李善瑞，趙璐玲，嚴(yán)文靜，章建浩

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，共有B1、B2、G1、G2、M1、M2等18種結(jié)構(gòu)，以黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的毒性最強(qiáng)[2]。因低劑量即可導(dǎo)致肝臟致癌性，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFB1列為Ⅰ類致癌物[3]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）評(píng)估全世界約25% 農(nóng)產(chǎn)品因受霉菌毒素污染而報(bào)廢，其中黃曲霉毒素為主要污染物之一[4]。針對(duì)AFB1的嚴(yán)重危害性，如何安全有效地降低其污染水平成為了食品行業(yè)亟待解決的難題。AFB1結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在食品基質(zhì)中一旦產(chǎn)生，便會(huì)持續(xù)存在[5]，268 ℃高溫下才可分解。目前，AFB1的降解技術(shù)根據(jù)作用原理可分為化學(xué)、生物和物理降解法，化學(xué)和生物降解法雖可有效地降低AFB1的含量，但是處理后AFB1降解產(chǎn)物安全性以及可能引發(fā)的食品安全問(wèn)題為人們所擔(dān)憂，仍需進(jìn)一步的毒理學(xué)、安全學(xué)以及營(yíng)養(yǎng)學(xué)分析評(píng)估[6-7]；傳統(tǒng)物理降解技術(shù)有輻照、紫外光催化以及臭氧熏蒸法，輻照處理下AFB1降解率一般較低，采用20 kGy的輻照劑量處理花生粕，降解率僅為14.4%[8]，相同輻照劑量下處理AFB1含量為7.5 μg/kg的苦蕎飯，降解率為33.6%[9]，此外，輻照設(shè)備的成本較高，且長(zhǎng)時(shí)間使用對(duì)于操作人員的健康存在威脅。紫外波長(zhǎng)為362 nm的紫外光可以激發(fā)AFB1的活性從而促進(jìn)其降解，但是由于穿透深度低、波長(zhǎng)窄以及具有殘留毒性，紫外線降解AFB1的應(yīng)用受到限制[10]；臭氧熏蒸法通常長(zhǎng)時(shí)間處理才具有良好的降解效果，劉玉蘭等[11]采用臭氧熏蒸玉米胚80 min，AFB1降解率為72.27%，花生油中采用此法降解AFB1，40 min降解率為82.43%[12]。

相對(duì)于傳統(tǒng)物理降解技術(shù)造價(jià)高，耗時(shí)長(zhǎng)，難以達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)中快速降解AFB1含量的局限性，近年來(lái)，低溫等離子體作為一項(xiàng)新興技術(shù)，以其安全高效、非熱加工、無(wú)殘留[13]等優(yōu)點(diǎn)受到了食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。根據(jù)其放電類型可將其分為介質(zhì)阻擋放電（Dielectric barrier discharge，DBD）、輝光放電、電暈放電和射流放電四種。低溫等離子體中含有大量高能活性粒子（H·、OH·、HO2·等）[14-15]，已被證實(shí)可用于真菌如黃曲霉菌[16]的滅活以及多種毒素如黃曲霉毒素[17]、嘔吐毒素[18]、以及T-2毒素[19]的降解。

目前報(bào)道的低溫等離子體設(shè)備峰值電壓較低且不可調(diào)頻，高峰值電壓可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)，可能會(huì)提高AFB1降解效能。此外，頻率作為影響低溫等離子設(shè)備活性物質(zhì)產(chǎn)生速率的另一重要因素，不同研究中對(duì)于其與活性物質(zhì)的生成速率的關(guān)系解釋不同 ，將頻率作為AFB1降解效能的影響因素并探究其與峰值電壓交互關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本研究采用DBD低溫等離子體設(shè)備，選取峰值電壓、工作頻率、作用時(shí)間作為單因素試驗(yàn)條件，以AFB1降解率作為衡量指標(biāo)，采用響應(yīng)面研究各因素的交互作用機(jī)制，并探究此技術(shù)在黃曲霉毒素陽(yáng)性檢出率較高的（3.5%～73%）[20]主要污染物玉米中的降解效果，從而為食品行業(yè)中的黃曲霉毒素污染提供新的解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米 市售；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 新加坡普瑞邦生物工程有限公司；甲醇 色譜級(jí)，乙腈色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；三氟乙酸 色譜級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；正已烷 色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高純氮?dú)猓兌取?9.999%） 南京特種氣體廠。

