姚文生，茍紫慧，劉登勇 ，張明成，楊 晶，蔡瑩暄，吳慧穎

（1.渤海大學(xué)，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013；2.渤海大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；3.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；4.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095）

醬鹵肉制品因其獨(dú)特的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受年輕消費(fèi)者喜愛(ài)，但其貨架期短，容易變質(zhì)。超過(guò)貨架期的肉制品不僅微生物超標(biāo)，物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，同時(shí)其風(fēng)味感官特性也有所改變。因此，醬鹵肉制品的貨架期的預(yù)測(cè)不僅是注重健康的消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，同時(shí)也是生產(chǎn)公司將其推向市場(chǎng)面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。

目前常用的肉類新鮮度的檢測(cè)方法有揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）[1]、菌落總數(shù)[2]、近紅外光譜法[3]、電子鼻[4]和電化學(xué)傳感器[5]等。由于這些方法需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，使得操作變得較為繁瑣。頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）[6-8]是一種新興的技術(shù)，可用于測(cè)定食品中關(guān)鍵香氣成分的含量[9-10]，分析肉制品風(fēng)味化合物變化進(jìn)而判斷肉制品的貨架期。與傳統(tǒng)的方法相比，HS-GC-IMS具有響應(yīng)速度快，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[11]；已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域[12]、環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域[13]、食品領(lǐng)域，如食品新鮮度評(píng)價(jià)、食品風(fēng)味鑒別和食品摻假鑒別等方面[14-15]。Cavanna等[16]使用SPME-GC-IMS選擇并鑒定了不同批次雞蛋的揮發(fā)性物質(zhì)，成功地對(duì)新鮮雞蛋樣品和非新鮮雞蛋樣品進(jìn)行了區(qū)分。這些結(jié)果表明，GCIMS可用于建立不同貨架期的食品風(fēng)味指紋圖譜，PCA是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可以結(jié)合HS-GCIMS對(duì)肉制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

本研究以鴨鎖骨為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，首先通過(guò)pH、菌落總數(shù)等理化與微生物指標(biāo)確定其貨架期；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)GC-IMS技術(shù)鑒定其貯藏過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化規(guī)律，建立貨架期指紋圖譜，為生產(chǎn)公司提供貨架期檢測(cè)新的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬鹵鴨鎖骨 遼寧聞天香食品有限公司，室溫下儲(chǔ)存0、2、4、6、8 d，分別取三個(gè)平行樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；氯化鈉 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鉀分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；鹽酸 分析純，錦州古城化學(xué)試劑有限公司；硼酸 分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；氧化鎂 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮 分析純，國(guó)藥公司；PCA培養(yǎng)基青島科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

FE20 pH計(jì)、ME104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；LRH-150L生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；K9840凱氏定氮 山東海能科學(xué)儀器有限公司；Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 G.A.S.Gesellschaft für analytische Sensorsysteme mbH公司；T25均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床、DHG-9240A電熱恒溫干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZM-69L-II立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化性質(zhì)測(cè)定 pH的測(cè)定：按照GB 5009.237-2016《食品pH值的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定：依據(jù)GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半自動(dòng)凱氏定氮法。

水分含量的測(cè)定：按照GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法并稍作修改，取樣質(zhì)量為1.000 g左右，設(shè)置烘箱溫度為105 ℃烘至恒重。

菌落總數(shù)的測(cè)定：依據(jù)GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》并稍作修改，取樣10.000 g于滅菌的90 mL生理鹽水中，搖床振搖1 h。其余與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一致。

1.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 樣品制備 取儲(chǔ)藏0、2、4、6、8 d的鴨鎖骨可食用部位于絞肉機(jī)中攪碎，稱取2.0 g樣品于20 mL頂空瓶中，每個(gè)樣品三個(gè)平行。

1.2.2.2 HS-GC-IMS測(cè)定條件 2.0 g樣品直接加入20 mL頂空瓶中，孵育溫度為60 ℃，孵育時(shí)間20 min，色譜分離采用FS-SE-54-CB-1毛細(xì)管柱（15 m×0.53 mm，1 μm膜厚），保持在60 ℃。氮?dú)庾鳛檩d氣，從2 mL/min開(kāi)始，持續(xù)2 min，然后在8 min增加到20 mL/min，在10 min增加到130 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用儀器配套的分析軟件LAV（Laboratory Analytical Viewer，LAV）和GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的2014 NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。運(yùn)用LAV中Reporter和Gallery插件程序構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物的差異圖譜和指紋圖譜。采用Origin 2019b軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），并生成PCA圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化與微生物指標(biāo)結(jié)果

