袁文芹，玄紅專, ，王 凱

（1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252059；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是重要的藥食同源的天然產(chǎn)物，有著悠久的使用歷史。在食品領(lǐng)域，古人曾用蜂蜜腌制肉類，不僅能防腐變質(zhì)且風(fēng)味獨(dú)特，至今市場(chǎng)上仍存在形形色色的天然蜂蜜和蜂蜜制品[1]。蜂蜜可用于創(chuàng)傷和燒傷等外傷的愈合劑，既能起到抑菌殺菌的作用，又能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[2]，同時(shí)能緩解疼痛且價(jià)廉易得[3-4]。目前，蜂蜜能夠輔助治療外傷和消化道系統(tǒng)等疾病，在食品和醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域具有巨大的潛力[5]。

近年來(lái)，由于抗生素的廣泛使用甚至濫用，病原微生物已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象，這對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅[6]。因此，天然抗菌藥物的研究與開(kāi)發(fā)對(duì)抑制病原微生物的感染與傳播意義重大。蜂蜜作為一種天然抗菌劑，含有多種抗菌活性物質(zhì)，如甲基乙二醛、過(guò)氧化氫、多酚、抗菌肽和王漿主蛋白等[7-8]。研究表明，過(guò)氧化氫的產(chǎn)生是蜂蜜發(fā)揮抑菌和殺菌活性的主要機(jī)制，過(guò)氧化氫含量與蜂蜜的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）緊密相關(guān)[9]。在蜂蜜的稀釋過(guò)程中，葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOx）被激活，將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并將氧氣還原成過(guò)氧化氫。1941年，德國(guó)科學(xué)家Gauhe首次提出葡萄糖氧化酶在工蜂咽下腺合成。就蜜蜂而言，由于蜂種、發(fā)育階段、分工以及飲食不同，其咽下腺的葡萄糖氧化酶水平有所差異[10]，因而不同蜂蜜中所含過(guò)氧化氫濃度不同，抗菌活性亦有所區(qū)別。一般而言，蜂蜜產(chǎn)生的過(guò)氧化氫僅為通用殺菌劑（如3%雙氧水）濃度的千分之一，這一低濃度的過(guò)氧化氫既能有效殺死細(xì)菌，又不損害正常細(xì)胞[11]，使得蜂蜜可作為良好的創(chuàng)傷敷料加以應(yīng)用[12]。蜂蜜中過(guò)氧化氫釋放的氧原子可與致病菌所含酶蛋白的巰基（-SH）相結(jié)合，由此改變了酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使酶失活，使細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝受到抑制，從而達(dá)到抑菌殺菌的效果[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蜂蜜用過(guò)氧化氫酶處理后，其抗菌活性大大降低，從而確定過(guò)氧化氫是蜂蜜中最重要的抗菌活性物質(zhì)。因此，過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和降解途徑對(duì)蜂蜜的抗菌活性具有重要意義。

本文綜述了蜂蜜中主要抗菌活性物質(zhì)的研究進(jìn)展，并重點(diǎn)圍繞蜂蜜中過(guò)氧化氫以及葡萄糖氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫的過(guò)程進(jìn)行了歸納總結(jié)，闡明了蜂蜜中影響葡萄糖氧化酶活性的物理或化學(xué)因素、過(guò)氧化氫合成（除了蜜蜂來(lái)源的葡萄糖氧化酶）和分解（除了植物來(lái)源的過(guò)氧化氫酶）的其他途徑，同時(shí)，圍繞蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)和過(guò)氧化氫產(chǎn)生之間的因果關(guān)系，以加深我們對(duì)過(guò)氧化氫產(chǎn)生和分解途徑的理解，同時(shí)為蜂蜜抗菌活性的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 蜂蜜中的抗菌活性物質(zhì)

近年來(lái)的研究表明，蜂蜜中含有多種天然抗菌活性成分，如甲基乙二醛、過(guò)氧化氫、多酚、抗菌肽及王漿主蛋白等[14]，這些活性成分均賦予蜂蜜具有廣譜的抗菌作用，為研發(fā)新的抗菌藥物提供了一種途徑。下文將詳細(xì)闡述蜂蜜中主要抗菌活性物質(zhì)的相關(guān)研究進(jìn)展。

1.1 甲基乙二醛

甲基乙二醛（Methylglyoxal，MGO）普遍存在于所有的蜂蜜中，然而，其含量在麥盧卡蜂蜜中最高，約為普通蜂蜜的100倍，視為麥盧卡蜂蜜最重要的抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，因此麥盧卡蜂蜜具有更強(qiáng)的抗菌效果。MGO是由麥盧卡花蜜中的二羥基丙酮（Dihydroxyacetone, DHA）轉(zhuǎn)化而來(lái)，這一過(guò)程不需要酶的參與。據(jù)報(bào)道，麥盧卡花蜜中只能檢測(cè)到DHA，隨著蜂蜜成熟度的增加，新鮮蜂蜜中高含量的DHA將慢慢轉(zhuǎn)化成MGO，DHA的含量逐漸降低，而MGO的含量緩慢上升[16]。研究表明，不同類型和不同地區(qū)的麥盧卡蜂蜜其抗菌特性有所差異，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜的抗菌作用，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果更好，同時(shí)，麥盧卡蜂蜜在非過(guò)氧化物抗菌活性上居于首位[17]。總而言之，甲基乙二醛是麥盧卡蜂蜜中特有的重要抗菌活性物質(zhì)。