介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體設(shè)備 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合南京蘇曼等離子體工程研究院研發(fā)；PriboFast?226多功能凈化柱 新加坡普瑞邦生物工程有限公司；水浴氮吹儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；高速多功能粉碎機(jī) 武義海納電器有限公司；LC-20 AD高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC） 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 樣品包裝：6孔板中加入1000 μg/L的AFB1溶液，置于包裝盒（聚丙烯，145 mm×91 mm×22 mm）內(nèi)密封包裝。

樣品處理：將包裝后的樣品放入DBD低溫等離子體設(shè)備上下兩極板之中，使其緊貼樣品包裝盒表面進(jìn)行處理。

樣品衍生：參照《GB 5009.22-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》[21]中高效液相色譜-柱前衍生法進(jìn)行衍生后待測(cè)。

1.2.2 HPLC條件 參照劉真等[22]的條件并稍作修改，具體為色譜柱：InertSustain? C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈:水（V:V=30:70）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：12 min，熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別配制濃度為0、2.5、5、10、20、50、100、500、1000 μg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=138995.50x-1071189.75，R2=0.9984，具有良好的線性擬合關(guān)系，可用于定量分析。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 固定單因素條件：峰值電壓160 kV、工作頻率50 Hz、作用時(shí)間180 s，分別考察不同峰值電壓（60、80、100、120、140、160 kV）、工作頻率（50、80、110、140、170、200 Hz）、作用時(shí)間（30、60、90、120、150、180 s）對(duì)AFB1降解率的影響，并結(jié)合降解率確定最佳因素水平。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 采用Center Composite Design（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型進(jìn)行條件優(yōu)化，響應(yīng)曲面因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor level design of response surface test

1.2.6 玉米中AFB1降解效果研究

1.2.6.1 染毒玉米樣品制備及處理 玉米染毒：HPLC測(cè)得實(shí)驗(yàn)所用原料玉米中AFB1為1.05 μg/kg，為獲得AFB1污染陽(yáng)性樣本[23]，向50g玉米中加入0.5 mL AFB1甲醇溶液（1000 μg/L），混合均勻，于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)近干。

染毒玉米樣品低溫等離子體處理：將50 g玉米置于包裝盒內(nèi)，采用1.2.1同種處理方式進(jìn)行低溫等離子體處理。

玉米中AFB1提?。河衩讟悠方?jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)0.85 mm孔徑篩，稱取5.00 g加入20 mL乙腈:水（V:V=86:14）高速攪拌2 min后，定性濾紙過(guò)濾，取8 mL濾液經(jīng)PriboFast?226凈化柱純化，50 ℃水浴氮吹純化液近干，衍生條件同1.2.1，加入500 μL流動(dòng)相復(fù)溶后待測(cè)。

1.2.6.2 低溫等離子體處理?xiàng)l件 選取1.2.5中優(yōu)化后得出的最佳峰值電壓和工作頻率，考察不同作用時(shí)間（30、60、90、120、150、180 s）對(duì)玉米中AFB1降解率的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

