尚鵬程，許嬌，鐘晶，畢雷

成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心檢驗科，成都 610000

干擾素治療慢性乙型肝炎（CHB，簡稱慢乙肝）較傳統(tǒng)藥物治療有明顯的優(yōu)勢，但仍有許多需要解決的問題，如缺少用于優(yōu)勢人群篩選、療效評估以及預后評判的有效實驗室指標等［1］。CD64（FcγRI）是一種免疫球蛋白Fc 受體的跨膜糖蛋白，可以高親和力結合單體IgG 型抗體，在細菌感染以及類風濕關節(jié)炎病患者外周血中性粒細胞表面表達上調，作為細菌感染性疾病的診斷指標在臨床已被廣為使用［2-3］。近年研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，在巨細胞病毒以及HBV等感染患者CD64 的表達與健康人群不同，但CHB患者外周血細胞表面CD64 表達量變化與干擾素治療慢乙肝的療效是否有關目前仍無文獻報道。本研究通過比較干擾素治療前后慢乙肝患者外周血不同亞群細胞表面CD64 表達量差異，分析干擾素治療不同時間CHB 患者外周血淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量與HBV-DNA、ALT、HBsAg 的相關性，為下一步探討外周血淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量是否能用于評估干擾素治療效果提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年6月—2021年3月在成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心就診的CHB 患者57 例，納入標準：ALT＞2 ULN、HBV-DNA＜2×108IU/mL、HBsAg 定量＜25 000 IU/mL，且接受干擾素單獨/聯(lián)合/序貫治療的CHB 患者。排除標準：伴有肝硬化、肝癌、自身免疫性肝病、肝功能失代償、HCV/HIV 感染以及研究資料缺失。按e 抗原表達不同分為e 抗原陽性組33 例，男18 例、女15 例，年齡（28.5 ± 10.6）歲，ALT （156.9 ± 132.4）U/L、HBsAg （18 976.5 ± 16 981.7）IU/mL、HBV-DNA（6.8 ± 0.75）lgIU/mL；e 抗原陰性組24 例，男15 例、女9 例，年齡（34.1 ± 13.9）歲，ALT （106.3 ±100.5）U/L、HBsAg（15 643.9 ± 16 324.3）IU/mL、HBV-DNA （5.8 ± 1.5）lgIU/mL；兩組間性別、年齡、ALT、HBsAg以及HBV-DNA差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。收集同期體檢健康人員16例為對照組，男10 例、女6 例，年齡（34.7 ± 12.2）歲。三組年齡性別有可比性。

1.2 外周血淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 檢測 CHB 患者在干擾素治療前，治療8 周、12 周、24周和48 周時，取晨起空腹EDTA-K2抗凝外周靜脈血50 μL，依次加入試劑（CD3-FITC、CD64-PE、CD14-ECD、CD45-PECY5.5，購自貝克曼庫爾特）各5 μL，混勻后避光孵育15 min，加300 μL 紅細胞裂解液，避光作用15 min，加300 μL 生理鹽水混勻后上貝克曼庫爾特DxFlex 流式細胞儀檢測。在SSC-CD45 圖上設置中性粒細胞門和淋巴細胞門、在CD14-CD45圖上設置單核細胞門，在CD64-CD45 圖上分析上述三群細胞表面CD64表達量。

1.3 外周血ALT、HBsAg、HBeAg 和HBV-DNA 的檢測 CHB 患者在干擾素治療前、8 周、12 周、24 周和48 周時，分別檢測ALT、HBsAg、HBeAg 和HBVDNA。其中，ALT 采用丙氨酸底物法，使用日立Cobas008As全自動生化分析儀及其配套試劑；HBsAg、HBeAg 采用化學發(fā)光法，使用萬泰全自動化學發(fā)光分析儀CARIS200及其配套試劑；HBV-NDA 采用Rt-PCR 法，使用廈門安普利全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng)及其配套試劑。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.02 統(tǒng)計軟件。正態(tài)性分析采用Shapiro-Wilk 檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey 法；計數(shù)資料用頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。相關性采用Pearson 相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組干擾素治療不同時間外周血淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 的表達量比較 干擾素治療前，CHB 組外周血淋巴細胞表面CD64 和中性粒細胞表面CD64 表達量高于對照組，t值依次為3.318、3.149，P均＜0.05。e抗原陽性組、e抗原陰性組以及對照組間淋巴細胞表面CD64 表達量比較，F(xiàn)=3.413，P＜0.05，其中e 抗原陽性組與對照組，e 抗原陰性組與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；而e 抗原陽性組與e 抗原陰性組間比較，P＞0.05。e 抗原陽性組、e 抗原陰性組以及對照組間中性粒細胞表面CD64 表達量比較，F(xiàn)=6.591，P均＜0.05，其中e抗原陽性組與對照組，e抗原陽性組與e抗原陰性組間比較，P均＜0.05；e抗原陰性組與對照組比較，P＞0.05。

