何爽，夏依代·圖爾蓀，孫紅光，劉璐，葉飛，王宇婷，李瑞，苗蕾

1 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊830000；2 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)疾控中心；4 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

痛風(fēng)是一種炎癥性關(guān)節(jié)炎，由于血清尿酸（SUA）水平過高，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸鈉結(jié)晶沉積從而引發(fā)的炎癥性疾?。?］。近年痛風(fēng)患病率正在逐漸升高［2］，有資料顯示，中國部分地區(qū)的痛風(fēng)患病率已達(dá)2.6%［3］。在所有國家中男性的痛風(fēng)患病率明顯高于女性，是女性的2～6 倍［4］。痛風(fēng)受到眾多因素的影響，除了已知的環(huán)境因素如高嘌呤飲食、飲酒和吸煙外，遺傳因素也參與痛風(fēng)的發(fā)生，識別遺傳因素對于提高痛風(fēng)的病因診斷和治療是必要的［5］。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）研究［6］表明，普通人群的痛風(fēng)發(fā)展與常見的基因突變有關(guān)。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人類可遺傳變異中最為常見的一種，在所有已知的可遺傳變異中占比高達(dá)90%，在多因素疾病研究中具有重要意義。大量的研究發(fā)現(xiàn)了與痛風(fēng)疾病發(fā)病存在相關(guān)的許多SNP［7］。

PDZ 蛋白激酶1（PDZK1）是一種已在腎臟、肝臟、小腸和腎上腺皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞骨架蛋白，其并不直接參與血尿酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，而是與許多尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用以控制尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)［8-9］。人PDZK1 基因位于lq21，存在多個SNP 位點(diǎn)，某些功能性位點(diǎn)的變異可以影響PDZK1 蛋白的表達(dá)。rs12129861 位點(diǎn)位于PDZK1 基因上游約2 kb，可能會影響PDZK1的基因表達(dá)水平，不同個體rs12129861 基因型的不同可能導(dǎo)致尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)效率的不同［10］。GWAS 顯示，，尿酸濃度的個體差異可能使得PDZK1 基因產(chǎn)生變異，從而導(dǎo)致個體間痛風(fēng)發(fā)病率的不同［10］。以上提示PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點(diǎn)可能與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)，可能通過影響尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能導(dǎo)致尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率的差異。新疆烏魯木齊市漢族男性痛風(fēng)是否與PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點(diǎn)的SNP 有關(guān)目前仍未見報道，本研究以新疆烏魯木齊市301 例漢族男性痛風(fēng)患者與514 例漢族男性體檢健康人群作為研究對象，對PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)等位基因和基因型分布頻率進(jìn)行分析，并比較了所有研究對象中不同基因型人群的尿酸濃度，以明確rs12129861（A/G）位點(diǎn)SNP 多態(tài)性是否與痛風(fēng)發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，并采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)是否影響熒光素酶基因的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018—2020年在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院就診的漢族男性痛風(fēng)患者301 例（痛風(fēng)組），年齡（47.64 ± 12.48）歲，入選者符合國際風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）2015年制定的痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)；同時選擇同時期在上述三家醫(yī)院體檢的男性體檢健康者514 例（對照組），年齡（46.15 ± 13.15）歲，兩組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。痛風(fēng)組尿酸（512.85 ± 134.00）μ mol/L、葡萄糖（5.82 ± 1.86）mmol/L、尿素氮（5.72 ±3.68）mmol/L、肌酐（96.22 ± 54.28）μmol/L、甘油三酯（1.99 ± 1.53）mmol/L、總膽固醇（4.57 ±1.11）mmol/L，收縮壓（125.56 ± 13.34）mmHg、舒張壓（81.11 ± 11.12）mmHg。對照組尿酸（344.70 ±55.05）μmol/L、葡萄糖（5.34 ± 1.19）mmol/L、尿素氮（5.83 ± 15.27）mmol/L、肌 酐（85.90 ±13.00）μmol/L、甘油三酯（1.71 ± 1.17）mmol/L、總膽固醇（4.65 ± 0.89）mmol/L，收縮壓（124.66 ±13.31）mmHg、舒張壓（76.25 ± 9.51）mmHg。痛風(fēng)組尿酸、葡萄糖、肌酐、甘油三酯以及舒張壓值高于對照組（P均＜0.05），兩組尿素氮、總膽固醇以及收縮壓相比較，P均＞0.05。本次研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者在納入研究前均給予知情同意。

