孫小涵，田彥梅，顧 欣 ，劉文輝，趙 巖，楊 娜

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

西瓜枯萎病是西瓜的重要土傳病害，病原菌是尖鐮孢菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON)。發(fā)病初期，植株萎蔫；發(fā)病后期，根部腐爛，整株枯死[1]。該病害對生產(chǎn)危害性大，可造成瓜田連片發(fā)病甚至絕收，且病原菌在土壤存活期長，對西瓜栽種具有持續(xù)性影響[2]。因此，有效防控枯萎病對保障西瓜生產(chǎn)具有重要 意義。

生物防控方法因?qū)Νh(huán)境友好，成為當(dāng)前土傳病害防控的主要研究方向，高效生防菌的獲得成為關(guān)鍵。木霉屬(Trichodermaspp.)真菌種類豐富、分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)性強，有廣譜抗性，成為應(yīng)用最廣泛的生防真菌之一[3]。據(jù)報道，對致病性尖鐮孢菌具有生防作用的木霉有哈茨木霉(Tharzianum)[4]、綠色木霉(T.viride)[5]、長枝木霉(T.longibrachiatum)[6]和康氏木霉(T.koningii)[7]等，抑菌機制涉及競爭作用、重寄生作用、抗生作用和誘導(dǎo)抗性作用等[8]。其中空間和營養(yǎng)競爭作用是木霉菌迅速形成根際生態(tài)優(yōu)勢、發(fā)揮抑菌作用的重要基礎(chǔ)[9]。因此，分離篩選具有強競爭優(yōu)勢、能發(fā)揮高效生防作用的木霉菌株很有必要。

西瓜枯萎病在酸性和堿性土壤中均有發(fā)生，連作田中發(fā)病率更高[10]。研究表明，F(xiàn)ON和木霉的生長均受環(huán)境pH的影響[11-12]。室內(nèi)培養(yǎng)條件下，F(xiàn)ON和木霉的最適生長pH范圍分別為 4～9[13]和5.5～7.5[14]。土壤pH過高可導(dǎo)致FON和木霉的數(shù)量減少[15-16]。因此，環(huán)境pH直接影響生防木霉的防控效果。對羥基苯甲酸 (p-hydroxybenzoic acid，PHBA)是西瓜、水稻、甜瓜等多種作物根分泌物的重要組分[17-18]。西瓜連作可導(dǎo)致土壤中根分泌物積累，而對土壤微生物產(chǎn)生影響。研究表明，PHBA對FON的產(chǎn)孢、萌發(fā)及菌絲生長均具有“低濃度促進、高濃度抑制”作用[19]。ZHOU等[20]從營養(yǎng)角度探討土壤中添加PHBA等有機物對木霉的影響，認(rèn)為少量PHBA有提高土壤中木霉豐度的趨勢。以上研究闡述了環(huán)境pH和PHBA對FON和木霉生長繁殖及拮抗效果的部分影響趨勢，然而PHBA積累和pH雙因素疊加對木霉生防效果的影響未見報道。

本研究對前期從寧夏西瓜根際土壤中分離的西瓜枯萎病生防木霉M3菌株進行鑒定，明確其分類地位；采用平板試驗和盆栽試驗，探明不同pH和PHBA質(zhì)量濃度下FON和M3菌株的生長情況，明確pH與PHBA共同作用下M3菌株對FON的抑菌率及防病效果的變化規(guī)律，為研制高效的西瓜枯萎病生防菌劑及其有效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種：M3菌株和FON由寧夏大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實驗室提供，分別從寧夏西瓜健康植株根際土壤和患病植株中分離獲得。其中，F(xiàn)ON經(jīng)回接試驗驗證其為西瓜枯萎病病原菌，M3菌株為其拮抗菌。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，用于菌種活化、對峙培養(yǎng)和菌種保藏；馬鈴薯葡萄糖(Potato dextrose，PDB)培養(yǎng)基，用于菌種液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。