1.2 多酚類物質(zhì)

多酚類物質(zhì)主要來(lái)源于蜜蜂采集的開(kāi)花植物，包括酚酸和黃酮類化合物，因此不同蜂蜜中所含酚類化合物的種類和數(shù)量差異顯著[18]。黃酮類化合物具有清除自由基、抗菌、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[19]。2017年，王笑笑等[20]利用UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定蜂蜜中黃酮的組分及含量，研究表明，所有供試蜂蜜均具有抗菌活性，不同蜂蜜所含黃酮濃度具有顯著差異，黃酮含量越高的蜂蜜其抗菌活性越強(qiáng)，說(shuō)明黃酮在蜂蜜的抗菌活性中具有重要貢獻(xiàn)。相關(guān)研究表明，黃酮類物質(zhì)可增強(qiáng)致病菌的細(xì)胞壁通透性，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高胞內(nèi)活性氧水平，從而達(dá)到抑菌的作用[21]。其次，酚酸化合物是含有酚羥基和羧基的一種有機(jī)酸，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為蜂蜜創(chuàng)造了酸性環(huán)境，因而對(duì)蜂蜜的抗菌活性具有重要作用。另外，有研究表明，酚酸可下調(diào)多重耐藥大腸桿菌脂質(zhì)代謝通路上部分關(guān)鍵酶的表達(dá)，致其鞭毛脫落，細(xì)胞膜破損，抑制了其生長(zhǎng)發(fā)育，從而起到抑菌的效果[22]。

1.3 抗菌肽和王漿主蛋白

除了葡萄糖和果糖外，蜂蜜中還含有少量蛋白質(zhì)，這些蛋白成分主要來(lái)自采集蜂自身腺體的分泌物，其次來(lái)源于花粉?；蛎鄯渖眢w殘留[23]。其中，具有抑菌或殺菌活性的蛋白質(zhì)主要是抗菌肽和王漿主蛋白。目前，在醫(yī)用級(jí)蜂蜜中發(fā)現(xiàn)了由工蜂咽下腺分泌的防御素-1蛋白（Defensin-1），其抗菌譜較為廣泛，如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌等，防御素-1亦可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)正常動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用[24]。不同蜂蜜中抗菌肽的含量有所差異。王漿主蛋白（Major royal jelly proteins，MRJPs）是蜂蜜中含量最多的蛋白質(zhì)，占總蛋白的90%[25]。2015年，Brudzynski等發(fā)現(xiàn)蜂蜜中含有王漿主蛋白，并證明其對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等具有廣譜的抗菌活性[26]。2021年，F(xiàn)eng等[27]探究蜂王漿中N糖基化的王漿主蛋白2可通過(guò)擾亂幼蟲(chóng)芽孢桿菌的細(xì)胞壁生物合成，增加細(xì)胞膜通透性，阻礙有氧呼吸，抑制細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡而起到抑菌的效果。因此，蜜蜂來(lái)源的抗菌肽和王漿主蛋白成分對(duì)蜂蜜的抗菌活性具有一定影響。

1.4 過(guò)氧化氫

成熟蜂蜜是蜜蜂采集花蜜并混入自身分泌物，經(jīng)過(guò)發(fā)酵形成的過(guò)飽和糖溶液，其中糖類含量最高，以葡萄糖和果糖為主，兩者占蜂蜜總糖含量的85%～95%[28]。除此之外，蜂蜜中還含有蜜蜂分泌的酶類化合物，包括葡萄糖氧化酶、淀粉酶、過(guò)氧化酶及磷酸酯酶等[29]。而蜂蜜中過(guò)氧化氫主要是由葡萄糖氧化酶催化葡萄糖形成。體外實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖氧化酶將葡萄糖和氧氣經(jīng)過(guò)兩步氧化還原反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，在此過(guò)程中，黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）輔因子對(duì)葡萄糖氧化酶的氧化還原活性至關(guān)重要[30]。第一步是還原反應(yīng)，葡萄糖氧化酶將β-D-葡萄糖第一個(gè)羥基上的2個(gè)電子和1個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移給FAD輔因子，從而催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯。在水溶液中，葡萄糖酸內(nèi)酯從葡萄糖氧化酶上脫落并通過(guò)自發(fā)水解生成葡萄糖酸。第二步是氧化反應(yīng)，氧氣將還原型GOx-FADH2再次氧化，F(xiàn)ADH2將2個(gè)電子轉(zhuǎn)移給氧氣，同時(shí)生成過(guò)氧化氫（如圖1所示）。該反應(yīng)遵循“乒乓”動(dòng)力學(xué)（Ping pong kinetics），即只有當(dāng)葡萄糖從葡萄糖氧化酶上脫落且GOx-FADH2被氧化后，葡萄糖氧化酶才能結(jié)合氧氣[32]。