1.2 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點(diǎn)基因型分析 采用多重?zé)晒釶CR 法。研究對象禁食12 h后于清晨采集空腹靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，采用全血基因組DNA 提取試劑盒（北疆百泰克公司）提取DNA，使用紫外分光光度儀進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測，質(zhì)檢合格的樣本稀釋至50 ng/μL，放于-80 ℃冰箱保存。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查詢到rs12129861（A/G）位點(diǎn)的序列信息，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計引物，由上海天昊公司合成。上游引物序列：5′-GCTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，下游引物序列：5′-GGCAGGAGAATCACTTGAA-3′。PCR 反應(yīng)條件：在20 g/L 瓊脂凝膠電泳中，95 ℃2min→94 ℃ 20 s→65 ℃ 40 s→72 ℃ 1.5 min，共11個循環(huán)，94 ℃ 20 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 1.5 min，24 個循環(huán)，72 ℃ 2 min。擴(kuò)增結(jié)束后，由上海天昊公司采用SNP 分型技術(shù)對所有樣本進(jìn)行rs12129861（A/G）位點(diǎn)基因多態(tài)性及基因的分型分析。

1.3 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)活性的檢測 采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)。查閱NCBI 數(shù)據(jù)庫，得到rs12129861 位點(diǎn)的序列具體信息，采用基因合成法合成基因，然后以合成基因?yàn)槟０暹M(jìn)行基因擴(kuò)增得到長度大約為1 013 bp 的DNA片段?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、2 min，72 ℃、1 min，25個循環(huán)?；驍U(kuò)增后的產(chǎn)物和pGL3-promotor 質(zhì)粒用T4DNA 連接酶（TaKa-Ra 公司）置于16 ℃連接0.5～1 h，獲得pGL3-rs12129861（A/G）-promotor 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒加入裝有TOP10 感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，在管中加入SOC 液體培養(yǎng)基使細(xì)胞復(fù)蘇、表達(dá)PDZK1 基因rs12129861 位點(diǎn)，然后接種到LB 培養(yǎng)基（含Ap 抗生素）上。培養(yǎng)12～16 h 后篩選菌落進(jìn)行基因擴(kuò)增驗(yàn)證，對目的基因序列進(jìn)行基因測序，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將胰酶消化過的HEK293T 細(xì)胞用10% DMEM 完全培養(yǎng)基按照每孔0.5×105～2×105個細(xì)胞的密度接種在24 孔細(xì)胞板上，于含5% CO2的37 ℃溫箱中孵育8～24 h，細(xì)胞完全貼壁后可開始瞬時轉(zhuǎn)染。將1 μg 的rs12129861 位點(diǎn)質(zhì)粒和200 ng內(nèi)參照pRL-TK（海腎熒光素酶報告載體）以及2.4 μL TurboFect 混合，加入到200 μL Opti-Medium內(nèi)，室溫孵育15 min。按照TurboFect 試劑盒（Ther-mo 公司）說明書，配制TurboFect-DNA Mix，將其加入到上述含有單層HEK293T 細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕搖混勻，繼續(xù)孵育。37 ℃孵育8～12 h 后，換成含有血清且已經(jīng)經(jīng)過37 ℃預(yù)熱的培養(yǎng)基。共轉(zhuǎn)48 h 后，收集細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。每個孔用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞1 次后，加入100 μL 裂解液裂解15 min。每個酶標(biāo)板孔內(nèi)20 μL 裂解液以及100 μL熒光素酶檢測試劑Ⅱ（PROMEGA 公司），用酶標(biāo)儀記錄測定值；加入熒光素酶湮滅劑100 μL，記錄測定值。以海腎熒光素酶（Ranilla luciferase）作內(nèi)參照，消除實(shí)驗(yàn)操作帶來的變化因素，增加可比性。兩次數(shù)值的比值為熒光素酶相對活性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用頻次或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；利用Hardy-Weinberg 平衡性檢驗(yàn)確認(rèn)此次所采樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)的基因型和基因頻率與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風(fēng)發(fā)病的關(guān)系

