譚秋芬，胡惠軍

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院,廣東惠州 516002

乳腺癌在臨床中較為常見，是一種乳腺組織惡性腫瘤，主要是致癌因子作用于乳腺上皮導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[1-2]。乳腺癌發(fā)病的性別差異性顯著，絕大多數(shù)乳腺癌患者為女性，患者發(fā)病早期多表現(xiàn)為乳頭溢液、乳房腫塊等，病情發(fā)展至晚期會(huì)出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況，對(duì)患者生命造成威脅[3]。研究顯示，瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶-1(FEN1)是一種抑癌基因，若FEN1突變，會(huì)導(dǎo)致其修復(fù)和復(fù)制功能改變，誘發(fā)乳腺癌[4]；轉(zhuǎn)錄因子Ⅱⅰ假基因23(GTF2IP23)是一個(gè)多功能轉(zhuǎn)錄因子，參與生物發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，介導(dǎo)惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[5]；賴氨酸特異性去甲基化酶4A(KDM4A)被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于許多種類的癌癥中，可作為潛在的腫瘤治療的靶標(biāo)[6]。本研究中對(duì)乳腺癌患者癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探究三者在乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院于2020年7月至2021年8月進(jìn)行手術(shù)的女性乳腺癌患者72例，年齡35～60歲，平均(47.5±9.8)歲，其中包括更年期患者51例，非更年期期患者21例；腫瘤直徑≤3 cm患者38例，腫瘤直徑>3 cm患者34例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者37例；無脈管侵犯患者40例，有脈管侵犯患者32例；病理分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期患者7例，Ⅳ期患者2例；癌組織分化程度：高分化32例，中分化29例，低分化11例。另選取本院同期進(jìn)行手術(shù)的女性乳腺良性腫瘤患者70例，年齡36～58歲，平均(46.9±8.8)歲。本研究所有患者均知情同意并簽署知情同意書，獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有乳腺癌患者均符合中國(guó)抗癌學(xué)會(huì)對(duì)乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)均為首次確診；(3)未接受過相關(guān)治療；(4)良性乳腺腫瘤患者經(jīng)本院病理檢查確診為良性腫瘤；(5)所有患者均接受手術(shù)治療；(6)病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)凝血障礙者；(2)處于妊娠期或哺乳期的女性；(3)近1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過重大手術(shù)者；(4)心腦血管疾病患者；(5)精神系統(tǒng)疾病患者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 收集乳腺癌患者手術(shù)切除癌組織、距癌組織5 cm癌旁組織標(biāo)本及乳腺良性腫瘤患者腫瘤病理組織，將所取病理組織分成4 mm×4 mm大小標(biāo)本并清洗3次，在甲醛溶液中浸泡、固定，進(jìn)行脫水，處理后石蠟包埋，之后連續(xù)切片(厚度3 μm)做免疫組化標(biāo)記。

1.2.2免疫組化染色 取制備好的乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤病理組織標(biāo)本，脫蠟后清洗3次，使用檸檬酸修復(fù)液(100 ℃)浸泡15 min后取出靜置冷卻，以PBS液清洗3次，添加POD阻斷劑后常溫環(huán)境下孵育30 min后再次以PBS液清洗3次，滴加山羊血清封閉，30 min后吸出封閉液、添加一抗，稀釋至1∶2 000過夜保存。次日取出后使用PBS液清洗3次，添加二抗，稀釋至1∶5 000并完全覆蓋30 min，使用PBS液清洗3次之后添加DAB液，顯微鏡觀察，蘇木精染核，反藍(lán)、脫水處理后封片。一抗：兔抗人FN1單克隆抗體、兔抗人GTF2IP23單克隆抗體購(gòu)自Millipore公司，兔抗人KDM4A單克隆抗體購(gòu)自Signalway Antibody(SAB)抗體公司。二抗：驢抗兔FITC(波長(zhǎng)492～520 nm)購(gòu)自Millipore公司。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)FEN1表達(dá) Trizol法提取總RNA并測(cè)試完整性，以18S RNA為內(nèi)參，其上游引物序列為：5′-CCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-CGCCCGCCCGCTCCCAAGAT-3′；FEN1上游引物序列為：5′-AAGGTCACTAAGCAGCACAAT-3′，下游引物序列為：5′-GTAGCCGCAGCATAGACTTTG-3′,反轉(zhuǎn)錄處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性處理10 min；變性處理95 ℃ 10 s，退火63 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 10 s，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt方法計(jì)算FEN1相對(duì)表達(dá)水平。儀器使用ABI7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀[購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司]，F(xiàn)EN1抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；所有操作均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4Western blot法檢測(cè)GTF2IP23、KDM4A表達(dá) 取待測(cè)標(biāo)本，添加裂解液進(jìn)行處理后取50 μg蛋白，煮至蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜處理后添加Western封閉液封閉3 h，添加一抗(1∶2 000)后4～6 ℃過夜孵育。次日使用Western液清洗后添加二抗(1∶5 000)孵育2 h，之后使用Western液進(jìn)行清洗后進(jìn)行顯色、曝光、成像，檢測(cè)條帶灰度值，檢測(cè)GTF2IP23、KDM4A相對(duì)表達(dá)水平。儀器使用電化學(xué)發(fā)光儀(購(gòu)自上海啟步生物科技有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)差異性分析 良性腫瘤組織、乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1～3。

表1 各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)水平比較

圖2 GTF2IP23表達(dá)免疫組化染色圖(×400)

圖3 KDM4A表達(dá)免疫組化染色圖(×400)