圖1 葡萄糖氧化酶反應(yīng)與過(guò)氧化氫的產(chǎn)生[31]Fig.1 Glucose oxidase reaction and formation of hydrogen peroxide[31]

過(guò)氧化氫的形成依賴于FAD輔酶因子順利完成氧化還原循環(huán)[33]。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的總速率取決于兩個(gè)半反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，即葡萄糖氧化酶與葡萄糖的動(dòng)力學(xué)以及依賴氧分子的FAD再氧化動(dòng)力學(xué)。隨后，生成的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水和氧氣。過(guò)氧化氫和中間物葡萄糖酸內(nèi)酯的有效去除可使反應(yīng)單向進(jìn)行，并防止葡萄糖氧化酶被氧化。

2 影響蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性和過(guò)氧化氫生成的因素

葡萄糖氧化酶反應(yīng)中過(guò)氧化氫的生成速率取決于三種反應(yīng)物的濃度，即葡萄糖氧化酶、葡萄糖和氧氣。在體外條件下，當(dāng)葡萄糖氧化酶的濃度恒定時(shí)，葡萄糖氧化的初始速率與單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖的濃度成線性關(guān)系[31,34]。隨著葡萄糖濃度的增加和葡萄糖氧化酶結(jié)合位點(diǎn)飽和度的增加，反應(yīng)速率逐漸減慢并達(dá)到最大速率。在高濃度葡萄糖的條件下，葡萄糖氧化酶處于完全飽和狀態(tài)且無(wú)活性，此時(shí)不產(chǎn)生過(guò)氧化氫[29]。然而，未稀釋蜂蜜中酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與體外條件的葡萄糖氧化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)之間具有顯著差異。由于蜂蜜的理化環(huán)境極其復(fù)雜，葡萄糖氧化酶活性不僅與葡萄糖濃度相關(guān)，還受到多種因素的影響，如水分活度、氧氣以及過(guò)氧化氫濃度等。下文將簡(jiǎn)要介紹影響蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性與過(guò)氧化氫生成的相關(guān)因素。

2.1 水分活度

成熟蜂蜜是一種葡萄糖和果糖約占80%、含水量約占17%的過(guò)飽和糖溶液[14]，粘度較大。因而，蜂蜜中高濃度葡萄糖、低水分活度和高粘度的物理狀態(tài)會(huì)抑制反應(yīng)物和產(chǎn)物在基質(zhì)中的擴(kuò)散，進(jìn)而影響蜂蜜中過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

首先，天然未稀釋蜂蜜的水分活度低，大部分水分子化學(xué)結(jié)合在糖和大分子上，只有少量游離水可用于化學(xué)反應(yīng)[35]。葡萄糖氧化酶是一種糖蛋白，含有11%～13%的高甘露糖型碳水化合物成分，這一成分有利于結(jié)合水分子，使葡萄糖氧化酶保持酶活性所需的天然構(gòu)象[36]。然而，除了溶解分子之外，游離水還可作為生成過(guò)氧化氫的許多相關(guān)反應(yīng)的溶劑，比如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化、過(guò)氧化氫酶水解過(guò)氧化氫以及葡萄糖酸內(nèi)酯自發(fā)水解為葡萄糖酸等反應(yīng)。然而，由于未稀釋蜂蜜的水分活度低，這些反應(yīng)均受到抑制[29]，因此其過(guò)氧化氫含量可忽略不計(jì)[37]。

其次，低含量的游離水顯著降低了反應(yīng)物和過(guò)氧化氫在高粘度基質(zhì)中的擴(kuò)散速率，分子流動(dòng)性降低會(huì)導(dǎo)致底物、中間體和產(chǎn)物的積累。隨著反應(yīng)物流動(dòng)性的降低，葡萄糖酸內(nèi)酯成為氧氣的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，二者競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入葡萄糖氧化酶結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而成為葡萄糖的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[38]。此外，在未稀釋蜂蜜中，當(dāng)游離水含量較低時(shí)，葡萄糖酸內(nèi)酯分解生成葡萄糖酸的反應(yīng)受到阻礙。

最后，分子遷移率降低也會(huì)影響過(guò)氧化氫的擴(kuò)散速率。如果過(guò)氧化氫未從反應(yīng)中去除，可能會(huì)引發(fā)反饋反應(yīng)，造成葡萄糖酸內(nèi)酯的大量積累。此時(shí)，過(guò)氧化氫成為葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和氧氣的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

