張乃丹，劉利洪，孫家祥，袁成良

德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川德陽 618000

干燥綜合征(SS)也稱為自身免疫性外分泌疾病，口干和眼干是SS的主要臨床表現(xiàn)。根據(jù)病因是否明確通常將該病分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種發(fā)病率較高的自身免疫性疾病，由于起病隱匿，在早期診斷方面存在困難。目前臨床治療主要以替代治療和緩解癥狀為主。關(guān)于pSS的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，其中遺傳背景和免疫因素被認(rèn)為是pSS發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)[1-2]。表觀遺傳學(xué)是研究基因表達(dá)可遺傳變化的一門學(xué)科，其特點(diǎn)為DNA序列不發(fā)生變化。表觀遺傳學(xué)機(jī)制通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)在pSS的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子(CRs)是表觀遺傳學(xué)中不可或缺的上游調(diào)控因子，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑3大類。已有研究提示，基因突變可以干擾CRs的功能，CRs功能失調(diào)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常并出現(xiàn)與致病相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變，最終導(dǎo)致疾病預(yù)后不佳[4]。隨著對(duì)免疫病理機(jī)制的深入研究，免疫浸潤及細(xì)胞異質(zhì)性在pSS中的研究越來越受到學(xué)者的關(guān)注。為了進(jìn)一步研究CRs與pSS免疫浸潤特征的關(guān)系，本課題組嘗試從差異表達(dá)基因(DEGs)和免疫浸潤的角度進(jìn)行研究，可能有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)和診斷pSS的潛在生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 從GEO數(shù)據(jù)庫下載了3個(gè)包含pSS患者和健康對(duì)照者唾液腺基因表達(dá)陣列的數(shù)據(jù)集，分別是GSE7451、GSE23117和GSE40611。其中GSE7451包含10例pSS患者和10例健康對(duì)照者唾液腺樣本；GSE23117包含11例pSS患者和4例健康對(duì)照者唾液腺樣本；GSE40611包含17例pSS患者、14例非pSS患者和18例健康對(duì)照者唾液腺樣本。本研究最終納入38例pSS患者作為pSS組，32例健康對(duì)照者作為對(duì)照組，14例非pSS患者被排除。

1.2方法

1.2.1篩選DEGs 對(duì)所有納入研究的基因表達(dá)陣列采用R語言(版本號(hào)4.0.3)進(jìn)行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)合并、歸一化和log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，最終得到22 189個(gè)基因的表達(dá)情況。當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一基因時(shí)，取其平均值作為表達(dá)值。本研究采用代理變量分析(SVA)程序包消除批量效應(yīng)。通過查閱已有文獻(xiàn)，共收集了870個(gè)CRs相關(guān)基因的信息，并將P<0.05和|log2FC|>0.50設(shè)為篩選DEGs的條件，F(xiàn)C為倍數(shù)改變。采用LIMMA程序包篩選CRs相關(guān)的DEGs[5]。

1.2.2基因本體論(GO)對(duì)DEGs的富集分析 本研究使用enrichment plot程序包對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析。GO富集分析將分別從生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3方面進(jìn)行分析。使用barplot程序包繪制條形圖。對(duì)于差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)，展示前4條分析結(jié)果；對(duì)于差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果不進(jìn)行展示。