2.2乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 與非更年期、腫瘤直徑≤3 cm、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無脈管侵犯及高、中分化患者相比，更年期、腫瘤直徑>3 cm、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及低分化患者FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)相關(guān)性 乳腺癌組織中FEN1與GTF2IP23、KDM4A表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.404、0.553，均P=0.001)；乳腺癌組織中GTF2IP23與KDM4A表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.582，P=0.001)。見圖4。

圖4 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達(dá)相關(guān)性

2.4FEN1、GTF2IP23、KDM4A對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 與單項(xiàng)檢測(cè)相比，3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度提高，特異度輕微降低，但曲線下面積(AUC)為0.899，大于FEN1、GTF2IP23、KDM4A單項(xiàng)診斷(0.691、0.659、0.708)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖5。

表3 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖5 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線圖

3 討 論

乳腺癌多發(fā)生在機(jī)體乳腺上皮組織中，而在人體生命活動(dòng)中，乳腺組織的作用并不十分重要，因此乳腺組織切除對(duì)乳腺癌的治療效果比較理想[8-10]。乳腺癌患者若不及時(shí)治療，病情發(fā)展至晚期，癌細(xì)胞向全身擴(kuò)散，會(huì)對(duì)患者生命造成威脅。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有多種，包括遺傳因素、基因突變、機(jī)體免疫功能下降、神經(jīng)功能異常等，其中基因突變是乳腺癌發(fā)病的最主要因素，且腫瘤形成是一個(gè)涉及多基因、多步驟、長(zhǎng)期的復(fù)雜過程，多種因素相互影響。因此許多專家學(xué)者通過分子生物學(xué)、病理研究等研究途徑對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制、診療靶點(diǎn)進(jìn)行研究，對(duì)乳腺癌的診治進(jìn)行不斷探索[11-13]。

FEN1是一種金屬核酸酶，具有結(jié)構(gòu)特異性的特點(diǎn)，并且具有核酸外切酶、缺口核酸內(nèi)切酶活性，能維持基因組完整、穩(wěn)定。有研究指出，F(xiàn)EN1功能喪失將會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥疾病及自身免疫疾病的誘發(fā)，并且在癌組織發(fā)展進(jìn)程中起重要作用[14]。有研究表示，F(xiàn)EN1在口腔癌、肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤中有著異常的表達(dá)，其變化與癌細(xì)胞增殖能力變化相關(guān)，但其在乳腺癌組織中的研究還相對(duì)較少[15-16]。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中FEN1表達(dá)相對(duì)較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，F(xiàn)EN1表達(dá)也逐漸升高，因此本研究認(rèn)為FEN1在乳腺癌中高表達(dá)，可能參與乳腺癌的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，處于恰當(dāng)水平上的FEN1可通過DNA修復(fù)及抑制乳腺癌的基因突變，以保持基因組的穩(wěn)定性。另外過表達(dá)的FEN1與ER結(jié)合影響了雌激素應(yīng)答基因的表達(dá)，從而加速了乳腺癌進(jìn)程。說明FEN1表達(dá)變化與乳腺癌患者病理特征、病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，由此可以推測(cè)出FEN1可能作為乳腺癌診斷、治療的靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床。

GTF2IP23為GTF2I家族的重要組成成員，GTF2IP23在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)等生物學(xué)行為上有重要作用。有研究表示，GTF2IP23能夠激活PI3K/AKT/MAPK通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的不斷增殖分化與侵襲，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[17-18]。GTF2IP23在肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均異常表達(dá)。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中GTF2IP23表達(dá)相對(duì)較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中GTF2IP23表達(dá)也逐漸升高。GTF2IP23屬于GTF2I的假基因，在乳腺癌中的表達(dá)最為顯著，而假基因通過抑制其母基因的表達(dá)，調(diào)控靶基因，促使乳腺組織癌變；并通過RNA結(jié)合蛋白或其他翻譯相關(guān)機(jī)制調(diào)控RNA表達(dá)或蛋白翻譯，致使蛋白變性、癌細(xì)胞增殖，加重乳腺癌病變程度。因此本研究推測(cè)GTF2IP23可能為乳腺癌發(fā)展演進(jìn)的重要靶點(diǎn)，檢測(cè)GTF2IP23表達(dá)對(duì)乳腺癌診斷、治療具有重要意義。

KDM4A是KDM4家族的一種重要的去甲基酶，具有一定的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[19]。有研究表示，KDM4A在結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，其異常高表達(dá)具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、分化、遷移的作用，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[20-21]。本研究說明，KDM4A在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中KDM4A表達(dá)也逐漸升高。KDM4A具有蛋白結(jié)合和去甲基酶活性兩種功能，可以與抑癌基因啟動(dòng)子結(jié)合，負(fù)性調(diào)控癌癥因子轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑癌功能，此時(shí)KDM4A升高，導(dǎo)致特異性蛋白1基因沉默，促使腫瘤轉(zhuǎn)移。KDM4A表達(dá)變化與乳腺癌病理特征具有密切聯(lián)系，因此本研究推測(cè)KDM4A可能為調(diào)控乳腺癌進(jìn)展的重要分子。

本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的靈敏度提高，特異度降低，說明三者可能共同參與乳腺癌的發(fā)展演進(jìn)過程，與乳腺癌疾病相關(guān)，且認(rèn)為三者線性相關(guān)，推測(cè)三者可能由于共同作用而誘導(dǎo)疾病的發(fā)生，對(duì)乳腺癌患者預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中均呈異常高表達(dá)，與乳腺癌患者病理特征密切相關(guān)，且三者表達(dá)具有一定相關(guān)性，F(xiàn)EN1、GTF2IP23、KDM4A水平三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌患者預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，但本文樣本例數(shù)較少，且并未分析三者之間相互作用的機(jī)制，研究存在一定的局限性，因此還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析。