2.2 葡萄糖和氧氣濃度

β-脫氧-D-葡萄糖是葡萄糖氧化酶反應(yīng)生成過(guò)氧化氫的第一底物，其在蜂蜜中含量較高。一般來(lái)說(shuō)，蜂蜜中含有31%左右的葡萄糖，與果糖一起形成過(guò)飽和溶液。體外實(shí)驗(yàn)表明，高濃度葡萄糖使葡萄糖氧化酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài)，并阻斷了與第二底物氧氣的結(jié)合[34,39]。當(dāng)濃度高于100 mmol/L時(shí)，葡萄糖會(huì)成為氧氣的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，阻止氧化型FAD的再生，從而使過(guò)氧化氫的產(chǎn)生受到抑制[31]。在未稀釋蜂蜜中，底物抑制可能是葡萄糖氧化酶活性低和過(guò)氧化氫產(chǎn)量較低的原因之一。

在葡萄糖氧化反應(yīng)中，葡萄糖氧化酶需要氧氣作為第二底物，水作為溶劑。在初期，葡萄糖氧化酶反應(yīng)所需氧氣是由花蜜中空氣的飽和水提供的。然而，在蜂蜜成熟過(guò)程中，水分蒸發(fā)將會(huì)降低氧氣濃度，會(huì)阻礙FADH2-GOx的再氧化。在稀釋蜂蜜中，氧氣是由過(guò)氧化氫酶分解過(guò)氧化氫提供的。然而，在未稀釋的蜂蜜中，由于氧氣供應(yīng)不足，所以產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可忽略不計(jì)。

2.3 過(guò)氧化氫濃度

如果反應(yīng)中過(guò)氧化氫未去除，那么葡萄糖氧化酶的活性還會(huì)受到產(chǎn)物抑制。為了防止過(guò)氧化氫大量積累逆轉(zhuǎn)反應(yīng)方向，去除終產(chǎn)物是很有必要的。過(guò)氧化氫與氧氣競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FADH2-GOx，因而阻礙了還原型FADH2再生成FAD[40]。除了阻斷FAD氧化還原循環(huán)，過(guò)氧化氫還參與葡萄糖氧化酶活性位點(diǎn)的甲硫氨酸的直接氧化，形成的甲硫氨酸亞砜降低了酶對(duì)底物的識(shí)別，使酶對(duì)葡萄糖識(shí)別的特異性受到影響[39]。

因此，蜂蜜中葡萄糖氧化酶與體外條件的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有所不同。在未稀釋蜂蜜中，葡萄糖氧化酶的催化速率受到過(guò)飽和糖溶液中反應(yīng)物擴(kuò)散速率降低、高濃度葡萄糖的底物抑制和產(chǎn)物抑制的影響。低水分活度也會(huì)影響過(guò)氧化氫酶對(duì)過(guò)氧化氫的水解以及葡萄糖酸內(nèi)酯自發(fā)水解成葡萄糖酸等反應(yīng)[31]。綜上所述，過(guò)氧化氫的產(chǎn)生受到許多因素的影響。

3 蜂蜜稀釋過(guò)程中葡萄糖氧化酶酶促反應(yīng)系統(tǒng)的激活

在未稀釋蜂蜜中，低水分活度是抑制葡萄糖氧化酶生成過(guò)氧化氫的基本要素。當(dāng)蜂蜜加水被稀釋后，葡萄糖氧化酶系統(tǒng)被激活[41]。研究表明，過(guò)氧化氫濃度隨著蜂蜜稀釋度的增加而增大，達(dá)到最大值后，再進(jìn)行稀釋時(shí)其過(guò)氧化氫濃度會(huì)迅速下降[41-42]。而不同蜂蜜過(guò)氧化氫濃度最大時(shí)其稀釋度不同，但在大多數(shù)蜂蜜中，最大值出現(xiàn)在15%～50%的蜂蜜濃度范圍內(nèi)[37]。研究表明，蕎麥、石南、麥盧卡等深色蜂蜜的過(guò)氧化氫含量通常高于淺色蜂蜜，當(dāng)蜂蜜濃度低于12.5%時(shí)，過(guò)氧化氫產(chǎn)量會(huì)下降[37]。過(guò)氧化氫濃度和蜂蜜稀釋度之間的關(guān)系呈倒U型曲線，其轉(zhuǎn)折點(diǎn)為過(guò)氧化氫濃度最大值所對(duì)應(yīng)的稀釋度，但倒U型關(guān)系的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚[41]。