1.2.3免疫細(xì)胞和免疫功能的相關(guān)性分析 為了評(píng)估pSS患者唾液腺免疫微環(huán)境的變化情況，采用基因集變異分析(GSVA)計(jì)算出上述3個(gè)唾液腺基因表達(dá)陣列中共22 189個(gè)基因的變異分?jǐn)?shù)。通過GSEA官網(wǎng)下載并整理了與16種免疫細(xì)胞與13種免疫功能相關(guān)的基因集。采用ssGSEA算法分析上述2個(gè)數(shù)據(jù)集并取交集，計(jì)算免疫浸潤評(píng)分，比較對(duì)照組與pSS組免疫細(xì)胞和免疫功能的評(píng)分差異。采用corrplot程序包分別分析16種免疫細(xì)胞與13種免疫功能的相關(guān)性并繪制相關(guān)性熱圖。采用相關(guān)系數(shù)來評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞與免疫功能的相關(guān)性，分為極強(qiáng)相關(guān)、強(qiáng)相關(guān)、中等相關(guān)、弱相關(guān)和極弱相關(guān)。16種免疫細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞(DCs)、活化的樹突狀細(xì)胞(aDCs)、未成熟樹突狀細(xì)胞(iDCs)、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)、B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、細(xì)胞毒性(CD8+)T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)、1型輔助性T細(xì)胞(Th1)、2型輔助性T細(xì)胞(Th2)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。13種免疫功能包括抗原提呈細(xì)胞(APC)共抑制、APC共刺激、CC趨化因子受體(CCR)、免疫檢查點(diǎn)、細(xì)胞殺傷活性、T細(xì)胞共抑制和共刺激、人白細(xì)胞抗原(HLA)、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC Ⅰ類)、炎癥反應(yīng)、副炎癥反應(yīng)、Ⅰ型和Ⅱ型干擾素反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1DEGs篩選 本研究共篩選出11個(gè)與CRs相關(guān)的DEGs，其中10個(gè)基因上調(diào)，1個(gè)基因下調(diào)。上調(diào)居前5位的DEGs分別是干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列蛋白3、載脂蛋白B MRNA編輯酶催化亞基3G(APOBEC3G)、SP110、E2泛素結(jié)合酶家族D1(UBE2D1)和SMCHD1，下調(diào)基因?yàn)镋YA3，差異表達(dá)的火山圖見圖1。

注：綠色表示顯著下調(diào)(P<0.05)，黑色代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅色表示顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.2GO富集分析在DEGs中的應(yīng)用 對(duì)篩選出的11個(gè)DEGs進(jìn)行GO分析，找出DEGs頻率最高的4種生物學(xué)過程，包括正向調(diào)控DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)DNA損傷刺激反應(yīng)、非同源端連接修復(fù)雙鏈DNA和DNA修復(fù)。細(xì)胞組分功能富集前4位依次為性染色體、PML核體、染色體端粒和核心蛋白復(fù)合體。分子功能由于未富集到DEGs，暫無數(shù)據(jù)展示。

2.3免疫浸潤評(píng)分及相關(guān)性分析 本研究采用ssGSEA算法，共獲得了16種免疫細(xì)胞和13種免疫功能的免疫浸潤評(píng)分。在16種免疫細(xì)胞中，免疫浸潤評(píng)分相關(guān)性排前5位的組合分別為TIL和B細(xì)胞(r=0.90,P<0.001)、Tfh和TIL(r=0.72,P<0.001)、B細(xì)胞和Tfh(r=0.70,P<0.001)、pDCs和TIL(r=0.69,P<0.001)、Treg和TIL(r=0.68,P<0.001)。在13種免疫功能中，免疫浸潤評(píng)分相關(guān)性排前5位的組合分別為免疫檢查點(diǎn)和T細(xì)胞共刺激(r=0.92,P<0.001)、免疫檢查點(diǎn)和CCR(r=0.89,P<0.001)、免疫檢查點(diǎn)和T細(xì)胞共抑制(r=0.88,P<0.001)、CCR和T細(xì)胞共刺激(r=0.86,P<0.001)、CCR和T細(xì)胞共抑制(r=0.82,P<0.001)。見圖2。

注：A為免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析；B為免疫功能的相關(guān)性分析；方格內(nèi)數(shù)字代表相關(guān)系數(shù)，紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)。

2.4對(duì)照組與pSS組的免疫浸潤評(píng)分比較 對(duì)pSS組和對(duì)照組分別進(jìn)行了免疫細(xì)胞和免疫功能的免疫浸潤評(píng)分差異分析。16種免疫細(xì)胞中，9種免疫細(xì)胞的免疫浸潤評(píng)分(pSS組vs.對(duì)照組)顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為aDCs、中性粒細(xì)胞、pDCs、TIL、Treg、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和Th2細(xì)胞。在13種免疫功能中，8種免疫功能顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為HLA、炎癥反應(yīng)、MHCⅠ類分子、副炎癥反應(yīng)、Ⅰ型干擾素反應(yīng)、APC共抑制、CD8+T細(xì)胞殺傷活性和T細(xì)胞共抑制。見圖3。

