鄧顯文，謝麗基，謝芝勛通信作者，曾婷婷，華 俊，何競(jìng)銘，卿崇程

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(guó)(廣西)-東盟跨境動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

0 引言

沙門(mén)氏菌(Salmonella)為革蘭氏陰性桿菌，在人、家禽和野生動(dòng)物之間廣泛傳播，是一種人畜共患病病原體，能夠引起人類(lèi)的傷寒熱、腹瀉、食物中毒和敗血癥等，危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)的生命安全[1]。據(jù)報(bào)道，在日本和美國(guó)等國(guó)家發(fā)生多起食物中毒事件，其中40%～80%是由禽沙門(mén)氏菌引起的，并且經(jīng)鑒定腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis，SE) 為主要病原菌[2]。腸炎沙門(mén)氏菌是重要的腸道致病菌，能引起禽類(lèi)的腸道感染，是污染禽肉、禽蛋等食品的主要病原菌，可引起人類(lèi)感染，造成公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[3]。

研究對(duì)采自廣西3個(gè)疑似感染沙門(mén)氏菌雞場(chǎng)的病死雞進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，現(xiàn)研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源

2019—2020年采自廣西3個(gè)疑似感染沙門(mén)氏菌的雞場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基SS瓊脂、沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基HE瓊脂、緩沖蛋白胨水 (BPW)和四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肛門(mén)棉拭子取樣

雞肛門(mén)棉拭子取樣，放入1 mL緩沖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)8～18 h，洗壓棉拭子并棄棉拭子。取0.1 mL緩沖蛋白胨水加入1 mL 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，42℃培養(yǎng)18～24 h，用接種環(huán)取TTB增菌液1環(huán)，劃線(xiàn)接種于XLD平板，37℃培養(yǎng)40～48 h。取0.1 mL緩沖蛋白胨水加入1 mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用接種環(huán)取SC增菌液劃線(xiàn)接種于XLD平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察平板上生長(zhǎng)的菌落特征。

1.2.2 病死雞取樣

在無(wú)菌條件下，將病死雞的心臟、肝臟直接劃線(xiàn)接種于血平板，于37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似菌落劃線(xiàn)到XLD平板，于37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落特征。

1.2.3 純化鏡檢

挑取可疑菌落在平板上進(jìn)行傳代純化，將純化后的疑似沙門(mén)氏菌的單個(gè)菌落均勻涂抹在載玻片上，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.4 生化試驗(yàn)

將可疑菌落傳代純化后，按細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生化試驗(yàn)。生化反應(yīng)試驗(yàn)包括：麥芽糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、衛(wèi)矛醇、硫化氫、乳糖、蔗糖、半乳糖苷、丙二酸鹽、水楊素、尿素、氰化鉀、西蒙氏枸櫞酸鹽、葡萄糖磷酸鹽胨水、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴(lài)氨酸脫羧酶等。

1.2.5 血清學(xué)鑒定

按照沙門(mén)氏菌診斷血清說(shuō)明書(shū)，將可疑沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)物與沙門(mén)氏菌屬診斷血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)。首先使用 A～F 多價(jià)O血清，對(duì)可疑沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)物進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，以生理鹽水作為陰性對(duì)照，對(duì)陽(yáng)性凝集的可疑沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)物，用O單因子血清分別進(jìn)行檢測(cè)。然后用H復(fù)合血清及H 單因子血清鑒定其鞭毛抗原，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，參照說(shuō)明書(shū)中沙門(mén)氏菌屬抗原診斷表做出判斷。

1.2.6 PCR鑒定

使用腸炎沙門(mén)氏菌的特異擴(kuò)增引物[4](上游: 5′-TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG-3′，下游:5′-CGTTCTTCTGGTACTTACGATGAC-3′)對(duì)純化的疑似菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 10 min，94℃ 60 s，53.2℃ 60 s，72℃ 60 s，共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)PMD18-T載體后，送華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.7 人工感染試驗(yàn)

將純化分離的腸炎沙門(mén)氏菌，接種于培養(yǎng)基中37℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。以口服的方式對(duì)5只5日齡的SPF雛雞進(jìn)行攻毒(劑量為108CFU/只)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢，觀察病理變化，并進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.8 藥敏試驗(yàn)

將待測(cè)菌株均勻涂布在XLD瓊脂培養(yǎng)基上，用鑷子將藥敏紙片貼在XLD瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑的大小，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)( NCCLS2018) 描述的K-B法的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)XLD瓊脂平板上抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)分析。檢測(cè)的藥敏紙片包含諾氟沙星(喹諾酮類(lèi))、復(fù)方新諾明(磺胺類(lèi))、強(qiáng)力霉素(四環(huán)素類(lèi))、頭孢曲松鈉(β-內(nèi)酰胺類(lèi))、阿米卡星(氨基糖苷類(lèi))、林可霉素(林可霉素類(lèi))和阿奇霉素(大環(huán)內(nèi)酯類(lèi))，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判定耐藥表型。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及鏡檢結(jié)果

分離出6株可疑沙門(mén)氏菌。分離菌在血平板上呈白色、圓形、濕潤(rùn)的菌落，在XLD平板上呈現(xiàn)黃色透明菌落，中間有黑色中心(見(jiàn)圖1)。分離菌染色后，在顯微鏡下觀察呈革蘭氏陰性桿菌。