另一方面，過(guò)氧化氫濃度的測(cè)定應(yīng)在倒U型曲線的上升部分進(jìn)行，最好在蜂蜜稀釋時(shí)過(guò)氧化氫產(chǎn)量最大點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。由于不同蜂蜜的倒U型曲線模式存在差異，所以在測(cè)量過(guò)氧化氫濃度之前，首先確定每種蜂蜜倒U型曲線的線性和非線性部分，這對(duì)不同蜂蜜中過(guò)氧化氫產(chǎn)量的比較研究尤為重要[31]。

4 蜂蜜稀釋過(guò)程中影響過(guò)氧化氫生成的主要因素

在體外模型系統(tǒng)中，葡萄糖氧化酶的濃度及其活性與過(guò)氧化氫形成速率之間存在簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而在復(fù)雜的蜂蜜環(huán)境中不存在這種相關(guān)性[34]。盡管過(guò)氧化氫的濃度取決于葡萄糖氧化酶含量，但同時(shí)也受到蜂蜜中與酶或產(chǎn)物相互作用的其他生物活性成分（源于花蜜、花粉、酵母）的影響[43]。鑒于“各種小分子”的調(diào)節(jié)作用，最近的研究提出了一個(gè)新觀點(diǎn)，即蜂蜜中過(guò)氧化氫濃度是由葡萄糖氧化酶的產(chǎn)生水平與過(guò)氧化氫酶和蜂蜜其他成分的分解水平之間的差異決定[31]。許多小分子和影響過(guò)氧化氫生成的因素隨著花源而變化，因此可預(yù)測(cè)，不同蜂蜜中過(guò)氧化氫的最終濃度會(huì)有所不同?？梢?jiàn)，蜂蜜中過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和分解是由多因素調(diào)節(jié)的結(jié)果。產(chǎn)生和分解過(guò)氧化氫的酶促和非酶促反應(yīng)途徑的一些機(jī)制在生物化學(xué)中是常見(jiàn)的。

4.1 過(guò)氧化氫酶分解

過(guò)氧化氫的分解途徑主要包括花粉來(lái)源的過(guò)氧化氫酶將其水解為水和氧氣。過(guò)氧化氫酶催化反應(yīng)包括2分子過(guò)氧化氫和鐵（Ⅲ）。首先，過(guò)氧化氫作為氧化劑，將鐵（Ⅲ）氧化為鐵（Ⅳ）氧鐵中間體。將鐵（Ⅲ）的一個(gè)電子轉(zhuǎn)移給過(guò)氧化氫分子，破壞了過(guò)氧化氫分子中的O-O鍵，將其還原成水和氧氣。其次，另一分子過(guò)氧化氫作為還原劑，將鐵（Ⅳ）氧鐵中間體還原為原始的鐵過(guò)氧化氫酶，同時(shí)生成氧氣和一分子水。一般認(rèn)為，不同蜂蜜中過(guò)氧化氫酶的含量和活性決定了過(guò)氧化氫的最終水平[44]，然而，過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化氫濃度之間的定量關(guān)系尚存在一定爭(zhēng)議[45]，這表明存在其他機(jī)制影響著蜂蜜中過(guò)氧化氫的含量。

4.2 金屬酶分解

除了過(guò)氧化氫酶，蜂蜜中含有鐵或過(guò)渡金屬的酶與過(guò)氧化氫酶具有相似的金屬誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)機(jī)理，其中金屬離子是電子的來(lái)源[46]。例如，蜂蜜中含有延緩衰老的超氧化物歧化酶，它是一種富含金屬離子且具有生物活性的蛋白質(zhì)，可清除活性氧自由基[47]。因此，其他含金屬酶也可以分解過(guò)氧化氫，使其濃度發(fā)生改變，從而對(duì)蜂蜜抗菌活性產(chǎn)生影響。

4.3 抗壞血酸分解

過(guò)氧化氫也可以通過(guò)非酶促反應(yīng)途徑分解。在有氧條件下，一些抗氧化劑（如抗壞血酸）可以被過(guò)氧化氫（而不是氧氣）氧化，通過(guò)將兩個(gè)電子和兩個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移給過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫還原成水和氧氣，同時(shí)生成脫氫抗壞血酸。來(lái)自花蜜的抗壞血酸在蜂蜜中廣泛存在[48]。研究發(fā)現(xiàn)，向蜂蜜中加入抗壞血酸能使過(guò)氧化氫的去除率增加5倍。在蜂蜜中，抗壞血酸的濃度決定了其具有不同的活性—抗氧化或促氧化，當(dāng)抗壞血酸表現(xiàn)為抗氧化活性時(shí)，蜂蜜中過(guò)氧化氫分子被分解，使其無(wú)法參與活性氧的生成；當(dāng)抗壞血酸表現(xiàn)為促氧化活性時(shí)，則有利于過(guò)氧化氫的生成[49]。