西瓜品種：‘金城五號’。

盆栽土壤：寧夏興仁鎮(zhèn)西瓜田旁邊的非耕作土，取土深度距地表1～2 m，pH 8.3，過2 mm篩，備用。

1.2 方 法

1.2.1 M3菌株的分類鑒定 用PDA培養(yǎng)基 25 ℃，相對濕度65%倒置培養(yǎng)M3菌株，約6 d，菌絲長滿平板(直徑90 mm，下同)，轉(zhuǎn)接于新的PDA平板，25 ℃，RH 85%，12 h光照/12 h黑暗倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌株同心輪紋的有無、顏色及形態(tài)特征。鏡檢菌絲、孢子梗和孢子形態(tài)特征。鑒定依據(jù)為Rifai[21]和Bissett[22]修訂的木霉種群分類系統(tǒng)。

取活化4 d的M3菌落組織，用SDS法提取DNA[23]。以提取的DNA為模板，選用ITS(TCCTCCGCTTATTGATATGC)、延伸因子TEF1(CATCGAGAAGTTCGAGAAGG)、RPB2(TTGKAAAGAARCGTCTGGAT)[24]對M3菌株進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并凝膠成像，切膠回收DNA片段。純化的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序，獲得M3菌株ITS、TEF1和RPB2基因序列。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中木霉屬基因信息，通過MEGAX軟件比對并手工矯正，構(gòu)建M3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.2.2 pH和PHBA質(zhì)量濃度對FON和M3菌落生長的影響 采用兩因素多水平試驗。用過濾除菌的1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl將培養(yǎng)基pH分別調(diào)為5、6、7、8、9，添加PHBA使終質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg·L-1，共制備30種梯度培養(yǎng)基。一部分用于最終pH的檢測，其余制備梯度平板。在梯度平板中心打1個直徑5 mm的孔，放入直徑相同的M3或FON菌碟1個，28 ℃，RH 65%倒置培養(yǎng)60 h，測量菌落半徑。每個處理設(shè)5個重復(fù)。

1.2.3 pH和PHBA質(zhì)量濃度對M3菌株拮抗FON的影響 采用對峙培養(yǎng)試驗。梯度平板制備方法同“1.2.2”。在梯度平板上打2個直徑5 mm的孔，兩孔相距3.5 cm，各放入1個FON和M3菌碟，培養(yǎng)條件同“1.2.2”。測量FON菌落半徑，計算不同處理下M3菌株對FON的抑菌率。以不放M3菌碟為對照。每個處理設(shè)5個重復(fù)。抑菌率計算公式如下：

抑菌率=(對照FON菌株半徑-對峙培養(yǎng)FON菌株半徑)/對照FON菌株半徑×100%

1.2.4 土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度對M3拮抗FON的影響 采用盆栽試驗。將FON和M3菌株分別接種于PDB培養(yǎng)基，28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)5 d。血球計數(shù)板法檢測孢子數(shù)量。用無菌水制備FON孢子懸液，濃度為6.7×103mL-1，M3孢子懸液濃度為107mL-1、108mL-1和109mL-1。土壤經(jīng)121 ℃、30 min滅菌制成無菌土。用無菌 1 mol·L-1H2SO4和1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)土壤pH分別為5、6、7、8、9，隨后添加PHBA使土壤中PHBA質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg·L-1，混合均勻。FON孢子懸液和無菌土以1∶1(質(zhì)量比)混勻制成病菌土。M3孢子懸液和無菌土以1∶60(質(zhì)量比)混勻制成M3接種土。每個營養(yǎng)缽(口徑10 cm，底徑 6.5 cm，高10 cm)裝M3接種土300.0 g，均勻拌入病菌土3.0 g。每缽定植健康、1片真葉的西瓜幼苗1株。每7 d澆1次Hogland營養(yǎng)液4倍稀釋液，每次每缽200.0 mL。根據(jù)土壤濕度，2～3 d每缽澆無菌水300.0 mL。保持充足光照，溫度約20 ℃。每處理18株，培養(yǎng)30 d，記錄瓜苗發(fā)病等級，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

瓜苗發(fā)病等級標(biāo)準(zhǔn)：0級為莖內(nèi)維管束內(nèi)外無癥狀；1級為莖內(nèi)維管束變色部分<25%；2級為莖內(nèi)維管束變色部分25%～50%；3級為莖內(nèi)維管束變色部分50%～75%；4級為莖內(nèi)維管束變色部分>75%，部分葉片萎蔫；5級為整株萎蔫枯死。

發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果計算公式如下：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(病級株數(shù)×代表數(shù)值)/(調(diào)查發(fā)病總株數(shù)×最高級值)×100

