李劍靜

廣西岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西岑溪 543200

廣西某大型豬場(chǎng)存欄豬4 300 頭，2021 年10月20 日開始進(jìn)豬，每次進(jìn)豬500 頭左右，持續(xù)進(jìn)豬十多天，進(jìn)場(chǎng)小豬體重在7.5 kg 左右，進(jìn)場(chǎng)后的小豬3～4 d 開始發(fā)病，每天死亡15 頭左右，死亡小豬不食、消瘦，沒有其他明顯臨床癥狀，死亡時(shí)間持續(xù)半個(gè)月，共死亡286 頭。通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)本次仔豬主要以豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV2、PCV3）型、大腸桿菌等混合感染為主。

PRRSV 病毒屬于冠狀動(dòng)脈科的球形病毒，全長(zhǎng)15 kb 左右，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，由于該病毒主要在肺部集聚，所以感染此病毒的仔豬容易出現(xiàn)呼吸道疾病的癥狀，臨床上難以辨別。顧瑞恒[1]對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行PRRSV 病毒的檢測(cè)、分離與測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)，該病毒主要是在編碼GP2、GP3、GP4 與GP5 的基因上易發(fā)生堿基的插入、替換與缺失，這為本病的檢測(cè)治療帶來了挑戰(zhàn)。PCV 病毒屬于圓環(huán)病毒科的正二十面體病毒，全長(zhǎng)1.7 kb 左右，是一種單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA 病毒，該病毒亞型種類較多，我國(guó)主要以2 型與3 型為主，此病毒大多由呼吸道感染，由于PCV 病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單編碼蛋白少，因此致病性不強(qiáng)，但該病毒抵御外界環(huán)境的能力強(qiáng)，常與其他病菌混合感染宿主，加重仔豬病情。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）病料來源。廣西岑溪某豬場(chǎng)病死的仔豬，剖解后取出心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、血樣、淋巴結(jié)等至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2）試驗(yàn)器材。酒精燈、鑷子、解剖剪、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、超凈工作臺(tái)、移液槍、恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱、搖床、天平、光學(xué)顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀等。

3）試劑。國(guó)測(cè)生物豬藍(lán)耳病毒/豬偽狂犬病毒/豬瘟病毒/豬圓環(huán)病毒II 型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 聯(lián)檢試劑盒、病毒DNA/RNA 提取試劑盒、100 bp Ladder、2*Es Taq MasterMix（Dye）、ddH2O、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1）細(xì)菌的培養(yǎng)鑒定。用點(diǎn)燃的酒精棉球在肺臟、腎臟表層進(jìn)行消毒滅菌，選取病變較為明顯的部位剪開，用滅菌的接種環(huán)蘸取病變組織部位，劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

2）病料DNA/RNA 的提取。將肺臟的病變部位剪取小部分，置于無菌的研缽中，加入1 mL 的生理鹽水研磨，直至組織樣品破碎，然后將研磨好的組織樣品裝入2 mL 的EP 管中反復(fù)凍融3 次，使病菌細(xì)胞破裂，便于細(xì)菌DNA/RNA 的提取。參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19915.4-2000 的方法，將EP 管中反復(fù)凍融的樣品在12 000 r/min 離心5 min，用移液槍吸取上層液體，置于1.5 mL 的EP 管中加入蛋白酶K后，按照北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的病毒DNA/RNA 提取試劑盒的說明，提取病料樣品的DNA/RNA，置于-20 ℃的冰箱中備用。

3）RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。將上一步提取的病料RNA 病毒按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)，為下一步PCR 試驗(yàn)提供模板。將反轉(zhuǎn)錄好的樣品按照國(guó)測(cè)生物豬藍(lán)耳病毒/豬偽狂犬病毒/豬瘟病毒/豬圓環(huán)病毒II 型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 聯(lián)檢試劑盒說明步驟進(jìn)行。豬圓環(huán)Ⅲ型病毒檢測(cè)則按照普通PCR 步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬病原菌的檢測(cè)

1）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)。通過實(shí)時(shí)熒光RTPCR 檢測(cè)（表1、圖1 所示），PRRSV、PCV 檢測(cè)結(jié)果為典型的“S”型曲線，豬藍(lán)耳病毒的CT 值與豬圓環(huán)病毒II 型的CT 值均大于陽性對(duì)照值，因此可以判定本次病料中含有豬藍(lán)耳病病毒與豬圓環(huán)病II 型病毒[2]。

