李曉蕓 ,程振濤

（1.道真仡佬族苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 遵義 563500；2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于家兔的腸道和肝臟所引起的一種原蟲病，兔感染該病后主要癥狀為腹瀉、消瘦，甚至死亡，為嚴(yán)重危害家兔的一種常見多發(fā)性疾病。不同品種、不同年齡段的兔均易感，其中，斷奶至3月齡的幼兔最易發(fā)病，死亡率可達(dá)80%，患病耐過的兔生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響，降低兔的生產(chǎn)性能，成年兔感染球蟲后多數(shù)不發(fā)病而成為帶蟲兔[1]，該病的流行會給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報道，兔球蟲病目前已在國內(nèi)廣泛流行，JING 等[2]報道，全國14 個省兔球蟲總感染率為41.9%；姜英等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河南省11 個地區(qū)兔球蟲平均感染率為74.6%；李潔等[4]發(fā)現(xiàn)，新疆5 個地區(qū)兔球蟲總感染率為75.7%；任永軍等[5]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川省5 個地區(qū)兔球蟲平均感染率為61%。目前公認(rèn)的兔球蟲種類有11 個有效種[6-7]，但不同地區(qū)優(yōu)勢蟲種在一定程度上有所不同[3,5]，這與不同地區(qū)地理位置、氣候條件等因素有關(guān)。PCR 技術(shù)具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可準(zhǔn)確鑒定出不同種類的兔球蟲。目前，有關(guān)貴州省內(nèi)兔球蟲感染情況的研究較少。因此，對道真仡佬族苗族自治縣2個兔場兔球蟲感染情況和感染種類進(jìn)行調(diào)查，以期為當(dāng)?shù)赝们蛳x病防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 兔糞便樣品 來自于道真2 個不同兔場，分別位于平模鎮(zhèn)順河村、隆興鎮(zhèn)前進(jìn)村，共77 份兔糞便。按照兔只存欄數(shù)5%的比例隨機采集1～3月齡、3～6月齡和6月齡以上兔群新鮮糞便，每份糞便20 g 左右，每采1 份樣品更換1次手套，裝入潔凈的一次性自封袋內(nèi)，標(biāo)記后帶回實驗室，置于4℃保存待檢。

1.1.2 試劑 氯化鈉（分析純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；糞便基因組DNA 提取試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker均購自Takara公司。

1.1.3 主要儀器 生物顯微鏡（上海滬譽儀器有限公司）；PCR 儀（杭州柏恒科技有限公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳凝膠成像儀（成都錦世昌祥科技有限公司）；麥?zhǔn)舷x卵計數(shù)板（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海寄生蟲病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 兔球蟲感染率及感染強度 稱取兔糞便2 g，放入50 mL 燒杯中，加入適量水?dāng)噭颍?jīng)80 目網(wǎng)篩過濾，用少量水沖洗3～5 次濾網(wǎng)，將濾液轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管，2 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，加入少量飽和鹽水溶液將沉淀物攪勻，全部轉(zhuǎn)入比色管，加飽和鹽水至60 mL 處，靜置10 min，用移液槍吸取液面糞液，注滿麥?zhǔn)舷x卵計數(shù)板的2個計數(shù)室，將計數(shù)板置于顯微鏡的載物臺上靜置5 min 后在低倍（10×10）顯微鏡下觀察球蟲卵囊情況，計算球蟲感染率及感染強度。每克糞便卵囊數(shù)（OPG）=2 個計數(shù)室中卵囊數(shù)的平均數(shù)×200。兔球蟲感染強度判定標(biāo)準(zhǔn)：OPG＞10×104為嚴(yán)重感染；1×104≤OPG≤10×104為中度感染；OPG＜1×104為輕度感染。

1.2.2 兔球蟲感染種類 每個兔場取4 份兔球蟲陽性糞便樣品進(jìn)行PCR 測定，樣本1～4來自順河村兔場，樣本5～8來自前進(jìn)村兔場。

1）糞便基因組DNA 提取。使用糞便基因組DNA 提取試劑盒對兔球蟲陽性糞便進(jìn)行總DNA 提取，具體提取過程參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書。

2）PCR 擴增。根據(jù)GenBank 中公布的5 種兔艾美耳球蟲參考蟲株的基因序列，分別設(shè)計1對特異性引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物信息見表1。以提取的總DNA 為模板，利用設(shè)計的特異性引物，構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系50 μL 進(jìn)行PCR 擴增（每個反應(yīng)均添加陽性和陰性對照樣品），PCR 產(chǎn)物在含Goldview 的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