高效液相色譜平行三次測(cè)定AFB1含量。采用Origin 2022進(jìn)行圖形繪制，IBM SPSS Statistics 2.0進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析；P＜0.01表示差異極顯著。結(jié)合Design-Expert v 8.0.6中CCD模型進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 峰值電壓對(duì)AFB1降解率的影響 根據(jù)圖1可知，AFB1降解率隨著峰值電壓的增加極顯著升高（P＜0.01），與Siciliano等[24]的研究結(jié)果一致。峰值電壓為60 kV時(shí)，AFB1降解率為14.11%，HPLC法測(cè)得其含量為858.88±51.39 μg/L，當(dāng)峰值電壓由80 kV增加至100 kV時(shí)，AFB1含量極顯著下降至96.65±9.77 μg/L（P＜0.01），此時(shí)，降解率為90.34%。降解率隨峰值電壓的升高而增加的原因可能是峰值電壓的提高導(dǎo)致介質(zhì)阻擋放電兩電極極板間的電場(chǎng)強(qiáng)度增大，自由電子崩解速度和強(qiáng)度增加，電子轟擊和氣體解離及電離的能力增強(qiáng)，從而提高了活性基團(tuán)（如OH·、H·）的形成速度，加速了AFB1的降解[14,25]。當(dāng)峰值電壓提高至160 kV時(shí)，AFB1濃度降至15.97±1.73 μg/L，降解率達(dá)到最大值98.40%。綜上，峰值電壓最佳選擇范圍為120～160 kV。

圖1 不同峰值電壓對(duì)AFB1降解率的影響Fig.1 Effects of different peak voltages on the degradation rate of AFB1

2.1.2 工作頻率對(duì)AFB1降解率的影響 根據(jù)圖2可知，當(dāng)頻率為50 Hz時(shí)，AFB1的降解率達(dá)到最大值94.52%，此時(shí)HPLC法測(cè)得其濃度為55.73±10.55 μg/L，與王玉[26]和王翠華[27]在研究頻率對(duì)微囊球藻毒素的降解效果中得到的50 Hz處理效果最佳的結(jié)論一致。隨著頻率在140～200 Hz范圍內(nèi)的持續(xù)提高，AFB1的濃度分別為426.62±52.42、764.03±2.84、794.61±23.95 μg/L，均極顯著高于50 Hz處理組（P＜0.01），且降解率極顯著下降（P＜0.01），表明工作頻率的提高降低了AFB1的降解率，這可能與頻率的改變導(dǎo)致的活性物質(zhì)生成速率有關(guān)，Yuji等[28]與汪超[29]發(fā)現(xiàn)頻率的提升可以促進(jìn)脈沖放電等離子體射流中活性物質(zhì)的產(chǎn)生，然而Wang等[30]發(fā)現(xiàn)頻率的降低可以增加低溫等離子體射流的放電強(qiáng)度從而促進(jìn)活性物質(zhì)的生成，可知等離子體激發(fā)方式不同對(duì)于活性物質(zhì)生成速率影響不同，因此推測(cè)本研究中頻率的上升會(huì)導(dǎo)致DBD型低溫等離子體活性物質(zhì)生成速率的下降，從而導(dǎo)致AFB1的降解率下降。綜上，工作頻率的選取范圍為50～110 Hz。

圖2 不同工作頻率對(duì)AFB1降解率的影響Fig.2 Effects of different working frequencies on the degradation rate of AFB1

2.1.3 作用時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響 根據(jù)圖3可知，低溫等離子體處理極顯著降低各處理組AFB1濃度（P＜0.01）。30 s作用時(shí)間下，AFB1降解率為87.45%，相較于紫外處理200 μg/L的AFB1溶液，33 min 50%左右的降解效果[31]，低溫等離子體可在短時(shí)間內(nèi)快速降低AFB1含量[32-33]。60 s作用時(shí)間下，AFB1濃度下降為26.74±5.57 μg/L，120 s內(nèi)濃度回升至68.80±0.73 μg/L，降解率相比60 s下降了4.35%。可見，AFB1殘留量并非隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)上升，Nishimwe等[34]與杜黎等[35]采用低溫等離子體降解AFB1時(shí)也出現(xiàn)濃度有所回升的現(xiàn)象。150～180 s作用時(shí)間內(nèi)濃度下降至最低值6.14±0.17 μg/L，此時(shí)降解率為99.39%。綜上，作用時(shí)間選取范圍為120～180 s。

圖3 不同作用時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響Fig.3 Effects of different treatment times on the degradation rate of AFB1

