高 群，黃淵楠，蔡茜茜，王一瀟，杜 明，劉永樂(lè)，汪少蕓,

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；3.長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410114）

氧化應(yīng)激是一種由反應(yīng)物的產(chǎn)生和細(xì)胞自然抗氧化能力之間的失衡引起的正常細(xì)胞和分子功能的紊亂，通常由活性氧和活性氮自由基共同導(dǎo)致[1]。過(guò)多的自由基造成細(xì)胞內(nèi)蛋白、脂質(zhì)和DNA損傷，還會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。隨著時(shí)間的推移，氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致一系列與衰老相關(guān)的退行性疾病，如癌癥、糖尿病、黃斑變性、阿爾茨海默病和帕金森病[2]。

食品源抗氧化肽因其安全性高、低成本、高活性、易吸收等優(yōu)點(diǎn)備受研究人員的青睞，其中動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源的抗氧化肽往往具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，利用動(dòng)物蛋白制備抗氧化肽是近年來(lái)的研究熱門。Egerton等[3]水解藍(lán)鱈魚(yú)得到抗氧化活性肽并探究了其作為強(qiáng)化健康成分在飲料中的應(yīng)用。吳明澤等[4]從中華圓田螺肉的酶解液中分離純化得到的多肽在小鼠體內(nèi)具有良好的抗氧化活性?？寡趸幕钚缘捏w外評(píng)價(jià)可以分為化學(xué)評(píng)價(jià)和細(xì)胞評(píng)價(jià)，常見(jiàn)的化學(xué)評(píng)價(jià)方法有測(cè)定自由基清除能力、還原能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力等[5]，而H2O2誘導(dǎo)的Caco-2和HepG2細(xì)胞損傷模型則是細(xì)胞評(píng)價(jià)的典型方法[6]。作為一種強(qiáng)氧化劑，H2O2能夠進(jìn)入細(xì)胞形成活性氧自由基并引起脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)氧化、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)損傷以及DNA損傷，甚至?xí)斐杉?xì)胞凋亡。目前，通過(guò)探究肽對(duì)細(xì)胞存活率、胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、抗氧化酶活等的影響，來(lái)自谷物、蛋類和魚(yú)類的多肽已被證明對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用[7-9]。

鱸魚(yú)（Lateolabrax maculatus），又稱寨花、四肋魚(yú)，主要分布于太平洋西岸，在我國(guó)沿海地區(qū)均有生產(chǎn)[10]。鱸魚(yú)味道鮮美，又富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸和微量元素，綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在民間食療方法中，常被用于產(chǎn)后或術(shù)后促進(jìn)傷口愈合[11]。目前對(duì)鱸魚(yú)生物活性的研究涉及促傷口愈合作用[12]、降血脂作用[13]、抗菌作用[14]、抗氧化作用[15]、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[16]。

目前對(duì)鱸魚(yú)抗氧化肽的研究多是只選用魚(yú)肉、魚(yú)皮或魚(yú)鱗作為原料，本研究使用僅去除內(nèi)臟的鱸魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，減少資源如魚(yú)骨的廢棄，為鱸魚(yú)的深度開(kāi)發(fā)提供新的途徑。已有的研究缺少對(duì)肽的穩(wěn)定性探究，未為肽在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的可能提供理論依據(jù)。本研究首先通過(guò)化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)鱸魚(yú)蛋白水解物（Lateolabrax maculatusprotein hydrolysates，LPH）的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步考察其抗氧化活性的穩(wěn)定性，最后利用H2O2模擬細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，探究LPH對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期為L(zhǎng)PH作為功能性食品成分應(yīng)用于生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鱸魚(yú) 福建省福州市當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；Caco-2細(xì)胞系 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；木瓜蛋白酶（800 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；2,2” -聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）上海麥克林生化科技有限公司；H2O2西隴科學(xué)股份有限公司；活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）測(cè)試盒、總蛋白定量測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

