陳瑞雪,易麗貞,黃麟荇,黃慧源,綻晟,岳增輝

湖南中醫(yī)藥大學 湖南 長沙 410208

在醫(yī)療水平日益發(fā)展的今天,腦卒中仍然是全球致死率較高的疾病之一,嚴重危害人類的健康。據(jù)現(xiàn)有資料顯示,2019年,腦卒中共造成655萬人死亡,且當年全球約有1.01億人發(fā)生腦卒中[1]。腦卒中所帶來的后遺癥包括失語、偏癱、吞咽困難、肢體痙攣及功能障礙等[2],也是當今醫(yī)學界的一大難題,治療所需要的費用是腦卒中患者家庭沉重的負擔。2012年,Dixon等[3]首次提出了鐵死亡的概念,直至今日,鐵死亡成為醫(yī)學眾多領(lǐng)域中疾病治療的新靶標[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究中,鐵死亡已經(jīng)被證明具有重大意義[5]。

針刺治療是一種非常具有代表性的中醫(yī)治療方式。近年來,針刺治療在腦卒中相關(guān)疾病中的療效日益凸顯,被廣泛認為是促進腦卒中康復(fù)的潛在有效治療方式[6]。為更加系統(tǒng)地了解針刺是如何在腦卒中相關(guān)鐵死亡中發(fā)揮干預(yù)作用,找到治療腦卒中的新思路,筆者將近10年相關(guān)的文獻進行了整理,希望可以為針刺治療腦卒中提供更多依據(jù)。

1 鐵死亡的概念及主要特征

鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡方式,不同于以往的細胞凋亡、焦亡、壞死及自噬。從生物化學方面而言,鐵死亡的生物能特征主要是鐵的積累和脂質(zhì)過氧化[7],具體表現(xiàn)為過量的游離Fe2+與線粒體氧化呼吸產(chǎn)物過氧化氫發(fā)生Fenton反應(yīng)致使活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量增多,抑制了谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成及谷胱甘肽過氧化物酶4(recombinant glutathione peroxidase 4,GPX4)活性,導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)受損,氧化還原失衡,毒性脂質(zhì)過氧化物大量沉積,進而促使細胞發(fā)生鐵死亡。從形態(tài)學方面來說,鐵死亡與其他細胞死亡方式的不同主要表現(xiàn)在細胞中的線粒體萎縮,細胞核卻依然保持完整[8]。具體表現(xiàn)為細胞膜破裂,線粒體內(nèi)形成氣泡隨后萎縮,線粒體嵴收縮或消失,膜密度增加,此外,雖然細胞核形狀正常,但缺少濃縮染色質(zhì)[9-10]。從遺傳基因方面看,鐵死亡受到多種遺傳因子調(diào)控,主要集中在脂質(zhì)過氧化和鐵穩(wěn)態(tài)兩方面。最新研究表明,表觀遺傳現(xiàn)象已被證實可調(diào)節(jié)包括鐵調(diào)素在內(nèi)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)鐵代謝,表觀遺傳調(diào)控因子如DNA甲基化、組蛋白乙?；蚼iRNA,積極地調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)[11]。

2 腦卒中發(fā)病過程中鐵死亡的發(fā)生機制

2.1 缺血性腦卒中發(fā)病過程中鐵死亡的發(fā)生機制缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是腦卒中最常見的類型,約占所有腦卒中的4/5[12]。由于缺血損傷,正常的大腦血供被破壞,產(chǎn)生了一系列生理、病理反應(yīng),包括線粒體死亡、壞死、炎癥、自由基釋放和神經(jīng)元過度興奮等,進而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[13]。越來越多的研究表明,鐵死亡是缺血性腦卒中病理性細胞死亡的重要機制。