防治效果=(對照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100%

1.3 處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并制作圖表。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和相關(guān)性分析，在P<0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 M3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株生長迅速，初為白色，卷毛狀菌絲。隨著培養(yǎng)時間增加，產(chǎn)孢簇逐漸變?yōu)榫G色，老熟時呈暗綠色；分生孢子梗瓶狀，較細(xì)且稍有彎曲，分枝呈輪狀排列，大多1～3輪，較短且無分枝(圖1-a，1-b)。分生孢子淺綠色，壁光滑，橢球形，(2.5～3.5) μm×(2.2～3.0) μm(圖1-c)。培養(yǎng)96 h，菌落出現(xiàn)墨綠色與白色相間的同心輪紋(圖1-d)，背面無色(圖1-e)。培養(yǎng)7 d的菌落呈墨綠色，表面氈毯狀，上有少量白色菌絲(圖1-f)。依據(jù)形態(tài)特征，初步鑒定M3菌株為哈茨木霉(T.harzianum)。

a、b.分生孢子梗；c.分生孢子；d.菌落正面(培養(yǎng)96 h)；e.菌落背面(培養(yǎng)96 h)；f.菌落正面(培養(yǎng)7 d)；標(biāo)尺為10 μm

2.2 M3菌株的分子生物學(xué)鑒定

將M3菌株ITS(登錄號JX473715)、TEF1(登錄號MT809679)及RPB2(登錄號MT809710)序列在NCBI中進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。M3菌株的ITS-TEF1-RPB2序列與哈茨木霉同源性達到100%。由此確定M3菌株為哈茨木霉。

圖2 基于M3菌株 ITS-TEF1-RPB2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. Phylogenetic tree of strain M3 based on ITS-TEF1-RPB2 sequence analysis

2.3 pH和PHBA質(zhì)量濃度對FON和M3菌落生長的影響

PDA培養(yǎng)基初始pH 6.4。添加PHBA后，培養(yǎng)基pH與初始值相比未發(fā)生變化或變化不顯著。因此，添加PHBA視為對培養(yǎng)基pH無影響。

如圖3，培養(yǎng)基pH和PHBA質(zhì)量濃度對FON和M3菌落生長具有不同影響。在PHBA質(zhì)量濃度相同時，F(xiàn)ON菌落半徑由大至小為pH 8>pH 7>pH 9>pH 6>pH 5，M3菌落為pH 6>pH 5>pH 7>pH 8>pH 9。兩菌株都存在最適生長pH，分別為8和6。當(dāng)pH相同時，隨著PHBA質(zhì)量濃度增加，兩菌的菌落半徑均呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象，但是菌落半徑峰值對應(yīng)的PHBA質(zhì)量濃度不同。50 mg·L-1處理的FON和M3菌落半徑較對應(yīng)的CK分別增加1.64%～2.45%和0.62%～1.19%，100 mg·L-1處理分別增加3.84%～4.13%和1.58%～2.20%，200 mg·L-1處理分別增加6.56%～7.81%和 3.23%～3.93%，400 mg·L-1處理分別增加 -3.76%～-2.52%和6.56%～7.64%，800 mg·L-1處理分別增加-12.89%～-7.14%和 -7.19%～-5.04%。FON菌落在PHBA 200 mg·L-1處理中生長最佳，高于或低于該值的處理，菌落半徑顯著降低，且pH 5～9時變化趨勢在各組內(nèi)表現(xiàn)一致。M3菌株也有類似規(guī)律，但是其菌落在400 mg·L-1處理中生長最佳。由此可知，F(xiàn)ON最適生長條件為pH 8，PHBA質(zhì)量濃度200 mg·L-1；M3菌株最適生長條件為pH 6，PHBA質(zhì)量濃度400 mg·L-1。說明M3菌株較FON更喜弱酸性環(huán)境，對PHBA積累環(huán)境的適應(yīng)能力強于FON。

a.FON菌落半徑；b.M3菌落半徑a.FON colony radius; b.M3 colony radius

單獨培養(yǎng)時，M3菌落的生長速度顯著高于FON。在M3菌株生長最適宜的pH 6、400 mg·L-1處理中，M3菌落半徑較FON多 127.11%，達3.47 cm(最高值)；在FON生長最適宜的pH 8、200 mg·L-1處理中，M3菌落的半徑仍然較FON多93.15%，為2.99 cm(最低值)。說明M3菌株在生長速度上較FON具有顯著優(yōu)勢。