3111型CO2培養(yǎng)箱、Genesys 10s型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Ts2-FL型倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；SpectraMax iD3型多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司； FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器公司；F-4600型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Super Mini Dancer型調(diào)速型迷你離心機(jī) 生工生物工程（上海）股份有限公司；TD5B型低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；JY92-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；MJ-BL25C3型絞肉機(jī)廣東美的精品電器制造有限公司；TH2-82型水浴恒溫?fù)u床 金壇市鴻科儀器廠；FD-1C-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鱸魚(yú)蛋白酶解物的制備 通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化蛋白酶的種類、料液比、加酶量等條件，本論文探究前期最佳工藝條件下制備得到的多肽的抗氧化活性和穩(wěn)定性。鱸魚(yú)去除內(nèi)臟后用清水洗凈，將整條魚(yú)剁碎后用絞肉機(jī)攪成肉糜，在料液比1:3.8（g/mL）、加酶量2.14%（g/g）、酶解時(shí)間0.93 h條件下用木瓜蛋白酶進(jìn)行對(duì)其酶解，酶解物凍干后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鱸魚(yú)抗氧化肽分子量的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定鱸魚(yú)抗氧化肽的分子量分布，TSK gel 2000 SWXL（7.8 i.d.×300 mm）柱，流速為0.5 mL/min，上樣量為10 μL。

1.2.3 體外抗氧化能力實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 根據(jù)顏阿娜等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定，配制0.1 mmol/L DPPH溶液（95%乙醇為溶劑），設(shè)置空白對(duì)照組（0.5 mL DPPH溶液與95%乙醇等量混合）、樣品組（0.5 mL不同濃度樣品與DPPH溶液等量混合）、樣品參比組（0.5 mL不同濃度樣品與95%乙醇等量混合），室溫下避光靜置30 min后于517 nm處測(cè)定吸光值并按下式計(jì)算：

式中：Ai：樣品組吸光值；Aj：樣品參比組吸光值；A0：空白對(duì)照組吸光值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 根據(jù)Hernandez-Ledesma等[18]描述的方法并稍作修改，配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液，等量混合后于室溫下避光靜置16 h得到ABTS母液。配制5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4）作為稀釋和調(diào)零液，ABTS母液用PBS稀釋至在734 nm處吸光值為0.70±0.02，加入等體積樣品溶液（樣品組）或去離子水（空白組），混勻并靜置10 min，于734 nm處測(cè)定吸光值并按下式計(jì)算：

式中：A0：空白組吸光值；Ai：樣品組吸光值。

1.2.3.3 還原力的測(cè)定 參考張強(qiáng)等[19]的方法并稍作修改，配制0.2 mol/L PBS緩沖液（pH6.6）、1%K3[Fe（CN）6]溶液、10% C2HCl3O2溶液和1% FeCl3溶液。0.5 mL樣品（樣品組）或去離子水（空白組）與1.25 mL PBS、1.25 mL K3[Fe（CN）6]溶液混合，于50 ℃保溫20 min后加入1.25 mL C2HCl3O2溶液充分混勻，3000 r/min離心10 min，取1.25 mL上清液加入1.25 mL蒸餾水和0.25 mL FeCl3溶液，室溫靜置10 min后于700 nm處測(cè)定吸光值。樣品的還原力與吸光值成正比。

1.2.4 抗氧化活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 pH穩(wěn)定性 參考Singh等[20]的實(shí)驗(yàn)，配制4 mg/mL LPH溶液，分別將其pH調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，室溫（25 ℃）下靜置2 h后將pH調(diào)回原始pH，并測(cè)其DPPH自由基清除活性。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性 參考Alahyaribeik等[21]的實(shí)驗(yàn)，配制4 mg/mL LPH溶液，分別在25（室溫）、40、60、80、100 ℃下保溫2 h，每隔30 min取樣進(jìn)行DPPH自由基清除活性的測(cè)定。