2.1.1 鐵超載在大腦缺血的條件下,腦中所需的氧氣水平不斷增加,在氧的運輸過程中,鐵起著關(guān)鍵作用[14]。大腦中鐵的輸入、儲存和輸出受到嚴格的調(diào)控,其中任何步驟的改變都有可能使大腦中的鐵穩(wěn)態(tài)被擾亂,從而引發(fā)鐵的神經(jīng)毒性[15]。缺血性腦卒中觸發(fā)鐵超載的途徑是大腦外源性的[16],無外乎兩種情況:其一,鐵輸入過多。轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TRF)是負責鐵轉(zhuǎn)運的主要蛋白質(zhì)。有研究表明,轉(zhuǎn)鐵蛋白在低pH水平時對鐵的結(jié)合親和力會降低,導(dǎo)致鐵從轉(zhuǎn)鐵蛋白中解離,解離后未結(jié)合的鐵將從細胞外空間被運輸?shù)缴窠?jīng)元中,從而導(dǎo)致神經(jīng)元細胞內(nèi)鐵水平增加,進而造成神經(jīng)元鐵死亡[17]。其二,鐵輸出減少。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportin 1,FPN1)是一種跨膜蛋白,是唯一能夠從細胞中輸出鐵的蛋白質(zhì)[18]。FPN1在腦中主要在大腦皮層,海馬和小腦的神經(jīng)元中表達[19]。腦細胞內(nèi)的鐵流出是由FPN1所介導(dǎo)。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后大腦皮層和海馬中FPN1表達下調(diào),由此可見缺血性腦卒中發(fā)生后,FPN1表達的減少可能導(dǎo)致神經(jīng)元中鐵的積累,并進一步導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。

2.1.2 脂質(zhì)過氧化和脂質(zhì)代謝鐵對于神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘化和神經(jīng)遞質(zhì)生物合成至關(guān)重要,其常常以Fe2+和Fe3+的形式存在[21]。氧化損傷和抗氧化防御之間的失衡是鐵死亡的核心環(huán)節(jié),而ROS引起脂質(zhì)過氧化物的積累和氧化還原失衡是鐵死亡發(fā)生和調(diào)控的關(guān)鍵[22]。從生理上講,由于血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)提供的保護,大腦可以免受全身鐵波動的影響。然而,在急性缺血條件下,血腦屏障被破壞,這允許游離鐵和鐵蛋白進入腦實質(zhì),通過Fenton反應(yīng)將過氧化氫轉(zhuǎn)化為羥基自由基[23]。該過程顯著增加ROS的產(chǎn)生,其促進核酸、蛋白質(zhì)組和膜損傷,并最終介導(dǎo)鐵性細胞死亡[24]。具體來說,當鐵超載致使抗氧化系統(tǒng)不堪重負時,過量的自由基靶向促進敏感脂肪酸過氧化,損害了脂質(zhì)膜的完整性并誘導(dǎo)自殺信號級聯(lián)[25]。此外,還引起溶酶體膜透化和氧化還原活性鐵釋放到細胞質(zhì)中,這反過來又促進Fenton自由基的產(chǎn)生、細胞膜變性和GSH耗竭[26]。

腦細胞中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)主要存在于細胞膜上,對氧化非常敏感,可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化氫(lipid hydrogen peroxide,LOOH)和ROS的積累[27]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一類以多不飽和脂肪酸為底物的含鐵酶類,催化磷脂膜中多不飽和脂肪酸,最終形成磷脂氫過氧化物(phospholipid hydroperoxide,PLOOH),從而引起脂質(zhì)過氧化,誘發(fā)鐵死亡[28]。缺血性腦卒中發(fā)生后,脂氧合酶高度表達,其中以脂氧合酶亞型12/15-LOX與神經(jīng)元鐵死亡關(guān)系最為密切,抑制12/15-LOX可抑制鐵死亡發(fā)生[29]。另有研究表明長鏈酯酰輔酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4,ACSL4)與溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)參與磷脂酰乙醇胺的合成與重塑,故而影響脂質(zhì)過氧化物的合成,抑制其表達從而抑制鐵死亡發(fā)生[30]。ACSL4于腦組織中廣泛表達,腦缺血期間ACSL4的表達明顯增加[31]。