注：A為免疫細(xì)胞的免疫浸潤評(píng)分；B為免疫功能的免疫浸潤評(píng)分；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

pSS是一種以特異性病理損害為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。早期對(duì)pSS相關(guān)的DEGs研究主要集中在與信號(hào)通路的相關(guān)性分析、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)等方面[5-7]。從DEGs中篩選CRs相關(guān)基因并從免疫浸潤的角度來進(jìn)行的研究比較少見。本研究結(jié)果顯示，在pSS患者唾液腺中，與CRs相關(guān)的DEGs以表達(dá)上調(diào)為主，表達(dá)下調(diào)的DEGs較少。干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列蛋白3(IFIT3)是一種蛋白編碼基因，在干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要的作用。高表達(dá)IFIT3通過線粒體抗病毒信號(hào)途徑(MAVS)和干擾素基因刺激物途徑(STING)介導(dǎo)TANK結(jié)合激酶1(TBK1)活化，促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)從胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，導(dǎo)致Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[8]。Ⅰ型IFN與其受體結(jié)合，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)磷酸化，促進(jìn)干擾素誘導(dǎo)基因(ISGs)的表達(dá)[9]。已有研究通過靶向TBK1抑制劑治療pSS后發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型IFN陽性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)表達(dá)的IFIT3較陰性患者顯著降低[10]。上述研究提示，IFIT3在Ⅰ型IFN信號(hào)通路調(diào)節(jié)中具有重要作用。本研究結(jié)果提示，與健康對(duì)照者相比，pSS患者Ⅰ型干擾素反應(yīng)免疫浸潤評(píng)分顯著升高，提示IFIT3基因可能在pSS患者唾液腺損害中具有一定的作用。

APOBEC3G屬于APOBEC3家族，具有催化RNA和單鏈DNA的位點(diǎn)特異性脫氨基的作用。APOBEC3通過基因突變，導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞周期停滯，在IFN刺激下，APOBEC3相關(guān)蛋白在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，出現(xiàn)高水平的循環(huán)DNA，加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。本研究通過對(duì)pSS患者唾液腺免疫浸潤的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在pSS患者中顯著升高，同時(shí)炎癥反應(yīng)也顯著高于健康對(duì)照者，這與已有研究結(jié)果一致。SP110基因是SP110核蛋白的編碼基因，SP110核蛋白可作為基因轉(zhuǎn)錄的激活劑，在核糖體產(chǎn)生和誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化中發(fā)揮了重要作用[12]。UBE2D1通過與E1泛素激活酶和E3泛素蛋白連接酶相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。已有研究提示，UBE2D1與pSS患者抗Ro52抗體的E3泛素蛋白連接酶活性有關(guān)[13]。目前暫無關(guān)于SMCHD1基因在pSS中的相關(guān)研究，由于本研究納入的樣本量偏少，關(guān)于CRs相關(guān)基因在pSS中的篩選還需要納入更多樣本，進(jìn)行多中心的驗(yàn)證。