1.2.4.3 金屬離子穩(wěn)定性 參考郭其洪等[22]的實(shí)驗(yàn)并稍作修改，配制4 mg/mL LPH溶液，分別向溶液中加入KCl、CaCl2、CuSO4、ZnSO4，使金屬離子濃度分別達(dá)到0.25、0.5、1、2 mmol/L，室溫靜置2 h后測(cè)其DPPH自由基清除活性。

1.2.4.4 模擬胃腸道消化 根據(jù)劉珊珊等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定，配制4 mg/mL的LPH溶液，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0后加入2%（g/g）的胃蛋白酶模擬胃消化，于37 ℃反應(yīng)1 h，每0.5 h取樣用沸水煮10 min滅酶后進(jìn)行DPPH自由基清除率測(cè)定；胃消化完成后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入4%（g/g）的胰蛋白酶模擬腸消化，于37 ℃反應(yīng)3 h，每0.5 h取樣用沸水煮10 min滅酶后進(jìn)行DPPH自由基清除率測(cè)定。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 Caco-2細(xì)胞在含有20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液和1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃和5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。參考李亞會(huì)等[24]的方法并稍作修改，實(shí)驗(yàn)分為H2O2模型組、LPH樣品組和空白組。模型組經(jīng)650 μmol/L H2O2作用4 h后棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h；樣品組在650 μmol/L H2O2作用4 h后棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基和終濃度為100、200、400 μg/mL的LPH溶液，接著培養(yǎng)24 h；空白組的細(xì)胞正常培養(yǎng)，用PBS代替H2O2和LPH溶液。

1.2.5.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入80 μL/孔新鮮培養(yǎng)基和20 μL/孔不同濃度LPH溶液再培養(yǎng)24 h。采用MTT法[25]測(cè)定細(xì)胞毒性，培養(yǎng)完成后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出，去除上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下用96孔板震蕩儀振蕩10 min，酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定其吸光值。

1.2.5.3 MTT檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞存活率調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至3×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行處理和培養(yǎng)后按照上述MTT法測(cè)定Caco-2細(xì)胞存活率。

1.2.5.4 細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×105個(gè)/mL，每孔1 mL接種于12孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行處理和培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，棄上清，用PBS洗2遍，每孔加入100 μL胰酶于培養(yǎng)箱中消化2 min后加入1 mL培養(yǎng)基吹打收集細(xì)胞，2000 r/min離心3 min去上清后再用PBS洗2遍，加入200 μL 10 μmol/L DCFH-DA 37 ℃避光反應(yīng)30 min，2000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗2遍，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，用熒光光譜儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm[26]。

1.2.5.5 熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞中線粒體膜電位的變化 使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）對(duì)Caco-2細(xì)胞中的相對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行評(píng)估[8]。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×105個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行處理和培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后棄上清，細(xì)胞與JC-1在37 ℃下避光孵育20 min。孵育結(jié)束后吸除上清，洗滌液洗2遍，每孔加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×105個(gè)/mL，每孔1 mL接種于12孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行處理和培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行LDH水平的檢測(cè)[27]。

1.2.5.7 細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT水平的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×105個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行處理和培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，PBS洗2遍，胰酶消化后再用PBS洗2遍，用500 μL PBS吹打收集細(xì)胞。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行SOD和CAT水平的檢測(cè)[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每次實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05處的統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVE）和Duncan多重比較確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPH的分子量分布

采用高效液相色譜法測(cè)定LPH的分子量分布，由表1可知，LPH中分子量小于3000 Da的組分占91.12%，且小于1000 Da的肽段占比高達(dá)74.92%，說(shuō)明LPH以短肽為主。