2.1.1 痛風(fēng)組與對照組PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)的基因型和基因頻率比較PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)在新疆地區(qū)漢族人群中達(dá)到穩(wěn)定遺傳狀態(tài)，具有代表性（χ2=0.427，P＞0.05）。痛風(fēng)組 PDZK1 基因rs12129861（A/G）位點(diǎn)AA、GA、GG 基因型分別有6例（1.99%）、80 例（26.58%）、215 例（71.43%）。對照組PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位點(diǎn)AA、GA、GG 基因型分別有24 例（4.67%）、189 例（36.77%）、301 例（58.56%）。兩組間AA、GA、GG 基因型分布頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.633，P＜0.01）。痛風(fēng)組等位基因A 頻次為 92（27.96%），等位基因G 頻次為237（72.04%）；對照組等位基因A 頻次為510（41.50%），等位基因G 頻次為719（58.50%）。PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)等位基因A 和G 在兩組間的分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，痛風(fēng)組等位基因G 頻次高于對照組（χ2=14.236，P＜0.01）。攜帶G 等位基因的個體患痛風(fēng)的OR值為1.661（95%CI：1.274～2.165），攜帶A 等位基因的個體患痛風(fēng)的OR值為0.602（95%CI：0.462～0.785）。

2.1.2 PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位點(diǎn)不同基因型分組的一般性臨床指標(biāo)比較 血清尿酸濃度在不同基因型分組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011），經(jīng)兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，A/A 組與G/G 組間、G/A組與G/G組間血清尿酸濃度的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），其中G/G組血尿酸濃度大于其余兩組。葡萄糖、尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇、收縮壓、舒張壓在各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

基因型A/A G/A G/G尿酸（μmol/L）369.11 ± 89.58 392.94 ± 125.23 415.763 ± 122.33葡萄糖（mmol/L）5.50 ± 1.65 5.46 ± 1.28 5.56 ± 1.61尿素氮（mmol/L）5.22 ± 1.79 6.50 ± 21.14 5.42 ± 2.79肌酐（μmol/L）89.02 ± 37.07 88.32 ± 18.05 90.21 ± 40.70甘油三酯（mmol/L）2.00 ± 1.50 1.78 ± 1.16 1.79 ± 1.27總膽固醇（mmol/L）4.77 ± 0.84 4.67 ± 0.96 4.58 ± 0.99收縮壓（mmHg）125.93 ± 16.75 125.36 ± 12.78 124.57 ± 13.11舒張壓（mmHg）77.07 ± 10.11 77.94 ± 9.28 77.86 ± 10.68

2.2 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)的基因型和基因頻率與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風(fēng)發(fā)病關(guān)系的驗(yàn)證 pGL3-rs12129861（G）-promotor重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性為5.046，pGL3-rs12129861（A）-promotor 重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性為9.160。與pGL3-promotor 空載質(zhì)粒比較，目的序列rs12129861 含G、A 等位基因的重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性分別是pGL3-promotor 的5.001 倍（P＜0.01）和9.078 倍（P＜0.01），pGL3-rs12129861（A）-promotor 重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性是pGL3-rs12129861（G）-promotor 重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性的1.815倍（P＜0.01）。

3 討論

目前痛風(fēng)的病因涉及多種因素，包括細(xì)胞因子、易感基因和基因突變，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。痛風(fēng)遺傳模式十分復(fù)雜，盡管在對發(fā)病機(jī)制和治療進(jìn)展的理解上取得了重大進(jìn)展，但痛風(fēng)的發(fā)病率仍在增加，許多患者的疾病控制不佳［11］。環(huán)境和遺傳因素均可影響痛風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展。GWAS 表明，常見的基因突變使一般人群更易患痛風(fēng)［12］。基因表達(dá)調(diào)控可以在不同水平、多個階段進(jìn)行，曾有一項GWAS 研究系統(tǒng)地評估與疾病病因有關(guān)的常見（＞1%患病率）遺傳變異的基因組［13］，這些變異基因的作用通常較弱，大多數(shù)通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄處理發(fā)揮作用，但調(diào)控基因表達(dá)最有效的方法是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行。多項流行病學(xué)研究顯示，遺傳因素在原發(fā)性痛風(fēng)中具有重要作用，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20 多個遺傳易感位點(diǎn)［14］，PDZK1 就是其中之一。有GWAS顯示PDZK1 基因rs12129861 位點(diǎn)與尿酸水平相關(guān)。rs12129861 位于PDZK1 基因上游約2 kb 處屬于基因啟動子區(qū)，可能影響PDZK1 的基因表達(dá)水平。基因啟動子區(qū)是參與特定基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控的DNA 序列［14］，包含第一外顯子上游的核心啟動子區(qū)、較遠(yuǎn)端的調(diào)節(jié)啟動子區(qū)、遠(yuǎn)端調(diào)控序列（增強(qiáng)子與抑制子）及基因間的邊界元件或隔離成分（隔離子），是調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的重要區(qū)域，但并不編碼蛋白。變異的基因啟動子區(qū)可能會通過影響靶基因蛋白的表達(dá)，從而改變了靶基因在人體中顯示出的生物學(xué)功能，我們前期已經(jīng)通過查閱NCBI 數(shù)據(jù)庫篩選出候選基因并利用SNP 分型實(shí)驗(yàn)對可能影響候選基因表達(dá)的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，本研究中需要進(jìn)行驗(yàn)證的陽性位點(diǎn)就出自我們已經(jīng)篩選建立出的SNP 位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