4.4 多酚自氧化產(chǎn)生

過(guò)氧化氫還可通過(guò)多酚的促氧化活性產(chǎn)生。眾所周知，多酚是一類強(qiáng)抗氧化劑，但在有氧條件下，當(dāng)過(guò)渡金屬離子尤其是鐵（Ⅱ）和銅（Ⅰ）存在時(shí)，它們易被氧化成醌類化合物，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為自氧化的副產(chǎn)物[50-51]。過(guò)氧化氫的產(chǎn)量取決于多酚結(jié)構(gòu)、多酚濃度、過(guò)渡金屬離子和氧氣的存在。自氧化過(guò)程是將多酚羥基的一個(gè)電子轉(zhuǎn)移給氧氣，形成鄰半醌陰離子自由基，鄰半醌自由基與氧氣反應(yīng)生成超氧陰離子自由基，最后歧化成過(guò)氧化氫[31]。

由于氧氣不能直接與兒茶酚或沒(méi)食子酰基團(tuán)反應(yīng)，因此過(guò)渡金屬的存在對(duì)多酚自氧化至關(guān)重要。在蜂蜜中，鐵（Ⅱ）、銅（Ⅰ）和錳（Ⅱ）等過(guò)渡金屬的濃度差異決定了過(guò)氧化氫的生成量。多酚自氧化依賴于酸堿度，堿性條件下會(huì)加快自氧化反應(yīng)。當(dāng)pH低于7時(shí)，則不會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫[52]。

在蜂蜜中，許多酚類化合物具有抗氧化和促氧化活性所需的結(jié)構(gòu)成分，例如槲皮素、芹菜素、蘆丁、咖啡酸及阿魏酸等。一般而言，能夠自氧化或具有自由基清除和金屬螯合活性的抗氧化劑都存在兩種活性化學(xué)基團(tuán)的參與，主要是兒茶酚基團(tuán)和一些羥基結(jié)構(gòu)[53]。從抗氧化到促氧化活性的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于多酚濃度、金屬離子的存在和酸堿度[54]。蜂蜜的抗氧化活性與多酚濃度緊密相關(guān)[55-56]。研究發(fā)現(xiàn)，與淺色蜂蜜相比，深色蜂蜜的總酚含量更高，因而具有更高的抗氧化能力[57]。

多酚自氧化是蜂蜜產(chǎn)生過(guò)氧化氫的非酶促反應(yīng)途徑。過(guò)氧化氫濃度增加和過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生的羥自由基增加均有利于增強(qiáng)蜂蜜的抗菌活性[58-61]。

4.5 芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）降解

在鐵（Ⅱ）或其他過(guò)渡金屬存在的條件下，由酶或多酚自氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化氫通過(guò)芬頓反應(yīng)立即轉(zhuǎn)化為活性氧。當(dāng)氧化型三價(jià)鐵離子存在時(shí)，氧氣還原為超氧自由基（O2-·），然后進(jìn)入芬頓反應(yīng)。如上所述，超氧自由基是在多酚或抗壞血酸自氧化過(guò)程中形成的。超氧自由基進(jìn)入芬頓反應(yīng)，將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵，并產(chǎn)生氧氣。二價(jià)鐵與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成三價(jià)鐵、羥自由基（·OH）和羥基陰離子（OH—）。然后，超氧自由基再與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成羥自由基（·OH）、羥基陰離子（OH—）和氧氣（O2）[62]。

天然蜂蜜具有芬頓反應(yīng)所需的全部底物（過(guò)氧化氫、多酚和鐵等過(guò)渡金屬離子），因此它們能夠產(chǎn)生超氧自由基和羥自由基，這兩種自由基對(duì)細(xì)菌的傷害最大，能夠產(chǎn)生抑制其生長(zhǎng)和降解DNA等不利影響。Brudzynski和Lannigan（2012b）發(fā)現(xiàn)，在含有高濃度多酚的蕎麥蜂蜜中添加Cu（Ⅱ）或過(guò)氧化氫，由于羥自由基的形成，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）和耐萬(wàn)古霉素腸球菌（Vancomycin-resistant enterococcus，VRE）的抑菌活性增加了30倍[59]。利用能捕獲羥自由基的對(duì)氨基苯熒光素，證明羥自由基的產(chǎn)生與抑菌之間存在直接關(guān)系。在添加銅離子之前，用過(guò)氧化氫酶預(yù)處理蜂蜜則完全恢復(fù)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，這表明羥自由基是由過(guò)氧化氫通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的[59]。當(dāng)反應(yīng)物中沒(méi)有過(guò)氧化氫或銅離子時(shí)，則對(duì)細(xì)菌DNA沒(méi)有損傷。

4.6 開(kāi)花植物的花蜜氧化還原循環(huán)

