.紫色葉脈；B.淺紫色葉脈；C.白色葉脈；標(biāo)尺為 5 cm

1.2 花青素含量測定

移栽到露地35 d后，每個(gè)株系選取3個(gè)單株，取蓮座期從外往里數(shù)第5、6、7片葉脈，距離葉脈底部5 cm處，用刀片切取葉脈上部新鮮樣品將其混勻，取1 g測量花青素含量，將樣品真空冷凍干燥，研磨至均勻的粉末，加入10 mL 1%鹽酸-甲醇溶液，4 ℃低溫避光浸提12 h, 離心后取上清液1 mL，加入pH 4.5的0.2 mol·L-1醋酸鈉緩沖液4 mL，再取上清液1 mL加入pH 1.0 的0.2 mol·L-1氯化鉀緩沖液4 mL，搖勻混合，分別以525 nm和700 nm 為吸收波長測定其吸光度。每個(gè)處理重復(fù)3次[17]。

提取液花青素濃度(mg·L-1) = A×εL-1×103×MW×稀釋倍數(shù)

式中：A = ( A525 nm，pH1.0 -A700 nm，pH1.0 )-( A520 nm，pH4.5 - A700 nm，pH4.5) ；ε為花青苷的摩爾消光系數(shù)，26 900；MW為花青苷的摩爾質(zhì)量(449.2)。

1.3 葉脈色差值測定

用CR-400色差計(jì)(北京光學(xué)儀器廠) 測定散葉大白菜中不同顏色葉脈的L*、a*、b*值。其中L*代表亮度軸，表示黑白，0為黑，100為白；a*代表紅綠軸，正值為紅，負(fù)值為綠，0為中性；b*代表黃藍(lán)軸，正值為黃，負(fù)值為藍(lán)，0為中性。移栽到露地35 d后，每個(gè)株系選取3個(gè)單株，取蓮座期從外往里數(shù)第5、6、7片葉脈，距離葉脈底部5 cm處測定色差值并取平均值，每種顏色分別選擇6個(gè)株系進(jìn)行測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顏色葉脈的花青素含量比較

采用pH示差法對(duì)單位質(zhì)量不同顏色葉脈花青素含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2-A所示，紫色葉脈中花青素含量最高，達(dá)78.45 mg·kg-1，淺紫色葉脈中含有較高的花青素，含量為16.70 mg·kg-1，而白色葉脈中的花青素含量最低，僅有1.99 mg·kg-1。進(jìn)一步對(duì)不同顏色葉脈花青素提取上清液顏色拍照比較，結(jié)果如圖2-B所示，紫色葉脈的上清提取液顏色呈紫紅色，淺紫色葉脈的上清提取液呈粉紅色，白色葉脈的上清提取液顏色則呈黃綠色。總之，不同顏色葉脈花青素的總含量差異達(dá)到顯著水平，花青素含量變化趨勢與葉脈顏色由深至淺變化趨勢基本一致，上清液顏色也與葉脈顏色由深至淺變化趨勢基本一致，相比較淺紫色葉脈與白色葉脈花青素含量差異較小，其花青素提取液顏色也比較接近。

A.花青素含量；B.花青素提取液顏色。柱圖上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 不同顏色葉脈的色差值比較

根據(jù)葉脈顏色變化將試驗(yàn)材料劃分為紫色葉脈(Z)、淺紫色葉脈(Q)和白色葉脈(B)。用色差計(jì)分別測量其葉脈色差值參數(shù)L*、a*和b*，結(jié)果表明(圖3)，紫色葉脈(Z)的L*值分布在 47.21～ 53.62，淺紫色葉脈(Q)的L*值分布在 61.63～67.44，白色葉脈(B)L*值在70.62～ 75.31，說明從Z、Q到B葉脈亮度逐漸增加，即反映了從Z、Q到B葉脈的色素積累逐漸減少，反光增強(qiáng)，并且三者的L*值間隔明顯，很容易相互區(qū)分。在紅綠軸參數(shù)a*中，3類材料也表現(xiàn)出一定的色差規(guī)律，Z的參數(shù)a*為正值，說明Z的顏色偏向紅色，而Q和B參數(shù)a*為負(fù)值，說明Q和B的顏色偏向綠色、且Q較B的參數(shù)a*值更小，Q和B的a*有明顯間隔，也可以明確區(qū)分。黃藍(lán)軸b*的表現(xiàn)與紅綠軸參數(shù)a*正好相反，Z的b*值為負(fù)值，而Q、B的b*值為正值，說明Z比Q和B顏色趨近于藍(lán)色，其中Q較B的參數(shù)b*小，Q和B的b*存在明顯間隔，可以明確區(qū)分。由此可見，3個(gè)色差值變化規(guī)律與人眼觀察到的顏色變化趨勢基本一致，3種材料的色差值參數(shù)L*、a*和b*間均存在明顯差異，但都是Z與Q和B的差異最大，而Q和B的差異較小，區(qū)別Q和B需要確定相應(yīng)的界限值，方可作為一種可靠客觀的表示葉脈顏色變化的方法。