表1 LPH的分子量分布Table 1 Molecular mass distribution profile of LPH

2.2 LPH的體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)常用來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化活性。如圖1所示，隨著LPH濃度的提高，DPPH自由基清除率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。在4 mg/mL的樣品濃度下清除率達(dá)到81.41%，LPH對(duì)DPPH自由基清除的半數(shù)抑制濃度IC50值約為2.13 mg/mL，遠(yuǎn)小于蔡金秀等[29]酶解馬面魚(yú)皮膠原得到的抗氧化肽的IC50值（13.03 mg/mL）以及張靖[30]使用堿性蛋白酶酶解羊骨得到的抗氧化肽的IC50值（23.45 mg/mL），這可能是因?yàn)榕c馬面魚(yú)皮膠原肽和羊骨肽相比，LPH中小分子肽（＜3000 Da）所占比例更多，研究表明小分子肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性[26]。

圖1 LPH的DPPH自由基清除活性Fig.1 Free radical scavenging activities against DPPH of LPH

2.2.2 ABTS+自由基清除活性 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)因其操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)體外抗氧化活性的檢測(cè)。如圖2所示，LPH對(duì)ABTS+自由基具有較強(qiáng)的清除活性在12.5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除率隨濃度的增大迅速升高，達(dá)到88.85%，而當(dāng)濃度繼續(xù)增大到200 μg/mL時(shí)，自由基清除率為97.07%，得到LPH清除ABTS+自由基的IC50值約為31.53 μg/mL。與李軍[31]研究報(bào)道的鰱魚(yú)骨膠原多肽的IC50值（0.28 mg/mL）相比，LPH顯示出更強(qiáng)的ABTS+自由基清除活性。范德華力和疏水作用力可增強(qiáng)疏水性較強(qiáng)的大分子與自由基之間的作用力，可能是LPH與鰱魚(yú)骨膠原多肽中疏水性氨基酸種類及比例的差異導(dǎo)致了其ABTS+自由基清除活性的差異。

圖2 LPH的ABTS+自由基清除活性Fig.2 ABTS+ free radical scavenging activities of LPH

2.2.3 還原力 還原力指示物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)中提供電子的能力，還原力越強(qiáng)的樣品所表現(xiàn)出的抗氧化活性越強(qiáng)[32]。如圖3所示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，還原力大小隨LPH濃度的增加而增加，這可能是由于LPH中存在電子密度較高的側(cè)鏈基團(tuán)和相對(duì)較高的短鏈肽氧化還原電位，LPH作為還原劑，通過(guò)給出電子參與自由基的清除，從而達(dá)到抗氧化的目的[26]。

圖3 LPH的還原力Fig.3 Reducing power of LPH

2.3 LPH的抗氧化穩(wěn)定性

2.3.1 pH穩(wěn)定性 pH是影響活性肽穩(wěn)定性的重要因素，食品加工過(guò)程中涉及的輔料、添加劑等物質(zhì)可能會(huì)改變體系的pH，因此有必要對(duì)LPH的pH穩(wěn)定性進(jìn)行探究。如圖4所示，pH為6.0時(shí)，LPH的DPPH自由基清除率與未經(jīng)酸堿處理的對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿處理后，LPH的DPPH自由基清除活性稍有下降，推測(cè)可能的原因是，極端的酸堿條件使多肽發(fā)生外消旋，部分LPH肽鏈構(gòu)象的改變抑制了其與自由基結(jié)合的能力，最終造成了LPH抗氧化活性的降低[33]。堿性條件下的不穩(wěn)定可能是半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸被破壞的結(jié)果[34]。但是，盡管LPH的DPPH自由基清除活性受到強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境的影響，在pH2.0和pH12.0條件下，其清除率仍為對(duì)照組的94.44%和94.33%，說(shuō)明pH對(duì)LPH的DPPH自由基清除活性影響較小，利于LPH在食品加工中的應(yīng)用。

圖4 pH對(duì)LPH抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of pH on antioxidant activity of LPH