2.4 pH和PHBA質(zhì)量濃度對M3拮抗FON的影響

將FON和M3菌株對峙培養(yǎng)，在pH、PHBA和M3菌株的共同作用下，F(xiàn)ON菌落生長變化趨勢與非對峙培養(yǎng)相似。如圖4-a，F(xiàn)ON菌落半徑的峰值仍然位于200 mg·L-1，且pH 8最有利于FON生長。但是在M3菌落的影響下，F(xiàn)ON生長受到顯著抑制。pH 8、200 mg·L-1處理的菌落半徑峰值僅為1.20 cm，較對應(yīng)的單獨培養(yǎng)降低62.62%；pH 5、800 mg·L-1處理的菌落半徑最低，僅為0.85 cm，較單獨培養(yǎng)降低 64.14%。由圖4-b可知，在pH 5～9、PHBA質(zhì)量濃度0～800 mg·L-1時，M3菌株對FON的抑菌率為62.60%～65.80%，沒有顯著波動。說明pH和PHBA共同作用下，M3菌株的抑菌率無顯著變化。

圖4 不同pH和PHBA質(zhì)量濃度對M3菌株拮抗FON的作用Fig.4 M3 antagonizing FON under effects of pH and PHBA mass concentration

2.5 土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度對M3生防效果的影響

由表1可知，不同土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度影響下植株的發(fā)病率、病情指數(shù)具有差異，M3菌株對西瓜枯萎病的防治效果也不同。pH 9、未添加PHBA與pH 8、800 mg·L-1兩個處理的發(fā)病率最高，均為77.78%。以pH 9、未添加PHBA為對照，計算其他各處理的防治效果。經(jīng)對比可知，除pH 6外，在同一pH組中，PHBA 400mg·L-1處理的植株發(fā)病率和病情指數(shù)均為最低，M3菌株的防治效果均為最高。在pH 6組中，除高質(zhì)量濃度800 mg·L-1顯著影響防治效果外，其他各處理均具有最高水平的防治效果，達85.72%。在pH 8～9組中，未添加PHBA及800 mg·L-1處理的植株發(fā)病率、病情指數(shù)均為組內(nèi)較高水平，而M3菌株的防治效果均為組內(nèi)較低水平。

表1 不同土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度下M3菌株對西瓜枯萎病的防治效果Table 1 Control effect of M3 on watermelon wilt under different soil pH and PHBA mass concentration

表2 土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度與M3菌株防治效果的相關(guān)性Table 2 Correlation analysis of soil pH and PHBA mass concentration and control effect of M3

2.6 土壤pH和PHBA質(zhì)量濃度與M3菌株防治效果的相關(guān)性分析

根據(jù)皮爾遜相關(guān)性分析可知，土壤pH與發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果均具有極顯著相關(guān)性，即pH越高，枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)越高，而防治效果越受到抑制。PHBA質(zhì)量濃度與病情指數(shù)具有顯著相關(guān)性，但是與發(fā)病率和防治效果的相關(guān)性不顯著。由此可知，M3菌株的防治效果主要受土壤pH的影響；PHBA的積累主要影響病情指數(shù)。

3 討 論

本研究明確了真菌M3菌株為哈茨木霉。利用哈茨木霉防治西瓜枯萎病一直被學(xué)者們所關(guān)注[25]。田程等[26]分離獲得一株對西瓜枯萎病菌具有生防作用的哈茨木霉T2-16，抑菌率 60.00%。木霉菌的菌絲體通常生長迅速，有利于與病原菌進行空間和營養(yǎng)競爭[27]。在本研究中，M3菌株表現(xiàn)出較強的競爭能力，于不同pH和PHBA含量的環(huán)境中，其生長速率均顯著高于FON，使FON菌落半徑較CK減少62.60%～65.80%，表明M3菌株具有較強的競爭優(yōu)勢，對FON具有較好的抑菌能力。