目前，蜜蜂來(lái)源的葡萄糖氧化酶被認(rèn)為是蜂蜜中過(guò)氧化氫生成的主要機(jī)制。最初，在煙草花蜜中發(fā)現(xiàn)了具有葡萄氧化酶活性的花蜜氧化還原蛋白，這些蛋白組成了花蜜氧化還原循環(huán)?；垩趸€原循環(huán)由5種酶組成，其中NEC1（Nectarin Ⅰ）和NEC5（Nectarin V）均具有葡萄糖氧化酶活性，可將葡萄糖和氧氣轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫[63]，因而對(duì)蜂蜜的抗菌活性具有重要影響。因此，植物花蜜氧化還原循環(huán)酶的發(fā)現(xiàn)為蜂蜜中過(guò)氧化氫的產(chǎn)生途徑提供了新的見(jiàn)解。

4.7 微生物產(chǎn)生

事實(shí)上，蜂蜜中的微生物可以產(chǎn)生葡萄糖氧化酶，因而它們對(duì)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生也具有一定貢獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜中存在許多能產(chǎn)生過(guò)氧化氫的微生物[64]，包括真菌（如曲霉和青霉）、酵母（如酵母屬、裂殖酵母屬、子囊菌屬等）以及細(xì)菌（如乳酸菌、芽孢桿菌屬和大腸桿菌）等，這些微生物在糖溶液中生長(zhǎng)良好，能耐受蜂蜜的高滲透壓[65]，因此可以產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫，但它們對(duì)蜂蜜中過(guò)氧化氫的影響尚待深入研究。

5 蜂蜜的膠體結(jié)構(gòu)對(duì)過(guò)氧化氫生成的影響

蜂蜜是植物、蜜蜂和微生物來(lái)源的不同成分的混合物，這些成分在糖溶液中均勻分布并自由擴(kuò)散（見(jiàn)圖2）。然而，最近的證據(jù)表明，蜂蜜大分子在低水分活度和高糖濃度條件下聚集形成膠體顆粒[41]。利用掃描電子顯微鏡可觀察到，蜂蜜的膠體結(jié)構(gòu)是分散在糖溶液中的相分離粒子。研究發(fā)現(xiàn)，膠體結(jié)構(gòu)在蜂蜜產(chǎn)生過(guò)氧化氫中具有重要作用[41]。利用動(dòng)態(tài)光散射儀觀察到，當(dāng)蜂蜜未被稀釋時(shí)，高濃度的大分子可形成微米級(jí)顆粒，當(dāng)蜂蜜稀釋時(shí)，隨著稀釋度的增加，蜂蜜大分子葡萄糖和果糖的濃度降低，導(dǎo)致分子間相互作用降低，膠體結(jié)構(gòu)由微米級(jí)轉(zhuǎn)變成納米級(jí)顆粒，此時(shí)體系由兩相膠體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閱蜗喾稚顟B(tài)，即發(fā)生了相變[66]。研究表明，蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)和相變點(diǎn)對(duì)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生具有重要意義，因而對(duì)蜂蜜的抗菌活性具有重大影響[41]。

圖2 影響蜂蜜中過(guò)氧化氫生成的因素Fig.2 Factors affecting hydrogen peroxide production in honey

5.1 蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)與過(guò)氧化氫產(chǎn)生之間的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，形成膠體顆粒的蜂蜜能夠有效產(chǎn)生過(guò)氧化氫[66]。相反，從膠體狀態(tài)到單分散狀態(tài)的相變則導(dǎo)致過(guò)氧化氫產(chǎn)量大大降低，這兩種狀態(tài)下過(guò)氧化氫的產(chǎn)量明顯不同[67]。當(dāng)研究蜂蜜稀釋后其構(gòu)象變化與過(guò)氧化氫產(chǎn)生的關(guān)系時(shí)（分別使用動(dòng)態(tài)光散射儀和安普爾克斯紅法），發(fā)現(xiàn)相變點(diǎn)與過(guò)氧化氫濃度最大值的稀釋度是一致的。深色蜂蜜和中度蜂蜜其過(guò)氧化氫最大產(chǎn)量和相變點(diǎn)都恰好出現(xiàn)在16倍和8倍稀釋度（蜂蜜濃度分別為6.25%和12.5%）；相反，在稀釋過(guò)程中，淺色蜂蜜出現(xiàn)過(guò)氧化氫產(chǎn)量下降的現(xiàn)象。因此，過(guò)氧化氫的生成與蜂蜜膠體構(gòu)象有關(guān)，當(dāng)蜂蜜由兩相膠體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閱蜗喾稚顟B(tài)時(shí)，則不再產(chǎn)生過(guò)氧化氫[41]。