為了評(píng)估鴨鎖骨產(chǎn)品貨架期，對(duì)常溫下不同儲(chǔ)藏時(shí)間的產(chǎn)品進(jìn)行了理化指標(biāo)的測(cè)定。主要有pH、TVB-N、菌落總數(shù)和水分含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

pH對(duì)于微生物的生長(zhǎng)有重要影響，所以在肉制品新鮮度的檢測(cè)中pH是一項(xiàng)重要指標(biāo)[17]。如圖1A所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，pH呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵趦?chǔ)藏的過(guò)程中乳酸菌的生長(zhǎng)導(dǎo)致的[18]。第6 d以后，pH出現(xiàn)了上升趨勢(shì)，推斷微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生胺類物質(zhì)導(dǎo)致pH上升[19]。

TVB-N是判定肉質(zhì)腐敗的另一個(gè)重要依據(jù)，指肉制品中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶或者微生物的作用下分解成氨、揮發(fā)性胺等堿性含氮物質(zhì)，可用來(lái)衡量肉制品中蛋白質(zhì)的降解程度[20]，判斷肉制品的新鮮度。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 2707-2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》和前人的研究成果[21-23]，肉及肉制品中TVB-N的標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)鮮肉≤15 mg/100 g；二級(jí)鮮肉≤20 mg/100 g。從圖1B中可以看出第6 d的含量為21.1±1.21 mg/100 g，已經(jīng)不再新鮮不可食用。

水分含量與肉質(zhì)的新鮮度也存在一定的關(guān)系，當(dāng)水分含量高時(shí)，容易滋生微生物，造成微生物的繁殖進(jìn)而影響變質(zhì)程度[24]。從圖1C中也可以看出隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加，水分含量也呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。

隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，細(xì)菌滋生繁殖從而加速了肉的變質(zhì)，因此菌落總數(shù)可以作為評(píng)判肉制品微生物污染狀態(tài)的一個(gè)重要依據(jù)[25]。根據(jù)GB 2726-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》中的規(guī)定，熟肉制品可接受水平的菌落總數(shù)限量值為1×104CFU/g，而最高安全限量值為1×105CFU/g[26]，即lg CFU/g為5。從圖1D中可以看出第6 d為5.82±0.08 lg CFU/g，已經(jīng)超過(guò)國(guó)標(biāo)規(guī)定。綜合四個(gè)理化指標(biāo)判定鴨鎖骨的貨架期為不超過(guò)6 d。

圖1 室溫儲(chǔ)存過(guò)程中鴨鎖骨理化指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of physical and chemical indexes of duck clavicle during room temperature storage

2.2 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

2.2.1 不同儲(chǔ)藏時(shí)間下鴨鎖骨特征揮發(fā)性成分的差異分析 運(yùn)用GC-IMS技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨樣本進(jìn)行揮發(fā)性成分差異，圖2為二維差異圖。

采用HS-GC-IMS方法對(duì)不同貯藏時(shí)間鴨鎖骨樣品揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行分析，得到貨架期前后樣品中風(fēng)味物質(zhì)及其變化規(guī)律。為了更加明顯比較不同樣品的差異，選取其中第0 d樣品的譜圖作為參比，其他樣品的譜圖扣減參比，得到GC-IMS分析得出的風(fēng)味物質(zhì)差異圖2。結(jié)果顯示，不同儲(chǔ)藏天數(shù)的鴨鎖骨中風(fēng)味物質(zhì)的種類存在明顯差異，隨著儲(chǔ)藏天數(shù)增加，風(fēng)味物質(zhì)也逐漸增多。

圖2 不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨中風(fēng)味物質(zhì)GC-IMS 2D差異圖Fig.2 GC-IMS 2D difference of flavor substances in clavicle of ducks with different storage time

為了更清晰地突出不同儲(chǔ)藏時(shí)間風(fēng)味物質(zhì)差異性，運(yùn)用LAV分析軟件分析，得到不同儲(chǔ)藏天數(shù)下鴨鎖骨三維譜圖，見(jiàn)圖3?？v坐標(biāo)為氣相色譜保留時(shí)間，橫坐標(biāo)為離子遷移譜遷移時(shí)間。垂直線表示反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP），紅色點(diǎn)代表反應(yīng)離子峰。RIP峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表一種風(fēng)味物質(zhì)。白色表示濃度低，紅色表示濃度高，顏色越深，濃度越高?？梢郧宄乜闯霾煌A藏階段揮發(fā)性化合物的差異。與第0 d樣品相比，隨著貯藏時(shí)間的增加，產(chǎn)品中的風(fēng)味物質(zhì)明顯增加?？傮w而言，風(fēng)味物質(zhì)總量和含量明顯隨著貯藏時(shí)間的增加而增加。這可能是由于在貯藏過(guò)程中，尤其是貨架期前后食品腐敗變質(zhì)會(huì)釋放出一些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