痛風(fēng)是一種由尿酸水平升高引起的常見關(guān)節(jié)炎疾病，尿酸水平升高是痛風(fēng)的一個重要獨(dú)立危險因素。PDZK1 基因已被確定與尿酸濃度有關(guān)，PDZK1作為支架蛋白并不直接參與血尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)，而是通過調(diào)控多個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對尿酸排泄產(chǎn)生影響，因此如果影響了PDZK1 蛋白的表達(dá)那么很可能會影響尿酸濃度從而影響痛風(fēng)的發(fā)生。目前已知PDZK1 能夠與尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（URAT1）和腎臟尿酸分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈉離子依賴磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1（NPT1）相互作用影響血尿酸水平。URAT1 由SLC22A 家族中的SLC22A12 基因編碼，被認(rèn)為是介導(dǎo)腎臟近端小管頂端側(cè)尿酸鹽重吸收的重要分子［15］。SLC17A1編碼的NPT1 通過鈉離子的協(xié)同作用將尿酸從腎小管上皮細(xì)胞頂面轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，是負(fù)責(zé)尿酸排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一。

本研究PDZK1基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性檢驗(yàn)，說明該位點(diǎn)在新疆地區(qū)漢族人群中達(dá)到穩(wěn)定遺傳狀態(tài)，具有代表性。本研究還發(fā)現(xiàn)PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861的基因型分布頻率和等位基因分布頻率在痛風(fēng)組和對照組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中G等位基因在痛風(fēng)組分布的頻率為72.04%，在對照組的分布頻率為58.5%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，攜帶G 等位基因的個體患痛風(fēng)的OR值為1.661。在不同基因型分組下，G/G 基因型組尿酸的濃度最高，與其他組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點(diǎn)SNP 可能與新疆地區(qū)漢族男性人群的痛風(fēng)有一定的關(guān)系，G 等位基因可能是痛風(fēng)發(fā)病的危險因素。在此基礎(chǔ)上利用雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)的方法，檢測PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點(diǎn)對熒光素酶基因表達(dá)活性的影響。結(jié)果顯示與空載質(zhì)粒（含Sv40 啟動子）相比，rs12129861（A/G）位點(diǎn)具有增強(qiáng)子功能，能檢測到熒光強(qiáng)度（P＜0.05）。此外，rs12129861 位點(diǎn)含等位基因G 重組質(zhì)粒的熒光素酶報告基因的表達(dá)水平與含等位基因A 重組質(zhì)粒相比顯著降低。因此含有G 等位基因的rs12129861 位點(diǎn)的增強(qiáng)子活性較低，這有可能導(dǎo)致PDZK1 蛋白表達(dá)減少，從而降低尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)率使得患痛風(fēng)的風(fēng)險增加，這與基因頻率分布比較的結(jié)果相一致。

綜上，PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點(diǎn)的SNP 可能與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風(fēng)發(fā)病有關(guān)，且?guī)в械任换騁 的個體痛風(fēng)患病風(fēng)險更高。但本次研究仍有許多不足之處，由于rs12129861位點(diǎn)屬于PDZK1 基因啟動子區(qū)并不能編碼蛋白只能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，因此并不一定能影響PDZK1 蛋白最終的表達(dá)，我們尚未發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)組患者與對照組人群的PDZK1 蛋白濃度之間的差異。有研究顯示可溶性尿酸升高可以增加PDZK1 的表達(dá)［16］，當(dāng)痛風(fēng)患者體內(nèi)血清尿酸濃度增加，為了轉(zhuǎn)運(yùn)多余的尿酸，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1 和NPT1 表達(dá)增加，作為有調(diào)控作用的支架蛋白PDZK1 蛋白的濃度反而可能升高，這為我們此后的研究提供了新的方向和思路。