圖1 分離菌在XLD平板的培養(yǎng)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

6株分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，三糖鐵、硫化氫、賴(lài)氨酸脫羧酶、氰化鉀、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；蔗糖、乳糖、尿素、西蒙氏枸櫞酸鹽和葡萄糖磷酸鹽胨水試驗(yàn)為陰性。根據(jù)《伯杰氏手冊(cè)》關(guān)于腸炎沙門(mén)氏菌生化反應(yīng)特征的標(biāo)準(zhǔn)，6株分離菌符合腸炎沙門(mén)氏菌的生化特征。6株分離菌分別命名為SEGX1、SEGX2、SEGX3、SEGX4、SEGX5和SEGX6。

表1 6株分離菌生化鑒定結(jié)果

續(xù)表1

2.3 血清鑒定結(jié)果

6株分離菌的單因子血清凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，O9、O12和Hg因子的血清凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性，符合腸炎沙門(mén)氏菌血清學(xué)抗原式的特征，與生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)腸炎沙門(mén)氏菌特異性引物PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳得到293 bp的目的片段(見(jiàn)圖2)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST搜索進(jìn)行同源性比對(duì)，與腸炎沙門(mén)氏菌P125109(登錄號(hào)NC-011294)同源性為100%。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種分離的腸炎沙門(mén)氏菌后試驗(yàn)雞于感染后12 h開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為食欲減退、羽毛蓬松和拉白色或淡黃色稀糞等，接種分離菌48 h后，試驗(yàn)SPF雛雞全部死亡，死亡率達(dá)到100%。死亡SPF雛雞剖檢可見(jiàn)肝臟土黃色有淤血斑點(diǎn)和滲出性心包炎。病雞分離的細(xì)菌在XLD平板上呈現(xiàn)黃色透明菌落，中間有黑色中心，在顯微鏡下觀察呈革蘭氏陰性桿菌。

1—100bp DNA Ladder；2—SEGX1；3—SEGX2；4—SEGX3；5—SEGX4；6—SEGX5；7—SEGX6。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。6個(gè)分離株對(duì)復(fù)方新諾明(磺胺類(lèi))和林可霉素(林可霉素類(lèi))耐藥，對(duì)諾氟沙星(喹諾酮類(lèi))和阿米卡星(氨基糖苷類(lèi))敏感。對(duì)強(qiáng)力霉素(四環(huán)素類(lèi))和阿奇霉素(大環(huán)內(nèi)酯類(lèi))，5個(gè)分離株表現(xiàn)敏感，1個(gè)分離株為中度敏感。對(duì)頭孢曲松鈉(β-內(nèi)酰胺類(lèi))，4個(gè)分離株表現(xiàn)敏感，2個(gè)分離株為中度敏感。

表2 腸炎沙門(mén)氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

雞源沙門(mén)氏菌有腸炎、雞白痢、雞傷寒、鼠傷寒、嬰兒、肯塔基、印第安納、德?tīng)柋?、明斯特和海德堡等多種血清型[5]。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)在我國(guó)的山東和安徽等地，禽源沙門(mén)氏菌的主要血清型為腸炎沙門(mén)氏菌[6-8]。施開(kāi)創(chuàng)等[9]在2013—2015年對(duì)廣西地區(qū)的雞源沙門(mén)氏菌進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)流行的主要血清型為鼠傷寒沙門(mén)氏菌(分離率4.5%，14/310)和雞白痢(分離率3.9%，12/310)，腸炎沙門(mén)氏菌的分離率非常低，僅為0.32%(1/310)，這與近年在山東和安徽等地的報(bào)道主要流行血清型是不同的。本研究從廣西3個(gè)發(fā)病雞場(chǎng)分離到的均為腸炎沙門(mén)氏菌，推測(cè)廣西地區(qū)的禽源沙門(mén)氏菌的主要流行血清型可能發(fā)生了改變，這還有待進(jìn)一步的研究。

本研究分離的腸炎沙門(mén)氏菌致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，攻菌后 48 h 對(duì)SPF雛雞的致死率高達(dá) 100%，說(shuō)明本研究分離的雞腸炎沙門(mén)氏菌致病性非常強(qiáng)。

沙門(mén)氏菌極易產(chǎn)生耐藥性，可通過(guò)基因突變、耐藥基因編碼的鈍化酶和滅活酶產(chǎn)生、外排泵、可移動(dòng)的細(xì)菌遺傳耐藥基因元件的產(chǎn)生及其轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制，從而改變藥物的作用靶位，阻礙了藥物的被識(shí)別[10-11]，使得抗生素藥物對(duì)動(dòng)物機(jī)體的治療效果不顯著。有些抗生素甚至直接通過(guò)唾液、糞便和尿液等方式排出體外，破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡[12]。

本研究所獲得的6株雞源致病性沙門(mén)氏菌分離株，對(duì)磺胺類(lèi)的復(fù)方新諾明和林可霉素類(lèi)的林可霉素全部耐藥，在臨床中應(yīng)停止使用這類(lèi)藥物進(jìn)行治療；對(duì)喹諾酮類(lèi)的諾氟沙星和氨基糖苷類(lèi)的阿米卡星全敏感，在科學(xué)用藥的前提下可優(yōu)先考慮使用此類(lèi)藥物。在臨床上用藥時(shí)，建議合理選擇藥物，采取聯(lián)合用藥或輪換用藥，降低致病菌耐藥性。

4 結(jié)論

從廣西3個(gè)雞場(chǎng)共分離到6株腸炎沙門(mén)氏菌，分離的腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)SPF雛雞致死率高，并對(duì)喹諾酮類(lèi)的諾氟沙星和氨基糖苷類(lèi)的阿米卡星高度敏感。