與干擾素治療前相比，淋巴細胞表面CD64 表達量在CHB 患者中逐漸降低且24 周和48 周水平差異具有統(tǒng)計學意義（t分別為1.532 0、0.979 9、3.717 0、10.500 0，P分別為0.146 3、0.346 5、0.002 1、＜0.000 1）；在e抗原陽性組（t分別為0.401 5、1.149 0、2.764 0、5.317 0，P分別為0.692 1、0.265 5、0.003 4、＜0.000 1）和e 抗原陰性組也存在同樣趨勢（t分別為0.755 1、0.796 6、1.411 0、13.260 0，P分別為0.334 1、0.470 3、0.231 1、0.000 2）。中性粒細胞表面CD64 表達量在CHB 組（t分別為0.423 1、1.101 0、1.498 0、5.321 0，P分別為0.653 2、0.224 5、0.148 7、＜0.000 1）、e抗原陽性組（t分別為0.826 1、1.152 0、1.939 0、5.072 0，P分別為0.421 7、0.271 8、0.071 6、0.000 2）和e抗原陰性組（t分別為0.280 5、0.242 6、0.474 6、1.922 0，P分別為0.793 0、0.820 3、0.659 8、0.127 0）中也呈現(xiàn)遞減趨勢，但僅在48 周時，CHB 組和e 抗原陽性組中差異有統(tǒng)計學意義。干擾素治療不同時間各組淋巴細胞、中性粒細胞CD64表面表達量見表1。

表1 干擾素治療不同時間各組淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64表達量（±s）

表1 干擾素治療不同時間各組淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64表達量（±s）

組別CHB組淋巴細胞表面CD64中性粒細胞表面CD64治療前治療8周治療12周治療24周治療48周e抗原陽性組912.73 ± 103.22 860.79 ± 101.88 874.92 ± 173.85 608.42 ± 293.79 272.65 ± 26.27 3 314.40 ± 945.73 3 480.55 ± 944.66 2 765.05 ± 851.52 2 547.48 ± 943.62 1 190.61 ± 306.75治療前治療8周治療12周治療24周治療48周e抗原陰性組913.91 ± 116.78 834.12 ± 65.64 903.00 ± 197.79 556.16 ± 283.96 280.22 ± 29.48 3 443.73 ± 828.91 3 764.39 ± 617.03 2 809.42 ± 924.18 2 366.09 ± 891.47 1 247.29 ± 305.85治療前治療8周治療12周治療24周治療48周對照組909.50 ± 65.14 940.79 ± 184.49 832.79 ± 191.65 721.98 ± 289.70 257.53 ± 12.56 814.80 ± 71.25 2 958.75 ± 985.94 2 629.05 ± 1 552.30 2 698.49 ± 1 085.07 3 635.81 ± 943.00 1 077.24 ± 388.94 2427.00 ± 742.70

2.2 CHB 患者外周血淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 表達量與ALT、HBV-DNA、HBsAg 水平的相關性 CHB 患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg 水平見表2。CHB 患者淋巴細胞表面CD64 表達量與外周血ALT 和HBsAg 水平存在正相關性（r分別為0.882 3、0.909 8，P均＜0.05）；中性粒細胞表面CD64表達量與外周血ALT和HBsAg水平亦存在正相關性（r分別為0.899 3、0.902 4，P均＜0.05）。

表2 CHB患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

表2 CHB患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

治療時間治療前治療8周治療12周治療24周治療48周ALT（U/L）147.2 ± 128.3 119.3 ± 96.8 79.3 ± 68.9 45.2 ± 36.2 16.9 ± 13.3 HBsAg（IU/mL）17827.1 ± 16 981.7 13875.4 ± 11 827.9 10004.5 ± 9 876.2 4293.6 ± 4 018.3 429.3 ± 365.3 HBV-DNA（lgIU/mL）6.5 ± 1.1 4.4 ± 1.3 3.3 ± 1.4 3.2 ± 1.3 2.5 ± 0.8