2.1.3 抗氧化劑耗竭、失活神經(jīng)元膜富含多不飽和脂肪酸,很容易被氧化,因此大腦中抗氧化劑的平衡十分重要[32]。GSH和GPX4是抗氧化體系中具有代表性的標志物。GSH是細胞內(nèi)唯一的Fe2+配體,能阻斷Fe2+生成高毒性的羥基自由基從而抑制鐵死亡[33]。GPX4是一種獨特的抗氧化防御酶,通過減少膜磷脂氫過氧化物抑制脂質(zhì)過氧化[11]。GSH是GPX4活性的必需物。有研究認為,鐵死亡本質(zhì)是GSH的耗竭導(dǎo)致GPX4活性下降,脂質(zhì)過氧化物不能通過GPX4催化的谷胱甘肽還原酶反應(yīng)代謝,隨后Fe2+氧化脂質(zhì)產(chǎn)生活性氧,從而促使鐵死亡的發(fā)生[34-35]。缺血性腦卒中發(fā)生時常伴隨氧化應(yīng)激,當機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時,機體會產(chǎn)生GPX4等物質(zhì)啟動抗氧化防御機制防止這種損害[36],從而減輕細胞的脂質(zhì)過氧化。同樣,抗氧化酶的缺乏反過來會導(dǎo)致鐵的積累。在缺血性中風的小鼠模型中,已經(jīng)鑒定出神經(jīng)元中降低的GSH和GPX4活性,伴隨著增強的脂質(zhì)過氧化[37]。

2.1.4 system Xc-抑制半胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(cystine/glutamate antiporter,system Xc-)是一種氨基酸抗轉(zhuǎn)運蛋白,由兩個核心成分組成:溶質(zhì)載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)和溶質(zhì)載體家族3成員2(solute carrier family 3 member A2,SLC3A2)。system Xc-存在于細胞膜,其主要功能是將細胞外的胱氨酸(cystine,Cys)轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi),并將細胞內(nèi)的谷氨酸(glutamic acid,Glu)轉(zhuǎn)至細胞外,通常按 11 的比例轉(zhuǎn)運[3],這種轉(zhuǎn)運是由細胞內(nèi)高濃度的谷氨酸所驅(qū)動的。膜轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11將細胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi),胱氨酸被進一步轉(zhuǎn)化為半胱氨酸,參與GSH的生成。在GSH存在的條件下,GPX4催化GSH和脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)高效地清除細胞內(nèi)蓄積的脂質(zhì)過氧化物,避免細胞發(fā)生鐵死亡,維持細胞的正常生理功能[38]。缺血性腦卒中后,細胞對谷氨酸的攝取量降低,細胞外囊泡和非囊泡谷氨酸的釋放量增加,造成細胞外谷氨酸水平不斷升高[39],高濃度的谷氨酸會產(chǎn)生興奮性毒性從而導(dǎo)致system Xc-被抑制,進而引發(fā)神經(jīng)細胞鐵死亡[27]。

2.2 出血性腦卒中發(fā)病過程中鐵死亡的發(fā)生機制出血性腦卒中又名腦出血(intracerebralhemorrhage,ICH),雖然其僅占腦卒中的10%～30%,但其病死率和致殘率高于缺血性腦卒中[12]。出血性腦卒中的腦損傷可大致分為兩個階段:原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。其中原發(fā)性損傷主要是由血腫壓迫和顱內(nèi)壓升高所造成的,當出血情況穩(wěn)定后,便出現(xiàn)繼發(fā)性損傷如炎癥、水腫、血紅蛋白降解和細胞死亡代謝物的毒性、血腦屏障的破壞等[16]。近年來許多研究證實出血性腦卒中與鐵死亡相關(guān)。

2.2.1 鐵超載出血性腦卒中的鐵超載主要發(fā)生在腦內(nèi),屬于內(nèi)源性[16]。出血性腦卒中時,腦血管破裂形成血腫,隨后壓迫周圍血管發(fā)生繼發(fā)性破裂,從而引起占位效應(yīng)性血腫范圍擴大[40]。血腫中積聚了大量的紅細胞,然后這些紅細胞發(fā)生溶解,釋放血紅蛋白,這樣的過程通常會持續(xù)數(shù)月[41]。血紅蛋白進一步分解后形成血紅素,血紅素通過受體進入細胞內(nèi)。在血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1) 的作用下,血紅素降解為一氧化碳、膽紅素和Fe2+,導(dǎo)致細胞內(nèi)鐵超載,從而發(fā)生鐵死亡,成為繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)元死亡的主要原因[42]。