5.2 蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)對(duì)其抗菌活性的影響

蜂蜜的膠體結(jié)構(gòu)影響其理化和功能性質(zhì)。膠體結(jié)構(gòu)促進(jìn)了過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，因此提高了蜂蜜的抗菌活性[41]。由于高糖濃度、低水分活度和酸性環(huán)境均不利于細(xì)菌生長(zhǎng)，因此這些因素對(duì)蜂蜜的抗菌活性起到重要作用。從蜂蜜功能的角度來(lái)看，由多種活性成分組成的膠體結(jié)構(gòu)，如多酚、蛋白質(zhì)、酶、肽、蛋白復(fù)合物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等，發(fā)現(xiàn)它們均與蜂蜜的抗菌活性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著蜂蜜稀釋度的增加，其抗菌活性顯著降低，但與淺色蜂蜜相比，深色蜂蜜和中度蜂蜜的抗菌活性較強(qiáng)[66]?？傊?，蜂蜜成分形成膠體顆粒并結(jié)合與其抗菌活性相關(guān)的因素和化合物，因此，膠體結(jié)構(gòu)為其抗菌活性的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了新的見(jiàn)解[31]。

5.3 稀釋蜂蜜中過(guò)氧化氫分子的穩(wěn)定性

當(dāng)蜂蜜未稀釋時(shí)，兩相構(gòu)象中形成微米級(jí)膠體顆粒的活性大分子可能通過(guò)協(xié)同作用產(chǎn)生過(guò)氧化氫，粒子間的緊密距離會(huì)影響過(guò)氧化氫的空間分布。由于過(guò)氧化氫的擴(kuò)散范圍較小，其在顆粒周圍區(qū)域的局部積累會(huì)增加。然而，當(dāng)蜂蜜稀釋時(shí)，根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射儀的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，相變改變了顆粒大小，增加了顆粒在粘性較小介質(zhì)中的分散性和流動(dòng)性[41]。這些變化可能會(huì)影響粒子之間的相互作用，增加排斥力，改變粒子之間的距離。經(jīng)過(guò)相變點(diǎn)后，稀釋狀態(tài)的構(gòu)象會(huì)影響過(guò)氧化氫分子的完整性，使其被過(guò)氧化氫酶和其他小分子降解。此外，稀釋蜂蜜從酸性到中性的pH變化也可能是其不穩(wěn)定的因素之一。對(duì)于商品化的過(guò)氧化氫溶液，當(dāng)pH低于4.5時(shí)，其處于最穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)pH高于5時(shí)，過(guò)氧化氫降解會(huì)大大增加。因此，蜂蜜加水稀釋不利于過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和釋放。

6 總結(jié)與展望

近年來(lái)，天然產(chǎn)物的抗菌活性受到人們的廣泛關(guān)注。蜂蜜中存在的多種活性物質(zhì)對(duì)其抗菌活性均有一定影響，如甲基乙二醛、過(guò)氧化氫、多酚、抗菌肽及王漿主蛋白等。除麥盧卡蜂蜜以外，過(guò)氧化氫是絕大多數(shù)蜂蜜中最重要的抗菌物質(zhì)。盡管有研究表明，過(guò)氧化氫水平是由葡萄糖氧化酶的合成速率和過(guò)氧化氫酶的分解速率決定，但最近也有大量研究質(zhì)疑了該觀點(diǎn)。過(guò)氧化氫水平受到眾多因素的影響，沒(méi)有一種化合物或因素可以直接控制和預(yù)測(cè)過(guò)氧化氫的最終濃度。盡管蜜蜂來(lái)源的葡萄糖氧化酶通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫是主要途徑，但依舊不能排除花蜜和微生物中葡萄糖氧化酶的潛在影響。其次，在未稀釋蜂蜜中，任何酶反應(yīng)速率都受到低水分活度的抑制；當(dāng)蜂蜜稀釋后，則會(huì)引發(fā)酶促和非酶促反應(yīng)，比如通過(guò)多酚自氧化生成過(guò)氧化氫以及通過(guò)芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）分解過(guò)氧化氫等，這些反應(yīng)對(duì)蜂蜜中過(guò)氧化氫的水平具有重要影響，因而也影響著蜂蜜的抗菌活性。迄今為止，研究取得的重要進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)了蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)和過(guò)氧化氫產(chǎn)生之間的密切聯(lián)系，這可以解釋研究人員觀察到的過(guò)氧化氫產(chǎn)生和蜂蜜稀釋度之間的倒U型關(guān)系。膠體構(gòu)象有利于過(guò)氧化氫水平的提高，確保其穩(wěn)定性，進(jìn)而保持蜂蜜的抗菌活性。在蜂蜜中，眾多化合物或因素調(diào)控著其抗菌活性，但這些化合物的抗菌效能、殺菌機(jī)制以及如何利用這些化合物或因素提高蜂蜜的抗菌活性仍是待探究的問(wèn)題，且目前對(duì)影響過(guò)氧化氫生成因素的了解仍處于初始階段，如何合理控制蜂蜜中過(guò)氧化氫的合成與分解是其開(kāi)發(fā)利用的難點(diǎn)之一，因此，后續(xù)研究需要進(jìn)一步探索蜂蜜中過(guò)氧化氫的生成途徑和機(jī)制，以期為蜂蜜在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供更全面的理論基礎(chǔ)。