圖1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

表1 病料檢測(cè)結(jié)果

2）普通PCR 檢測(cè)。對(duì)PCV3 型病毒進(jìn)行普通PCR 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽性。

3）細(xì)菌分離鑒定。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為桃紅色，圓形菌落、邊緣整齊、表面光滑，如圖2和圖3 所示，革蘭氏染色鏡檢為紅色短桿狀。綜合外觀與鏡檢結(jié)果判定為大腸桿菌。

圖2 大腸桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果

圖3 大腸桿菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

綜合以上的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，本次發(fā)病仔豬主要以PRRSV、PCV2、PCV3 以及大腸桿菌混合感染為主。因此，必須采取綜合防控措施進(jìn)行防治。

2.2 PRRSV、PCV 病毒全基因組比較

1）PRRSV 病毒基因組分析。

①動(dòng)脈炎病毒屬全基因組共線性分析。將PRRSVR-2332 毒株的全基因組與動(dòng)脈炎病毒屬的全部21 株病毒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PRRSVR-2332 毒株在1 000、5 900、12 200 bp 處存在150 bp 長(zhǎng)度的大片段相似性（圖4）。說明該病毒屬的毒株在這3個(gè)區(qū)域附近存在保守序列，不易發(fā)生突變，可進(jìn)行檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)[3]。

圖4 動(dòng)脈炎病毒屬全基因組共線性分析

②PRRSV 病毒ORF 編碼區(qū)。通過對(duì)PRRSVR-2332 毒株全基因組注釋分析（圖5），可以很直觀地看出該病毒一共編碼8 個(gè)蛋白，分別為ORF1a、ORF1b、GP2、GP3、GP4、GP5、M 與N 蛋白為主。而ORF1a、ORF1b 蛋白主要為性質(zhì)穩(wěn)定核蛋白，GP3、GP4、M 蛋白為主要的膜蛋白，N 蛋白是核衣殼蛋白，其中GP2、GP5 蛋白為糖基化包膜蛋白，糖基化蛋白主要與PRRSV 病毒表面的受體及抗原特異性有關(guān)[4]。

圖5 PRRSV 病毒全基因組注釋

③PRRSV 病毒ORF 編碼區(qū)基因比較。對(duì)PRRSV 全基因組8 個(gè)編碼區(qū)GC 含量比較分析（圖6～圖13），編碼ORF1a、ORF1b、GP2、GP3、GP4、GP5、M 與N 蛋白區(qū)域的GC 含量分別為54.6%、52.96%、46.31%、50.72%、48.42%、50.09%、51.42%、50.81%。GC 含量的高低又間接反映出基因組區(qū)域的穩(wěn)定性[5]。通過比較發(fā)現(xiàn)，可以在穩(wěn)定性較高的ORF1 區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用于鑒定該病毒。

圖6 ORF1a 編碼區(qū)GC 含量

圖7 ORF1b 編碼區(qū)GC 含量

圖8 GP2 編碼區(qū)GC 含量

圖9 GP3 編碼區(qū)GC 含量

圖10 GP4 編碼區(qū)GC 含量

圖11 GP5 編碼區(qū)GC 含量

圖12 M 蛋白編碼區(qū)GC 含量

圖13 N 蛋白編碼區(qū)GC 含量

④幾種不同PRRSV 病毒糖基化包膜蛋白編碼基因區(qū)域比較。通過對(duì)幾種不同PRRSV 病毒編碼糖基化包膜蛋白區(qū)域的基因進(jìn)行比較分析（圖14～圖15），編碼GP2 蛋白的9 種基因在其中出現(xiàn)大片段的變異，GP2 對(duì)應(yīng)的基因區(qū)域的GC 含量也是最低，這就導(dǎo)致GP2 區(qū)域的基因不斷出現(xiàn)變異，增加了免疫系統(tǒng)的識(shí)別負(fù)擔(dān)與治療、檢測(cè)的難度[6]。而對(duì)編碼GP5 糖基化包膜蛋白的17 種毒株的區(qū)域基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域相比GP2 蛋白區(qū)域要穩(wěn)定得多，因此免疫細(xì)胞可以更好地識(shí)別與記憶，避免了該毒株的免疫逃逸，同時(shí)可以利用該區(qū)域相對(duì)穩(wěn)定的抗原特異性蛋白制作抗原抗體復(fù)合物的快速檢測(cè)試劑進(jìn)行PRRSV 的快速鑒定。