有學者研究發(fā)現(xiàn),出血性腦卒中發(fā)病過程中的鐵超載還有其他原因:腦出血后出現(xiàn)炎癥,激活了TLR4/MyD88信號通路,從而促進白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達;同時通過JAK/STAT3途徑使鐵調(diào)素表達上調(diào),進而阻止了腦組織鐵流出,導(dǎo)致鐵超載[43]。

2.2.2 抗氧化系統(tǒng)受損出血性腦卒中發(fā)生時,腦鐵水平、ROS水平會在短時間內(nèi)迅速上升[44],鐵超載大量消耗GSH,致使抗氧化系統(tǒng)不堪重負,從而導(dǎo)致GPX4活性降低。Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)在出血性腦卒中后的24 h,大鼠腦內(nèi)的GPX4達到最低水平,并且檢測表明主要在神經(jīng)細胞中GPX4表達下調(diào),說明此時神經(jīng)細胞的抗氧化能力明顯降低。

2.2.3 花生四烯酸5脂加氧酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX5)活性增高ALOX5是LOX亞型之一,在出血性腦卒中時,ALOX5的表達明顯增高,其與多不飽和脂肪酸反應(yīng),生成過氧化脂質(zhì),從而引發(fā)神經(jīng)元細胞鐵死亡[45]。

3 針刺干預(yù)腦卒中相關(guān)鐵死亡研究進展

在目前的研究中,針刺直接調(diào)控腦卒中相關(guān)鐵死亡機制的研究還較少,針刺調(diào)控腦內(nèi)鐵代謝、抗氧化相關(guān)指標的研究較為常見。腦內(nèi)的鐵代謝異常、過氧化都與鐵死亡發(fā)生息息相關(guān),因此針刺對鐵代謝、過氧化的調(diào)控機制都對針刺調(diào)控鐵死亡的機制研究有重要意義。目前常見的相關(guān)針刺治療方式主要有電針、頭皮針、針刺及針藥結(jié)合等。

3.1 電針電針是傳統(tǒng)針灸和現(xiàn)代電刺激相結(jié)合的產(chǎn)物,目前已在臨床上廣泛應(yīng)用。電針可改善患者的神經(jīng)功能,提高患者的生活質(zhì)量[46]。電針對人體的刺激較強,而且較為穩(wěn)定,可以同時應(yīng)用于多個目標。最近研究表明,電針可以抗凋亡、抗炎、抑制自噬、降低抗氧化應(yīng)激、促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化以及神經(jīng)血管單元重塑[47]。目前在對腦卒中治療的研究中,電針對腦卒中鐵死亡調(diào)控的作用機制相對明確。Liang等[48]對腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)急性期大鼠進行電針預(yù)處理,檢測鐵代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白,結(jié)果表明電針預(yù)處理可恢復(fù)腦缺血再灌注后大腦中 FPN-1 的表達水平,提高GSH和GPX4表達,降低ROS表達,從而得出結(jié)論:電針可以通過調(diào)節(jié)鐵代謝降低腦缺血再灌注氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Li等[47]研究電針對大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠鐵死亡的抑制作用,研究結(jié)果表明電針可以顯著提高GPX4和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性以及GSH的水平,并減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)和鐵的積累。其中SOD是抗氧化系統(tǒng)的重要酶類之一,MDA是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物,其含量反映氧化應(yīng)激水平,并在一定程度上介導(dǎo)鐵死亡[49]。梁潤昱[50]研究顯示電針及電針預(yù)處理能夠調(diào)控腦缺血再灌注后鐵代謝,減少鐵超載從而減輕氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。李笑笑等[51]研究發(fā)現(xiàn)電針可減輕糖氧剝奪/復(fù)氧(oxygenglucose deprivation and reperfusion,OGD/R)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)元鐵死亡。