2.3.2 熱穩(wěn)定性 溫度是影響抗氧化肽活性的另一重要因素，如圖5所示，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，LPH的DPPH清除活性略有降低，但總體而言熱處理對(duì)LPH的DPPH自由基清除活性影響不大，即使在100 ℃的高溫處理2 h后，清除率也僅從84.99%下降至81.59%。與張靖[30]研究報(bào)道的羊骨抗氧化肽經(jīng)100 ℃的高溫處理2 h后DPPH清除活性降至原來(lái)的42%相比，LPH具有良好的耐熱性，可能是因?yàn)長(zhǎng)PH絕大部分是小分子肽，對(duì)溫度的敏感程度較低，與完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)易受高溫影響變性從而導(dǎo)致活性降低不同，LPH中肽的結(jié)構(gòu)變性較少，具有良好的抗氧化穩(wěn)定性，利于其在食品熱處理工藝中的應(yīng)用。

圖5 溫度對(duì)LPH抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of temperature on antioxidant activity of LPH

2.3.3 金屬離子穩(wěn)定性 在食品加工過(guò)程中，原料、水以及添加劑中含有的K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Fe3+等金屬離子對(duì)人體所需金屬元素的補(bǔ)充至關(guān)重要，加之食品在加工、儲(chǔ)藏與運(yùn)輸中不可避免要接觸金屬容器，金屬離子的存在可能影響產(chǎn)品的品質(zhì)和功效，因此本實(shí)驗(yàn)探究了金屬離子對(duì)LPH抗氧化活性的影響。如圖6所示，K+的加入對(duì)LPH的DPPH自由基清除率無(wú)顯著性影響（P＞0.05），而加入Ca2+和Cu2+后，隨著金屬離子濃度的增加，LPH的自由基清除活性也有所提升，在2 mmol/L Ca2+和Cu2+作用下，自由基清除率分別從85.30%升高至90.15%和88.38%。此外，低濃度Zn2+能夠提高LPH的自由基清除率，但當(dāng)濃度繼續(xù)增大至1和2 mmol/L時(shí)，自由基清除率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這結(jié)果與張翀[35]研究報(bào)道的當(dāng)Zn2+濃度為5 mmol/L時(shí)，大黃魚(yú)抗氧化肽的DPPH自由基清除率顯著低于其他離子處理組類似，這可能是由于高濃度的Zn2+能影響肽分子上的氫原子和電子轉(zhuǎn)移，離子相互作用使肽的作用位點(diǎn)遭到屏蔽。因此LPH加工和保存過(guò)程中要盡量減少與富含Zn2+的材料接觸。

圖6 金屬離子對(duì)LPH抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on antioxidant activity of LPH

2.3.4 體外胃腸道消化對(duì)LPH抗氧化活性的影響口服抗氧化肽要發(fā)揮功效勢(shì)必受到消化酶的影響，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶等。在消化酶作用下肽類物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，并對(duì)其生理活性產(chǎn)生影響。LPH的體外模擬胃腸道消化結(jié)果如圖7所示，在1 h的模擬胃液消化和3 h的模擬腸液消化過(guò)程中，肽的DPPH自由基清除活性較穩(wěn)定，至消化結(jié)束時(shí)，自由基清除率與初始時(shí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與蔡金秀等[29]研究報(bào)道的馬面魚(yú)皮膠原抗氧化肽在經(jīng)過(guò)胃液和腸液消化后抗氧化活性分別降低至初始值的89.99%和80.53%相比，LPH具有較好的胃腸道穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)長(zhǎng)PH中的肽極少含有一些消化酶的潛在裂解位點(diǎn)，也可能是經(jīng)消化后得到的小分子肽依然具有良好的抗氧化活性，而馬面魚(yú)皮膠原抗氧化肽中部分強(qiáng)活性的肽片段被水解成疏水性較低的游離氨基酸。

圖7 模擬胃腸道消化對(duì)LPH抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activity of LPH

2.4 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的抗氧化活性

體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但并不能真實(shí)反應(yīng)LPH在生物體內(nèi)的作用。因此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型對(duì)LPH的活性進(jìn)行深入研究。