圖14 11 種不同PRRSV 病毒GP2 編碼區(qū)基因比較

圖15 17 種不同PRRSV 病毒GP5 編碼區(qū)基因比較

2）PCV 病毒基因組分析。

①PCV 病毒3 種血清型基因組比較。通過對(duì)PCV 病毒3 種血清型全基因組比較（圖16），發(fā)現(xiàn)PCV1、PCV2 2 種病毒全基因組發(fā)生了倒置，PCV1、PCV2、PCV3 毒株分別在610、880、1 650 bp 處出現(xiàn)相同片段。因此，猜測(cè)PCV3 可能是由其他種類的病毒變異而來，與PCV1、PCV2 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[7]。

②62 株P(guān)CV2 型毒株基因組比較。通過對(duì)2022年1-5 月發(fā)布在NCBI 上所有PCV2 型毒株進(jìn)行全基因組比較（圖17），發(fā)生在中國(guó)的3 株P(guān)CV2 型毒株出現(xiàn)明顯的大片段的變異。這是因?yàn)镻CV 病毒無囊膜，基因片段小，所以更容易發(fā)生變異[8]。

圖17 62 株P(guān)CV2 型毒株基因組比較

3 討 論

大腸桿菌由于亞種較多，有致病性與非致病性，因此常規(guī)的生化試驗(yàn)無法準(zhǔn)確地判斷其種類，目前臨床上以菌體表面抗原種類的血清型鑒定為主，但隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，這種檢測(cè)技術(shù)存在著巨大的缺陷，細(xì)菌之間存在可移動(dòng)元件，菌株之間相互傳遞遺傳信息，導(dǎo)致菌株之間的同種菌株鑒定更加困難。羅干[9]對(duì)107 株分離的致病性大腸桿菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定，主要以O(shè) 型為主，又對(duì)107 株致病性大腸桿菌進(jìn)行了16 種毒力基因的檢測(cè)，共檢測(cè)出11 種毒力因子。其中，有3 種毒力基因（yij-P：96.26%，ibe-B：85.98%，omp-A：100%）的檢出率在85%以上。因此，對(duì)O 型致病性大腸桿菌的鑒定以毒力因子基因的檢測(cè)進(jìn)行分類會(huì)更加細(xì)致。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒是一種烈性、傳染性高的病毒。于芳[10]對(duì)我國(guó)9 個(gè)省分離得到的12 株P(guān)RRSV 病毒進(jìn)行全基因組比較關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)EUtype PRRSVs 毒株的高頻基因組重組區(qū)主要為GP2～GP4 存在復(fù)雜的插入缺失多樣性，這與本試驗(yàn)的分析相一致，而ORF 只存在較少的突變堿基。因此，基因組分析與試驗(yàn)驗(yàn)證表明ORF 區(qū)是較為保守的，可用于引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行PRRSV 病毒的檢測(cè)。

豬圓環(huán)病毒由于基因組片段較小，只有2 個(gè)開放閱讀框，且無囊膜，因此外界的環(huán)境因素容易導(dǎo)致其發(fā)生變異。王東源[11]從疑似病豬的肺臟組織中的PK-15 細(xì)胞成功分離出PCV2 型病毒，經(jīng)過對(duì)分離病毒的全基因組鑒定、同源比較發(fā)現(xiàn)與病毒株FJ594471-1C01 親緣關(guān)系較近，但在個(gè)別堿基上發(fā)生突變。因此，這種基因組小、無囊膜、編碼蛋白少、無基因修復(fù)能力的病毒，更容易發(fā)生突變，對(duì)這種病毒的檢測(cè)鑒定就更加困難。

從基因組層面對(duì)PRRSV、PCV 進(jìn)行比較分析，通過共線性分析發(fā)現(xiàn)PRRSV 病毒編碼GP2 蛋白對(duì)應(yīng)的基因區(qū)域易發(fā)生突變；對(duì)2022 年1-5 月62 份PCV 基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)出現(xiàn)3 個(gè)變種。本研究通過對(duì)PRRSV-2332 型、PCV2 型與PCV3 型毒株進(jìn)行全基因組共線性分析比較，找出基因組中的保守大片段與易于突變的片段，提取保守片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)來快速鑒定病毒，設(shè)計(jì)突變區(qū)引物用以檢測(cè)病毒是否發(fā)生變異[12]。該方式為變異病毒檢測(cè)提供了一定的理論依據(jù)。