3 討論

CHB 是HBV 感染慢性化后引起的以肝臟慢性炎癥反應為特征的消化系統(tǒng)疾病，是引起肝硬化和肝細胞癌的重要原因。由于感染HBV 后肝細胞核內形成的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）使得HBV 感染后難以完全根除。目前以核苷類似物和干擾素治療為代表的抗病毒治療可以實現(xiàn)長期抑制病毒甚至達到臨床治愈的目標。干擾素治療CHB 可以提高HBsAg 清除率和HBeAg 血清轉換率。雖然HBsAg 定量用于指導干擾素治療已寫入多個指南，但在HBsAg 定量臨床應用時仍有許多問題亟需解決，如預測停用核苷類藥物HBsAg 血清清除的起始治療時血清HBsAg 濃度和監(jiān)測頻率、預測HBsAg 清除1年后發(fā)生HBeAg 清除的HBsAg 濃度等。此外，在干擾素治療CHB 優(yōu)勢患者的篩選和過程中治療方式的調整以及治療結束后患者遠期療效的判斷等方面需要有更精確的檢測指標。近年研究［6］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-FcγR 相互作用在抗體介導的病毒清除中起關鍵作用，通過對該途徑的進一步研究有助于發(fā)現(xiàn)病毒性感染疾病治療的新策略。

CD64即FcγRI型，對IgGFc有高親和性，可以促進樹突狀細胞抗原交叉提呈和T 細胞活化，介導體內的ADCC 以及有助于IgG 依賴的中和作用等。研究［7］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRI可以觸發(fā)各種過敏性和自身免疫性疾病的模型，如過敏反應、類風濕性關節(jié)炎或氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB 患者外周血淋巴細胞及中性粒細胞表面CD64 表達量上調，與FENG 等［8］報道結果一致，推測CHB患者在HBV特異抗體的介導下通過上調CD64 表達，啟動天然和適應免疫的多種機制（抗體依賴的細胞介導的細胞毒性、補體溶解或吞噬作用），以清除HBV病毒。

通過分析HBeAg 表達不同CHB 患者外周血淋巴細胞表面CD64的表達量，發(fā)現(xiàn)e抗原陽性組、e抗原陰性組以及對照組間淋巴細胞表面CD64 的表達量存在統(tǒng)計學差異。接下來通過對三組間淋巴細胞表面CD64 表達量的比較，發(fā)現(xiàn)e 抗原陽性組與對照組，e 抗原陰性組與對照組間均存在統(tǒng)計學差異，e抗原陽性組患者外周血淋巴細胞表面CD64 表達量高于e抗原陰性組患者，推測e抗原陽性組患者免疫系統(tǒng)通過上調淋巴細胞表面CD64 表達，利用Fc-FcγR 軸觸發(fā)對HBV 更強的免疫反應，能更有效地清除HBV 感染的靶細胞。而淋巴細胞表面CD64 表達量在e 抗原陽性組與e 抗原陰性組間的差異無統(tǒng)計學意義，可能與機體免疫反應較e 抗原的陰轉延遲有關，也有可能與研究對象的數(shù)量較少有關。對e 抗原表達不同CHB 患者外周中性粒細胞表面CD64 表達量進行分析，也發(fā)現(xiàn)e 抗原陽性組的中性粒細胞表面CD64 高于e 抗原陰性組和對照組，提示e 抗原陽性組患者粒細胞CD64 表達上調，增強粒細胞及其產(chǎn)物分子誘導機體對乙肝病毒的適應性免疫應答，CD64 分子介導的機體對HBV 免疫應答的具體分子機制還有待進一步研究。

對干擾素治療不同時間的淋巴細胞表面CD64和中性粒細胞表面CD64 表達量分析發(fā)現(xiàn)，隨著療程延長，淋巴細胞表面CD64 和中性粒細胞表面CD64 表達量都呈現(xiàn)出下降趨勢，并且與HBsAg 和ALT 均相關，其中淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64與HBsAg 的相關性與淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 與ALT 相當。另外，與干擾素治療前比較，淋巴細胞表面CD64 表達量在干擾素治療24 周時下降，中性粒細胞表面CD64 表達量在干擾素治療48周時下降，提示淋巴細胞表面CD64 較中性粒細胞表面CD64 可能更適合用于干擾素療效的評估，其具體應用價值還有待進一步研究。淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 與HBV-DNA 未發(fā)現(xiàn)有相關性，由于抗病毒治療后HBV-DNA 在4 周時迅速下降而淋巴細胞、中性粒細胞表面CD64 則分別在24 周和48周時下降，提示病原學指標較免疫學指標變化快。

綜上所述，CHB 患者外周血淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量升高，干擾素治療后淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量下降；淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量與HBsAg 和ALT 水平正相關。由于本研究納入的研究對象數(shù)量較少，其結果對CHB 患者外周血細胞表面CD64 指導干擾素臨床應用的價值有限，下一步將擴大樣本量，觀察干擾素治療不同時間CHB 患者外周血淋巴細胞和中性粒細胞表面CD64 表達量，同時探討CHB 患者外周血細胞表面CD64 表達量對干擾素治療CHB 效果的評估效能。