2.4.1 LPH對(duì)Caco-2的細(xì)胞毒性 如圖8所示，在12.5～400 μL/mL的LPH作用下，Caco-2細(xì)胞存活率均大于90.0%且與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)，LPH對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)毒性。

圖8 LPH對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.8 Cytotoxicity of LPH in Caco-2 cells

2.4.2 MTT測(cè)LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞活力的影響 本實(shí)驗(yàn)使用H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞模型來(lái)探究LPH是否對(duì)Caco-2細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。如圖9所示，H2O2具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，經(jīng)650 μmol/L H2O2預(yù)處理4 h的陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞存活率顯著下降至58.02%（P＜0.05），而加入LPH能呈濃度依賴性地增加細(xì)胞存活率，在400 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率已恢復(fù)至83.40%，說(shuō)明LPH能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，顯著提高細(xì)胞活力（P＜0.05）。這結(jié)果與彭新顏等[9]研究報(bào)道的中、高劑量組的藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚(yú)皮抗氧化肽段能夠顯著提高Caco-2細(xì)胞的存活率類似，這可能是因?yàn)榭寡趸哪軌蚯宄^(guò)量的自由基，修復(fù)損傷的氧化系統(tǒng)并通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和刺激抗氧化酶活性來(lái)保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。選擇100、200、400 μg/mL的樣品濃度進(jìn)行接下來(lái)的研究。

圖9 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effect of LPH on the cell viabilty of H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.3 LPH對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響 作為能量代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物，活性氧的過(guò)量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[36]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DCFH-DA熒光探針結(jié)合熒光分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞釋放ROS的影響，結(jié)果如圖10所示，空白組中的正常細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的ROS，經(jīng)H2O2處理后，被氧化損傷的細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，H2O2模型組中ROS的熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），而用LPH處理能夠呈濃度依賴性地降低ROS的產(chǎn)量，400 μg/mL樣品組的ROS產(chǎn)量已降至模型組的51.9%。這結(jié)果與Zhang等[26]研究報(bào)道的大豆蛋白酶解物能夠顯著降低由H2O2引起的胞內(nèi)ROS堆積類似，這可能是由于攝入LPH后，抗氧化酶如SOD、CAT的表達(dá)得到提高，ROS被及時(shí)清除，同時(shí)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化得到抑制，從而有效防止了有害的ROS流入細(xì)胞。

圖10 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of LPH on ROS generation in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.4 LPH對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響 線粒體是ROS的主要來(lái)源和靶點(diǎn)，也是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的膜蝕變的早期目標(biāo)之一，包括通透性改變、膜電位喪失和促凋亡蛋白的釋放[37]。JC-1探針是一種親脂性陽(yáng)離子染料，能夠選擇性地進(jìn)入線粒體，隨著膜電位的降低，顏色從紅色變?yōu)榫G色。如圖11所示，在空白對(duì)照組的正常細(xì)胞中，JC-1以聚合物的形式存在，呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，而在陽(yáng)性對(duì)照中，由于細(xì)胞被H2O2損傷，線粒體膜電位下降，JC-1為單體形式，出現(xiàn)大量呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞。但經(jīng)過(guò)100、200 μg/mL LPH的處理，綠色熒光細(xì)胞的比例逐漸下降，在400 μg/mL時(shí)已恢復(fù)至正常細(xì)胞水平，在顯微鏡下幾乎看不見(jiàn)呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞，這可能是由于LPH可以通過(guò)減少胞內(nèi)ROS堆積和脂質(zhì)氧化來(lái)保護(hù)線粒體膜的完整性，緩解線粒體功能障礙[8]。