環(huán)境pH作為非營養(yǎng)因素可直接影響真菌的生長、繁殖及與其他生物的關(guān)系[28]。通常，木霉和尖鐮孢菌生長的最適pH分別為3～7和 4～9[29-30]。本研究獲得與此相似的結(jié)論，哈茨木霉M3菌株和FON的最適pH分別為6和8，為在實際生產(chǎn)環(huán)境中利用M3菌株開展生物防治提供了依據(jù)。

PHBA是植物根系分泌的一種酚酸類物質(zhì)，可以被微生物分解利用[31]。郝文雅等[17]研究表明，PHBA對FON菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)具有促進作用，其最適PHBA質(zhì)量濃度為400～800 mg·L-1。本研究獲得相似的結(jié)論，F(xiàn)ON菌株生長具有最適PHBA質(zhì)量濃度，但該菌株為200 mg·L-1，可能是不同菌株生物學(xué)特性差異所致。同時，研究發(fā)現(xiàn)PHBA對哈茨木霉M3的菌絲生長具有低濃度促進、高濃度抑制的作用，最適PHBA質(zhì)量濃度400 mg·L-1。Chen等[32]認(rèn)為哈茨木霉對PHBA具有較強的降解能力。對比可知，哈茨木霉M3菌落生長的最適PHBA質(zhì)量濃度顯著高于FON，說明其對PHBA積累環(huán)境具有較好的耐受性。這可能與M3菌株對PHBA的降解和利用能力較強有關(guān)。哈茨木霉和病原菌對PHBA利用能力差異性的機制研究有待進一步探索。

連作土壤環(huán)境復(fù)雜。土壤中根系分泌物PHBA積累與pH共同作用于根系和根際微生物，故考慮兩種因素對生防木霉的疊加作用。作為探索，試驗設(shè)計的PHBA質(zhì)量濃度范圍涵蓋并超過實際連作土壤的情況[33]，但是M3菌株的抑菌率幾乎未受PHBA質(zhì)量濃度變化的影響。盆栽試驗驗證了室內(nèi)研究結(jié)果，M3菌株在土壤pH 6、PHBA質(zhì)量濃度低于800 mg·L-1的環(huán)境中對西瓜枯萎病的防治效果最佳。Abeyratne等[34]研究表明土壤pH為6時，木霉產(chǎn)生大量抗真菌化合物如幾丁質(zhì)酶等，形成較強的拮抗能力，對植株幼苗生防效果最佳。但是，隨著土壤pH增加，M3對西瓜枯萎病的防治效果有降低趨勢?？赡茉诟遬H土壤中，木霉調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白、信號相關(guān)蛋白、胞外酶和參與各種代謝反應(yīng)的蛋白質(zhì)的基因，降低了木聚糖酶、纖維素酶和半纖維素酶等的活性，并阻礙膜運輸?shù)鞍椎倪\輸能力，影響了其對病原菌的防治效果[35]。相關(guān)性分析也表明，土壤pH較PHBA對M3生防效果的影響更為顯著。因此，酸性土壤條件更有利于M3菌株的生防 作用。

研究表明，土壤pH增加可促進鐮孢菌對植株的侵染，導(dǎo)致植株發(fā)病率增高[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，pH 8、PHBA 800 mg·L-1和pH 9、未添加PHBA兩組處理的發(fā)病率最高，并非預(yù)期的pH 8、200 mg·L-1。說明在植株根際環(huán)境，F(xiàn)ON對植株的侵染主要受土壤pH的影響。原因可能是土壤pH誘導(dǎo)FON產(chǎn)生胞外酶降解植物細(xì)胞壁，同時促進蛋白酶、脂肪酶等毒力因子的分泌，致使植株發(fā)病率升高[37]。PHBA對西瓜枯萎病病情指數(shù)具有一定影響，相關(guān)機制有待深入研究。

4 結(jié) 論

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定M3菌株為哈茨木霉。在培養(yǎng)基中，M3菌株和FON均存在最適pH和最適PHBA質(zhì)量濃度，分別為6、400 mg·L-1和8、200 mg·L-1。在pH和PHBA共同作用下，M3菌株對FON的抑菌率穩(wěn)定在62.60%～65.80%；土壤環(huán)境中，M3對西瓜枯萎病的防治效果達85.72%，主要受環(huán)境pH的影響?？傊?，該菌株具有較好的生防應(yīng)用潛力，研究結(jié)果為相關(guān)菌劑的研制與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。