表1 兔艾美耳球蟲PCR擴增引物信息

3）目的基因測序及分析。PCR 檢測為陽性的基因片段送至上海生工生物公司進(jìn)行測序，所得堿基序列上傳NCBI進(jìn)行同源性比對，根據(jù)序列核苷酸同源性鑒定艾美耳球蟲的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔球蟲感染情況

經(jīng)飽和鹽水漂浮法和顯微鏡觀察，77 份兔糞便中有55 份檢出兔球蟲卵囊，總感染率為71.4%，感染強度為中度感染，調(diào)查的2 個兔場均不同程度感染球蟲，感染具體情況見表2。不同年齡段兔感染球蟲情況如表3 所示，1～3月齡幼兔感染率最高，達(dá)96.9%，且多呈中度或重度感染。

表2 不同兔場兔球蟲感染情況

表3 不同年齡段兔感染球蟲情況

2.2 目的基因PCR擴增結(jié)果

從圖1～5 可知，PCR 擴增產(chǎn)物電泳后，穿孔艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲均與預(yù)期的球蟲基因大小一致，而腸艾美耳球蟲和小型艾美耳球蟲均無條帶出現(xiàn)，表明感染的兔球蟲是穿孔艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲。

圖1 兔場穿孔艾美耳球蟲檢測結(jié)果

圖2 兔場維氏艾美耳球蟲檢測結(jié)果

圖3 兔場小型艾美耳球蟲檢測結(jié)果

圖4 兔場腸艾美耳球蟲檢測結(jié)果

圖5 兔場大型艾美耳球蟲檢測結(jié)果

2.3 目的基因序列測定與分析結(jié)果

對所得堿基序列上傳NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果表明，感染的兔球蟲是穿孔艾美爾球蟲、維氏艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲。將試驗分離到的艾美耳球蟲蟲株分別命名為DZ-E.perforans、DZ-E.vejdovskyi、DZ-E.magna，并與艾美耳球蟲參考蟲株進(jìn)行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示，DZ-E.perforans與國內(nèi)外E.perforans蟲株同源性最高，為97.8%～99.8%，DZ-E.vejdovskyi與國內(nèi)外E.vejdovskyi蟲株同源性最高，為93.3%～94.7%，DZ-E.magna與國內(nèi)外E.magna蟲株同源性最高，為98.7%～99.0%。

3 小結(jié)與討論

目前，兔球蟲病是兔場最常見的寄生蟲病，在規(guī)?；脠龊蜕B(yǎng)戶均普遍存在。穆貞軍等[8]調(diào)查貴陽市花溪區(qū)5 個兔場，兔球蟲總感染率為81%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，道真兔場兔球蟲總感染率為71.4%，感染率較高。道真縣1～3月齡兔球蟲總感染率為96.9%，明顯高于其他年齡段兔，與歐陽昌勇等[9-10]的研究即兔球蟲可感染不同年齡段兔，以斷奶至3月齡兔感染率最高的結(jié)果一致。鑒定出大型艾美耳球蟲、穿孔艾美耳球蟲和維氏艾美耳球蟲，這與陳紅等[11]的研究即甘肅省5 個不同兔場鑒定出的3種優(yōu)勢蟲種結(jié)果一致。

兔球蟲病是養(yǎng)兔業(yè)中危害比較嚴(yán)重的一種兔病，對該病的防控需科學(xué)合理的藥物防治，并結(jié)合飼養(yǎng)管理和有效的衛(wèi)生消毒措施。一是加強飼養(yǎng)管理，飼喂?fàn)I養(yǎng)成分均衡的飼料，增強兔群抵抗力，注意兔場衛(wèi)生，糞便無害化處理，定期使用火焰消毒和消毒劑消毒；二是定期監(jiān)測兔場球蟲感染情況，根據(jù)感染情況變化科學(xué)合理用藥，同時根據(jù)季節(jié)性的發(fā)生特征調(diào)整用藥方案，在該病易爆發(fā)的季節(jié)可適當(dāng)加大藥物的預(yù)防劑量；三是做好病兔隔離治療，及時徹底消毒。必要時為迅速撲滅疫病，可撲殺病兔。在實際生產(chǎn)中，很難做到徹底清除兔場內(nèi)的球蟲卵囊，但通過改善兔場內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件、加強飼養(yǎng)管理和藥物防治等措施盡可能降低兔群中球蟲卵囊的數(shù)量，可很大程度上減少兔球蟲病的發(fā)生，且兔群接受低劑量球蟲卵囊感染可激發(fā)兔群產(chǎn)生免疫保護(hù)力。