圖3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨風(fēng)味物質(zhì)GC-IMS 3D圖Fig.3 GC-IMS 3D image of duck clavicle flavor substances at different storage times

2.2.2 特征性風(fēng)味物質(zhì)的定性 利用GC-IMS library Search 1.0.3軟件中的2014NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，如圖4。橫坐標(biāo)代表遷移時(shí)間，縱坐標(biāo)表示保留時(shí)間，用數(shù)字標(biāo)記出的每一個(gè)點(diǎn)代表定性出的一種物質(zhì)。可以明確定性的揮發(fā)性物質(zhì)有52種單體以及部分物質(zhì)的二聚體，結(jié)果如表1，圖4中編號(hào)與表1中物質(zhì)一一對(duì)應(yīng)。

圖4 揮發(fā)性組分的定性結(jié)果Fig.4 Qualitative results of volatile components

由圖4和表1的定性分析可以發(fā)現(xiàn)，識(shí)別出的物質(zhì)主要包括12種醛、13種醇、7種酮、8種酯、6種酸、2種吡嗪、2種呋喃、1種胺和1種碳?xì)浠衔锕?2種化合物（表1）。醛類物質(zhì)有丙醛、異丁醛、異戊醛、庚醛、戊醛、丁醛和苯甲醛等。醛類物質(zhì)具有較低的香氣閾值，這些物質(zhì)是影響鴨鎖骨風(fēng)味的主要因素[27]。庚醛可能由油酸氧化所得，與鴨鎖骨中令人愉快的肉香味有關(guān)[28]；異戊醛有酸敗變質(zhì)的氣味[29]。醇類物質(zhì)有乙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇等，醇類物質(zhì)大多數(shù)是由不飽和脂肪降解產(chǎn)生的，還有一部分可能是通過(guò)醛類物質(zhì)還原得到[30]。酮類物質(zhì)有2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和2-庚酮等。奶香味的3-羥基-2-丁酮是美拉德反應(yīng)的羰基化合物，可能來(lái)自于油酸氧化或者葡萄糖分解代謝[31]。酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯等。酯是由肌肉組織中脂肪氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸的相互作用形成的[32]。吡嗪是肉制品中最重要的香味呈味物質(zhì)，具有肉香味和烤香味[33]，來(lái)自于還原糖和氨基酸之間的美拉德反應(yīng)。

表1 室溫條件下不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨特征風(fēng)味物質(zhì)定性分析Table 1 Qualitative analysis of characteristic flavor substances of clavicle of duck under different storage time at room temperature

對(duì)室溫條件下不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如表2所示。在貯藏初期（0、2 d），2-甲基丁酸、庚醛、丁酸乙酯等物質(zhì)含量明顯高于后期；在超出貨架期（6 d）時(shí)，可以看到2,3-丁二酮、丙酸、N-亞硝基甲基乙基胺等物質(zhì)含量在6 d時(shí)顯著（P＜0.05）增加，說(shuō)明鴨鎖骨的變質(zhì)導(dǎo)致了這些物質(zhì)的含量增加。

表2 室溫條件下不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨特征風(fēng)味物質(zhì)定量分析Table 2 Characteristic flavor material quantitative analysis of duck clavicle under the condition of different storage time at room temperature

2.2.3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間下鴨鎖骨特征揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜 為了更加全面對(duì)比不同儲(chǔ)藏時(shí)間揮發(fā)性化合物組分差異性，運(yùn)用LAV軟件中Galleryplot插件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。得到鴨鎖骨指紋圖譜圖5。