柱圖上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

為了進(jìn)一步明確區(qū)分紫色、淺紫色和白色葉脈顏色差異范圍，對(duì)其色差值參數(shù)L*、a*和b*值做顯著性差異分析，在0.01水平上分析了3個(gè)參數(shù)的范圍(表1)。紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的L*值范圍分別是49.473±2.427、64.530±2.184、72.723±1.652；紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的a*值范圍分別是11.847±2.396、-2.44±1.593、-6.705±1.611；紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的b*值范圍分別是-3.315±1.329、 8.765±1.239、13.752±2.445。其中紫色葉脈和淺紫色葉脈、淺紫色葉脈和白色葉脈的L*值邊界的間隔分別是10.446和4.357，淺紫色葉脈和白色葉脈的a*值邊界的間隔分別是1.061，淺紫色葉脈和白色葉脈的b*值邊界的間隔分別是 1.303，可以看出3種材料的色差值參數(shù)L*、a*和b*邊界間均存在明顯間隔，其中L*值的間隔最大，最容易區(qū)分紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈。以上述各個(gè)參數(shù)間隔的中點(diǎn)作為劃分界，則利用3個(gè)參數(shù)進(jìn)行紫色葉脈判斷，其標(biāo)準(zhǔn)如下：色差參數(shù)L*值為Z≤52，62≤Q≤68，70≤B；a*值為Z≥9，-3≤Q≤0，B≤-5；b*值為Z≤0，6≤Q≤10，11≤B。因此，可以作為判斷紫色、淺紫色和白色葉脈顏色差異的方法。

表1 不同顏色葉脈色差值平均值差異顯著性分析及有效區(qū)間Table 1 Significant analysis of average values and effective interval of different color veins

2.3 色差值與花青素含量的相關(guān)性分析

對(duì)散葉大白菜不同顏色葉脈總花青素含量與色差值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示?；ㄇ嗨睾颗c色差值L*、a*、b*存在極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.8917、0.7979、0.8917，所以色差值在一定程度上可以反應(yīng)花青素含量。

表2 不同顏色葉脈色差值與花青素含量相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients among chroma value and anthocyanin content of different color veins

3 討論與結(jié)論

前人研究表明富含花青素的蔬菜，不僅抗氧化能力強(qiáng)，對(duì)人的大腦、肝臟和腎臟可以產(chǎn)生有效的保護(hù)作用[18]，對(duì)預(yù)防心血管疾病、控制肥胖也有價(jià)值[19-20]，因此培育積累花青素的蔬菜成為品質(zhì)育種的重要方向。通過多年的研究，蔬菜育種科學(xué)家已培育出富含花青素大白菜的多種類型[21-24]。本試驗(yàn)中使用的散葉大白菜是一種新的大白菜材料，其特點(diǎn)是葉脈表型為紫色，富含花青素，是上述紫色大白菜白色葉脈的一個(gè)補(bǔ)充，對(duì)紫色大白菜新種質(zhì)創(chuàng)制可以提供新的可能，能夠進(jìn)一步滿足人們對(duì)大白菜多樣性的需求。

由于花青素合成的復(fù)雜性及環(huán)境條件的影響，普遍存在紫色深淺的判斷情況[25]，紫色觀賞辣椒，因其品種和生長環(huán)境不同，對(duì)花青素測量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生一定影響[26]，茄子果色作為茄子果實(shí)的重要商品性狀，選育果皮富含花青素的品種對(duì)茄子育種具有一定意義，所以如何快速判斷紫色果色程度顯得尤為重要[27]。而色差計(jì)作為一種簡單的顏色偏差測試儀器，通過輸出L*、a*、b*3組數(shù)據(jù)，從3個(gè)方面評(píng)估測試材料的色澤變化，從而可以反應(yīng)相應(yīng)色素物質(zhì)含量多少，可以減少因外界因素及人為因素造成的試驗(yàn)誤差。色差計(jì)在番茄、辣椒和茄子等蔬菜上應(yīng)用廣泛，涉及果皮顏色、番茄紅素含量、類胡蘿卜素含量的測定[28]，但未見在大白菜紫色性狀中的應(yīng)用。

與其他紫色蔬菜研究類似，本試驗(yàn)使用的散葉大白菜在紫色葉脈判斷過程中會(huì)受多種因素的影響導(dǎo)致肉眼判斷誤差。利用pH示差法，對(duì)葉脈花青素提取，不同顏色葉脈花青素提取液在經(jīng)過12 h處理后出現(xiàn)不同深淺的顏色變化，這與葉脈花青素含量相關(guān)；另外，相同顏色葉脈提取液也存在不同程度的顏色梯度，這一結(jié)果可能是以肉眼為判斷標(biāo)準(zhǔn)所取的樣品存在差異導(dǎo)致的；值得關(guān)注的是Q、B花青素上清液顏色肉眼區(qū)分模糊，但花青素測定結(jié)果表明Q、B的花青素含量具有顯著性差異，說明可視化結(jié)果雖然直觀，但量化的結(jié)果更準(zhǔn)確，這就要求在取樣過程中更加精細(xì)和科學(xué)。進(jìn)一步采用色差計(jì)對(duì)大白菜紫色葉脈、淺紫色葉脈和白色葉脈色差進(jìn)行測定比較，結(jié)果3個(gè)材料3個(gè)色差參數(shù)的差異均達(dá)到顯著水平、并且有不同的間隔，都可以區(qū)分3種不同顏色的葉脈，其中3個(gè)材料的L*值具有最大的間隔，最容易區(qū)分3個(gè)材料，相比較花青素測定方法，色差值測定只需要便攜式色差儀，不需要專門試劑和復(fù)雜儀器，也沒有樣品前處理等過程，檢測速度快，成本低，是一種簡單、準(zhǔn)確的量化紫色性狀的方法，為大白菜紫色葉脈性狀的基因定位、分子機(jī)理研究提供了新的方法，解決了采樣過程中因人眼無法準(zhǔn)確判斷顏色而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果誤差的問題，這與前人利用色差計(jì)測定番茄紅素方法相似[13,29]，對(duì)于同類研究有一定的借鑒意義。