3.2 頭皮針頭皮針在促進急性出血性腦卒中后臨床神經(jīng)功能缺損和肢體癱瘓的恢復(fù)方面有效且安全[52]。有Meta分析研究顯示,頭皮針透刺百會是急性出血性腦卒中的潛在有效治療選擇[53]。目前頭皮針對腦卒中鐵死亡的研究主要集中在出血性腦卒中后的治療方面。Li等[54]對自體血液注射誘導(dǎo)的出血性腦卒中鼠模型進行了頭皮針療法的預(yù)防作用研究,結(jié)果顯示頭皮針治療可增加神經(jīng)細胞線粒體外膜直徑,降低細胞內(nèi)MDA和Fe2+的含量,抑制神經(jīng)元鐵死亡,其機制可能是通過促進p62/Keap1/Nrf2抗氧化信號通路引起GPX4和鐵蛋白重鏈多肽1(ferritin heavy polypeptide 1,FTH1)上調(diào),從而增強出血性腦卒中后的恢復(fù)。Kong等[55]研究表明透刺百會、曲鬢穴可使GPX4和HO-1表達增加,ROS累積減少,從而減輕腦出血后神經(jīng)元細胞鐵死亡,其機制可能是通過下調(diào)miR-23a-3p實現(xiàn)。李明月等[56]同樣選擇百會透曲鬢的針刺療法對腦出血大鼠進行治療,認為針刺可能通過抑制腦出血大鼠神經(jīng)細胞鐵死亡促進出血大鼠神經(jīng)功能修復(fù)。

3.3 針刺及針藥結(jié)合大量研究已經(jīng)證實,在腦卒中相關(guān)的神經(jīng)功能障礙疾病中,針刺治療有效且安全[57]。目前針刺直接調(diào)控腦卒中鐵死亡機制的相關(guān)研究較少,汪紅娟等[58]用線栓法制備65只大鼠MCAO模型,2 h后拔出線栓從而建立腦缺血再灌注模型,選取人中、大椎、百會穴進行捆綁針刺,留針30 min,12 h 1次,共治療7次,實驗后得出結(jié)論:針刺可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞Fe2+代謝,減輕海馬組織Fe2+集聚,減少脂質(zhì)過氧化,從而抑制 CIRI 后大鼠神經(jīng)細胞鐵死亡,發(fā)揮腦保護作用。張琦等[59]研究發(fā)現(xiàn)醒腦開竅針刺法聯(lián)合阿替普酶可減輕急性腦梗死患者大腦中脂質(zhì)過氧化的表達。

研究顯示,在病理狀態(tài)下,針刺能夠增強腦組織的抗氧化能力,通過促進腦組織中過氧化氫酶(catalase,CAT)、SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶釋放來改善自由基代謝,進而減輕氧化應(yīng)激[60-61]。孫培養(yǎng)等[62]研究表明通督調(diào)神針刺可提高腦卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)大鼠海馬CA1區(qū)SOD、CAT活性,降低MDA含量,抑制海馬神經(jīng)組織氧化應(yīng)激。舒兆瑞[63]研究顯示針刺配合常規(guī)治療可改善急性缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能修復(fù),改善血漿自由基水平,這可能與SOD活性升高有關(guān)。張?zhí)烊蔥64]研究發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合人參提高了GSH、GSH-Px、SOD活性,加強了抗氧化能力,緩解了大鼠慢性疲勞。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的特征之一,其中SOD、MDA、GSH-Px與脂質(zhì)過氧化聯(lián)系緊密,GSH更是鐵死亡代表標志物之一,這對針刺治療腦卒中鐵死亡機制有很大的借鑒意義。

4 結(jié)語

綜上所述,腦卒中發(fā)病過程中鐵死亡的發(fā)生機制主要與鐵超載、脂質(zhì)過氧化、興奮性毒性、抗氧化酶失活及系統(tǒng)受損等有關(guān)。缺血性腦卒中和出血性腦卒中發(fā)病過程中鐵死亡的發(fā)生機制還存在某些差異,例如脂氧合酶類表達的亞型不同:缺血性腦卒中12/15-LOX高表達,而出血性腦卒中ALOX5的表達明顯增高。且鐵過載產(chǎn)生的機制亦有區(qū)別。因此在不同情況下,針刺治療方案的選擇需有所不同。目前針刺調(diào)控腦卒中相關(guān)鐵死亡的研究尚處在前期階段,其具體機制尚未明確,需要進一步的研究探索,且當下研究多以動物實驗為主,缺乏臨床實踐驗證,這是未來針刺研究的一大挑戰(zhàn)。這些問題若能得到解決,則有望為腦卒中的治療提供重要的思路及新的靶點。