圖5顯示了不同儲(chǔ)藏天數(shù)鴨鎖骨的指紋圖譜，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。可以看出鴨鎖骨在相同儲(chǔ)藏時(shí)間的揮發(fā)性物質(zhì)濃度差異小，組內(nèi)相似度高，而不同儲(chǔ)藏時(shí)間的揮發(fā)性物質(zhì)濃度差異大，組間相似度低。其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要以醇、醛、酮、酯類化合物為主。該產(chǎn)品未添加防腐劑且在室溫下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存初期（紅色框內(nèi)）揮發(fā)性物質(zhì)主要是異丁醛、戊醛*、庚醛、丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸丙酯、庚醛*、4-甲基-2-戊酮、乙醇、2-甲基丁酸、丙醛等物質(zhì)，且隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加含量逐漸減少；儲(chǔ)藏后期（粉色框內(nèi)）正戊醇、乙酸異戊酯和異丁醇等風(fēng)味物只有第6 d出現(xiàn)，（綠色框內(nèi)）揮發(fā)性組分以酮、酸類化合物為主，如2,3-丁二酮、N-亞硝基甲基乙基胺、2,3-戊二酮、丁酸、丙酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)的生成可能是因?yàn)檠趸冑|(zhì)以及蛋白質(zhì)分解。肉制品在加工儲(chǔ)存的過(guò)程中，氧化是導(dǎo)致變質(zhì)的一個(gè)重要原因[34]。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增多，這些物質(zhì)的生成可以表示腐敗變質(zhì)，可以作評(píng)估貨架期風(fēng)味變化的特征標(biāo)記物質(zhì)。丙酸、N-亞硝基甲基乙基胺、順-3-己烯-1-醇、丙酮醇、異丁醇第6 d開(kāi)始出現(xiàn)，根據(jù)理化指標(biāo)結(jié)果判定這些物質(zhì)的出現(xiàn)與變質(zhì)有關(guān)。丁酸、2-甲基吡嗪、2,3-戊二酮前6 d含量較低，第8 d含量增多。GC-IMS技術(shù)得到的不同儲(chǔ)藏時(shí)間風(fēng)味指紋圖譜，對(duì)評(píng)價(jià)鴨鎖骨的新鮮度有參考意義。

續(xù)表2

圖5 室溫條件下不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜Fig.5 Fingerprints of volatile substances in clavicle of ducks at different storage times at room temperature

2.2.4 不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨風(fēng)味物質(zhì)變化分析 為了更加直觀地分析不同儲(chǔ)藏時(shí)間的鴨鎖骨風(fēng)味物質(zhì)的變化，進(jìn)行了PCA主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6A可以看出，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了77.2%，室溫儲(chǔ)藏條件下，貨架期0、2、4、6、8 d的鴨鎖骨樣品組內(nèi)分別相對(duì)集中于一定的范圍，各組之間具有明顯的間距，能夠很好的區(qū)分不同的儲(chǔ)藏時(shí)間的樣品，結(jié)果表明儲(chǔ)藏時(shí)間相同的樣品重復(fù)性較好，儲(chǔ)藏時(shí)間不同的鴨鎖骨特征風(fēng)味物質(zhì)特異性較明顯。圖6A和圖6B結(jié)合可以看出0 d主要集中在第一象限，2和4 d集中在第四象限，6 d集中在第二象限，8 d集中在第三象限，超出貨架期后主要風(fēng)味物質(zhì)有乙酸異戊酯、異丁醇、丙酮醇、N-亞硝基甲基乙基胺、2-甲基吡嗪*等，與前述指紋圖譜所得結(jié)論一致。

圖6 不同儲(chǔ)藏時(shí)間鴨鎖骨PCA分析（A）和不同方差的載荷圖（B）Fig.6 PCA analysis (A) and loading maps with different variances (B) of duck clavicle at different storage time

3 結(jié)論

本文以醬鹵鴨鎖骨為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)探究了室溫條件下不同貯藏時(shí)間其pH、TVB-N、菌落總數(shù)和水分含量等指標(biāo)的變化規(guī)律。貯藏時(shí)間達(dá)到第6 d時(shí)，結(jié)果顯示TVB-N含量和菌落總數(shù)都超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)最高安全限量值，因此可以判定鴨鎖骨產(chǎn)品貨架期為不超過(guò)6 d。在此基礎(chǔ)上，采用HS-GC-IMS技術(shù)結(jié)合PCA分析方法對(duì)鴨鎖骨貯藏過(guò)程中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了分析鑒定。GC-IMS技術(shù)共鑒定出52種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要有醇類、醛類、酮類與酯類等物質(zhì)。指紋圖譜與PCA結(jié)果顯示2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮*、N-亞硝基甲基乙基胺、2,3-戊二酮、丁酸、丙酸是鴨鎖骨超過(guò)貨架期后的主要特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)可以作為判定鴨鎖骨超過(guò)貨架期標(biāo)記性物質(zhì)。與傳統(tǒng)方法相比，GC-IMS技術(shù)具有檢測(cè)限低、常壓操作、無(wú)需樣品預(yù)處理和分析時(shí)間更短等很多優(yōu)勢(shì)，基于該技術(shù)建立的鴨鎖骨貨架期指紋圖譜可以為生產(chǎn)公司提供新的技術(shù)參數(shù)。后續(xù)可以結(jié)合同位素標(biāo)記等手段針對(duì)其貨架期前后風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制進(jìn)行探索研究。