關(guān)于免疫微環(huán)境在pSS發(fā)生發(fā)展中的研究越來越受到學(xué)者重視。本研究采用ssGSEA算法將免疫細(xì)胞浸潤評(píng)分?jǐn)U展到16種常見的免疫細(xì)胞，并增加了13種免疫功能分析。結(jié)果顯示，在pSS患者中存在免疫微環(huán)境的異?；罨⑶耶惓；罨亩喾N免疫細(xì)胞和免疫功能評(píng)分均顯著高于健康對(duì)照者(P<0.05)。這些免疫浸潤模式可能為pSS免疫治療提供重要線索。首先，本課題組研究了這些具有顯著性差異的免疫細(xì)胞之間以及免疫功能之間是否具有一定的相關(guān)性，這是一個(gè)創(chuàng)新的嘗試，以便更全面了解pSS患者免疫微環(huán)境的特點(diǎn)。在16種免疫細(xì)胞中，相關(guān)性較強(qiáng)的為TIL和B細(xì)胞，其次為Tfh和TIL。TIL主要由CD8+T淋巴細(xì)胞和三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)的B細(xì)胞組成，并能夠產(chǎn)生Tfh細(xì)胞。功能實(shí)驗(yàn)提示活化的Tfh是激活TLS內(nèi)免疫球蛋白和IFN-γ產(chǎn)生的重要因素[14]。Tfh在維持B細(xì)胞生存和分化過程中具有重要作用，在高度局灶性淋巴細(xì)胞性唾液腺炎的pSS患者中，循環(huán)Tfh細(xì)胞的CCR7loPD-1hi亞群增加，并與ESSDAI疾病活動(dòng)度評(píng)分和活化的B細(xì)胞顯著相關(guān)[15]。而在13種常見的免疫功能中，相關(guān)性較強(qiáng)的為免疫檢查點(diǎn)和T細(xì)胞共刺激、免疫檢查點(diǎn)和CCR。已有研究提示，通過對(duì)骨肉瘤患者相關(guān)免疫功能，包括APC共抑制、CCR、免疫檢查點(diǎn)與T細(xì)胞共刺激等進(jìn)行評(píng)分，有助于預(yù)測(cè)患者對(duì)放療的反應(yīng)性和總體存活率[16]。目前關(guān)于免疫功能評(píng)分在pSS患者治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后中的研究較少，因此本課題組也進(jìn)一步比較了pSS患者與對(duì)照組免疫浸潤評(píng)分的差異。本研究發(fā)現(xiàn)pSS患者有多種免疫細(xì)胞，包括aDCs、巨噬細(xì)胞、Treg、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、Tfh和TIL，以及多種免疫功能，包括MHC Ⅰ類、HLA、Ⅰ型IFN反應(yīng)、副炎癥反應(yīng)等顯著高于健康對(duì)照者。已有研究發(fā)現(xiàn)，在pSS患者中，記憶B細(xì)胞、Tregs和aDCs的比例顯著升高，并可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者唾液中干擾誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)顯著升高，并與臨床口腔表現(xiàn)的嚴(yán)重程度有關(guān)，提示巨噬細(xì)胞和先天免疫在pSS發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[18]。對(duì)CD8+T細(xì)胞的研究提示，pSS模型中浸潤性CD8+T細(xì)胞明顯多于CD4+T細(xì)胞，減少CD8+T細(xì)胞的浸潤可有效減少對(duì)唾液腺的破壞[19]。此外，通過對(duì)pSS患者唾液腺中Tfh亞群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Tfh1、Tfh2和Tfh17細(xì)胞在pSS患者唾液腺樣本中百分比較高，抗Ro/SSA抗體與Tfh17亞群呈正相關(guān)，并且(Tfh2+Tfh17)/Tfh顯著高于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，提示pSS與系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有差異性的Tfh譜[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)的異?；罨拿庖吖δ芘c以往文獻(xiàn)報(bào)道不盡一致[17-20]。一項(xiàng)使用微陣列分析唾液腺中基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者基因表達(dá)模式涉及多種慢性炎癥通路，包括趨化因子、細(xì)胞因子、MHC和IFN[21]。與以往研究不同的是，本研究還發(fā)現(xiàn)免疫功能中的副炎癥反應(yīng)的免疫浸潤評(píng)分顯著上調(diào)。在腫瘤細(xì)胞系中，副炎癥反應(yīng)具有某些正常巨噬細(xì)胞的功能，它可以根據(jù)腫瘤的需要模擬不同的免疫亞群。此外，本研究中巨噬細(xì)胞的免疫浸潤評(píng)分也顯著上調(diào)，提示未來對(duì)副炎癥反應(yīng)的研究也可能為pSS的治療提供重要線索。

本研究存在一定的局限性。因?yàn)楸菊n題組主要關(guān)注的是目前文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道過的CRs相關(guān)基因在pSS中與免疫浸潤的關(guān)系，可能忽略了目前文獻(xiàn)尚未報(bào)道的基因。其次，本研究納入的樣本量較少，對(duì)免疫浸潤評(píng)分未進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，在今后的研究中，還將對(duì)上述CRs相關(guān)基因進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，以明確CRs在pSS致病過程中的作用。

綜上所述，CRs相關(guān)基因雖然在pSS患者唾液腺中的DEGs數(shù)量較少，但是與受損唾液腺的免疫浸潤異常有關(guān)，值得臨床醫(yī)生的關(guān)注。