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 響應(yīng)面作為一種研究相關(guān)參數(shù)和獨(dú)立參數(shù)之間關(guān)系的有效統(tǒng)計(jì)方法，不僅可以減少試驗(yàn)次數(shù)并且可根據(jù)單因素條件選定水平[36-37]，前期由單因素條件選定峰值電壓、工作頻率、作用時(shí)間的最佳取值范圍，根據(jù)CCD模型設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 CCD設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design scheme and result of CCD

2.2.2 模型方差分析 根據(jù)表3可知，模型中選取的A、B、C三因素與響應(yīng)值Y之間均存在著顯著性關(guān)系，且模型本身顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.2542＞0.05），說(shuō)明該模型構(gòu)建合理[38]，同時(shí)R2=0.9781，R2adj=0.9500，說(shuō)明模型擬合程度和相關(guān)性良好，變異系數(shù)（CV=3.79%）說(shuō)明各變量間相對(duì)離散程度極小，同時(shí)，A、B、C影響均極顯著（P＜0.01），A與B交互作用極顯著（P＜0.01），A2與C2分別顯著（P＜0.05）。綜上，本模型能夠較好的應(yīng)用于低溫等離子體對(duì)于AFB1降解效果的理論預(yù)測(cè)。根據(jù)F值可知，三因素對(duì)于AFB1降解率的影響次序分別為A（峰值電壓）＞B（工作頻率）＞C（作用時(shí)間）。

表3 低溫等離子體降解AFB1模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of AFB1 degradation model by cold plasma

2.2.3 回歸方程的構(gòu)建與交互作用分析 經(jīng)Design-Expert v 8.0.6 擬合出的多項(xiàng)式回歸方程為Y=-271.21699+3.29080A-1.76423B+2.12084C+9.19375×10-3AB-1.07292×10-3AC-1.69028×10-3BC-0.011711A2+2.56197×10-3B2-5.70469×10-3C2，因峰值電壓與工作頻率之間兩者交互作用極顯著（P＜0.01），為量化兩者交互作用關(guān)系變化對(duì)AFB1降解率的影響，對(duì)多項(xiàng)式回歸方程計(jì)算得到的結(jié)果如表4、表5所示。

表4 不同峰值電壓下工作頻率對(duì)AFB1降解率的影響Table 4 Effects of working frequency on the degradation rate of AFB1 at different peak voltages

表5 不同工作頻率下峰值電壓對(duì)AFB1降解率的影響Table 5 Effects of peak voltage on the degradation rate of AFB1 at different working frequencies

由圖4可知，峰值電壓與工作頻率之間的響應(yīng)面交互作用圖傾斜程度明顯，結(jié)合方差分析結(jié)果可知兩者之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），當(dāng)固定峰值電壓不變時(shí)，AFB1的降解率隨工作頻率的升高，曲面整體向下傾斜，表明工作頻率的升高會(huì)導(dǎo)致AFB1降解率的下降；固定工作頻率不變時(shí)，隨著峰值電壓的升高，曲面圖逐漸陡峭，表明峰值電壓的增高可以促進(jìn)AFB1的降解。根據(jù)表4回歸方程分析結(jié)果可知，當(dāng)作用時(shí)間趨近于0水平時(shí)，工作頻率對(duì)于AFB1降解率的影響值隨著峰值電壓的升高，其臨界值逐漸下降，兩者之間呈反比例關(guān)系（y=-1.78x+391.36，R2=1），峰值電壓在120～160 kV的范圍內(nèi)升高，AFB1的降解率增加幅度明顯，與其單因素結(jié)果一致。由表5對(duì)工作頻率與峰值電壓的回歸方程分析結(jié)果可知，峰值電壓的臨界值隨工作頻率的增加而增加，兩者之間呈正比例關(guān)系（y=0.39x+133.63，R2=1），且工作頻率的增加會(huì)總體導(dǎo)致AFB1降解率的下降，但下降幅度較為平緩，與工作頻率中50～110 Hz范圍內(nèi)，其降解率無(wú)顯著性的差異結(jié)果一致。