圖11 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.11 Effects of LPH on mitochondrial membrane potential of H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.5 LPH對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平的影響 細(xì)胞膜受損時(shí)，原本穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性來(lái)評(píng)估細(xì)胞受損程度。由圖12可知，H2O2使細(xì)胞嚴(yán)重受損，上清中LDH活力由空白組的14.19 U/L增加至109.46 U/L，而經(jīng)不同濃度LPH處理后，LDH活力呈濃度依賴性顯著下降（P＜0.05），當(dāng)LPH濃度增加至400 μg/mL時(shí)，LDH活力已與空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于過(guò)量的自由基造成細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷，而LPH能夠抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化，修復(fù)受損的細(xì)胞膜并保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，緩解了H2O2引起的細(xì)胞氧化損傷[9]。

圖12 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞上清中LDH水平的影響Fig.12 Effect of LPH on LDH activity in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.6 LPH對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響 以SOD為代表的抗氧化酶能夠中和在ATP生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的ROS，對(duì)酶系統(tǒng)具有保護(hù)作用，常用來(lái)測(cè)定細(xì)胞氧化損傷程度[38]。如圖13所示，H2O2具有強(qiáng)氧化性和滲透性，能夠直接破壞細(xì)胞內(nèi)的大分子并造成細(xì)胞器的損傷，模型組中SOD活力相比空白組顯著下降（P＜0.05），而LPH能夠顯著增加SOD活力（P＜0.05），在100 μg/mL濃度下，細(xì)胞內(nèi)SOD活力已經(jīng)和空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而當(dāng)肽的濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，SOD活力甚至顯著高于空白組水平（P＜0.05）。這結(jié)果與張翀[35]研究報(bào)道的大黃魚(yú)蛋白源抗氧化肽可顯著抑制由H2O2引起的HepG2細(xì)跑內(nèi)SOD活性的下降類似，表明LPH能夠修復(fù)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，降低自氧化速率，緩解為了清除大量自由基而產(chǎn)生的酶促反應(yīng)造成的抗氧化酶活性下降。

圖13 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響Fig.13 Effect of LPH on SOD activity in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.7 LPH對(duì)細(xì)胞內(nèi)CAT活性的影響 CAT催化H2O2分解成氧和水，從而保護(hù)細(xì)胞免受H2O2引起的氧化損傷[39]。如圖14所示，H2O2處理后過(guò)量的ROS造成內(nèi)源抗氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)CAT活力顯著降低至空白組的71.85%（P＜0.05），但經(jīng)LPH作用后，CAT活力呈濃度依賴性增加，當(dāng)LPH的濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，CAT活力可恢復(fù)至空白組的95.40%，和空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要以酶的形式存在，自由基直接攻擊酶蛋白使其肽鏈斷裂或?qū)е聜?cè)鏈氨基酸殘基的氧化和過(guò)氧化，蛋白功能性喪失使得CAT酶活力降低，而LPH通過(guò)清除自由基來(lái)保護(hù)CAT的活性[40]。

圖14 LPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)CAT活性的影響Fig.14 Effect of LPH on CAT activity in H2O2-induced Caco-2 cells

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用木瓜蛋白酶水解僅去除內(nèi)臟的鱸魚(yú)制備抗氧化肽，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)測(cè)得LPH的DPPH、ABTS+自由基清除率的IC50分別為2.13 mg/mL和31.53 μg/mL，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。進(jìn)一步對(duì)其抗氧化活性的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，LPH具有良好的pH和熱穩(wěn)定性。在0.25～2 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，K+對(duì)LPH的DPPH自由基清除率沒(méi)有明顯影響，Ca2+和Cu2+能夠增加自由基清除率，但是高濃度的Zn2+會(huì)降低LPH的DPPH自由基清除活性。在模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)中，LPH展現(xiàn)出良好的抗氧化穩(wěn)定性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，LPH能夠增加被H2O2氧化損傷的Caco-2細(xì)胞的存活率，顯著減少ROS的產(chǎn)生（P＜0.05），細(xì)胞線粒體膜電位得到恢復(fù)，因細(xì)胞膜損傷而釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH水平顯著降低（P＜0.05），抗氧化酶SOD和CAT的活力增強(qiáng)，證明了LPH在生物學(xué)功能上的抗氧化潛力，為其在食品保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。