圖4 峰值電壓與工作頻率交互作用圖Fig.4 Interaction diagram of peak voltage and working frequency

2.2.4 CCD模型優(yōu)化條件驗(yàn)證 由CCD模型得到的峰值電壓、工作頻率、作用時(shí)間的最佳優(yōu)化參數(shù)分別為157.16 kV、50.05 Hz、165.18 s，此時(shí)AFB1降解率的預(yù)測(cè)值為100%，為簡(jiǎn)便實(shí)際操作，選定峰值電壓160 kV、工作頻率50 Hz、作用時(shí)間165 s，三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出AFB1濃度為3.8±1.2 μg/L，降解率為99.62%±0.12%，與預(yù)測(cè)值結(jié)果相差0.38%，表明該模型擬合效果良好，具有實(shí)際參考意義。

2.3 低溫等離子體作用時(shí)間對(duì)玉米中AFB1降解效果的影響

根據(jù)2.2.4中CCD模型優(yōu)化結(jié)果選取峰值電壓160 kV，工作頻率50 Hz作為固定條件，探究不同作用時(shí)間下低溫等離子體對(duì)于玉米中AFB1的降解效果，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同作用時(shí)間對(duì)玉米中AFB1降解效果的影響Fig.5 Effects of different treatment time on AFB1 degradation in corn

根據(jù)圖5可知，低溫等離子體處理濃度為23.35±0.79 μg/kg的玉米陽(yáng)性樣品30 s時(shí)，AFB1降解率為7.25%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米中AFB1降解率在180 s極顯著上升至39.29%（P＜0.01），優(yōu)于常壓等離子體處理1.25 μg/kg玉米樣品10 min時(shí)65%的降解效果[39]。此時(shí)HPLC 法測(cè)得玉米中AFB1剩余含量為14.17±0.05 μg/kg，低于《GB 2761-2017 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[40]對(duì)玉米中AFB1限量（20 μg/kg）。此外，目前報(bào)道的利用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)低溫等離子體降解AFB1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析時(shí)，發(fā)現(xiàn)AFB1的主要致毒基團(tuán)雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)消失，降解產(chǎn)物相較AFB1毒性降低[17,39,41]。同時(shí)，與溶液中AFB1的降解效果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其降解效率低于溶液中相同時(shí)間下90%以上的降解效果。玉米與溶液中降解效果不同可能是由于溶液中的AFB1在處理時(shí)可以充分暴露于低溫等離子體中，但玉米表面不平整，加標(biāo)于玉米中的AFB1無(wú)法與低溫等離子體充分接觸所造成的[35]。

3 結(jié)論

本文研究了低溫等離子體激發(fā)條件（峰值電壓、工作頻率、作用時(shí)間）對(duì)溶液中AFB1的降解效果，并通過(guò)CCD模型優(yōu)化工藝參數(shù)，在最優(yōu)峰值電壓與工作頻率下，探究其在主要污染物玉米中的降解效果，結(jié)論如下：與對(duì)照組相比，溶液中AFB1降解率隨峰值電壓的升高、工作頻率的下降、作用時(shí)間的延長(zhǎng)分別極顯著上升（P＜0.01）。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明在峰值電壓為160 kV、工作頻率50 Hz、作用時(shí)間165 s的條件下，AFB1降解率達(dá)到最優(yōu)值99.62%，此時(shí)HPLC測(cè)得濃度為3.8±1.2 μg/L。低溫等離子體處理玉米陽(yáng)性樣品180 s時(shí)AFB1降解率為39.29%，表明低溫等離子體技術(shù)在玉米中對(duì)AFB1仍具有降解效果。綜上，低溫等離子體技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)降低AFB1污染水平，工業(yè)化應(yīng)用前景廣闊，但仍需深入大通量處理食品的低溫等離子體設(shè)備研發(fā)以滿足實(shí)際生產(chǎn)要求。