肖雨嫣，任澤華，楊 宇，高 源，劉建立

(1.江南大學紡織科學與工程學院，江蘇無錫 214122；2.無錫小天鵝電器有限公司，江蘇無錫 214028)

衣物在儲存或穿著過程中因微生物污染造成“發(fā)霉”現(xiàn)象，在衣物上形成霉斑，造成衣物異味，影響衣物的外觀和壽命。穿著發(fā)霉衣物容易造成皮膚交叉感染，存在健康風險[1]。人體分泌的代謝物如皮脂，汗液等吸附到衣物上給微生物提供營養(yǎng)使在其上繁殖生長[2-3]。因此，衣物在日常生活的環(huán)境中很容易被微生物污染，在潮濕的陰雨環(huán)境中霉菌更易滋生。衣物上的霉菌與日常生活中霉菌真菌種類息息相關。已有學者圍繞紡織品致霉微生物提取和鑒定開展了研究工作。李世超等[4]對絲綢上霉菌進行研究，最終確定了引起絲綢紋樣霉變的微生物菌屬為根霉屬、擬青霉屬和黑曲霉屬等。劉俊等[5]對皮革上的霉菌進行分離鑒定，研究結果表明皮革制品的優(yōu)勢霉菌主要為曲霉屬和青霉屬。不同織物上霉菌的種類存在差異，因此需要鑒定衣物的霉菌微生物種類，針對衣物上霉菌的優(yōu)勢菌種，采用有效的抑菌劑，保護紡織品，延長其使用壽命。

目前，紡織品微生物的研究主要集中在抗菌面料領域，但屬于霉菌抗菌研究還相對較少。常用的化學抗菌劑的應用研究在主要集中在山梨酸鹽、丙酸鈣鹽及磷酸鹽等方面[6]。其中苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價格低廉，又具有廣譜的抑菌效果，被廣泛使用在抗菌領域中。López等[7]制備的山梨酸鉀抗菌膜材對乳酪上常見的青霉菌、沙門氏菌有一定的抑制效果。Fasihnia等[8]研究發(fā)現(xiàn)聚丙烯中添加少量的山梨酸鉀制備的包裝膜，對黑曲霉有一定的抑制效果。此外，邢海麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉對白色葡萄球菌有較好的抑制效果。Sun等[10]研究發(fā)現(xiàn)了金屬鋅化物對細菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌等都具有良好抗菌活性。

本文從霉變衣物上提取霉菌，在PDA培養(yǎng)基采取適宜的溫度和濕度進行培養(yǎng)分離和純化。將得到的純化的單一菌株進行形態(tài)學觀察和ITS序列分析，確定了衣物上霉菌的種類。并將優(yōu)勢菌種接種到棉織物上，為了模擬霉菌在棉衣物上真實生長情況，將人體皮脂作為微生物營養(yǎng)物質(zhì)。采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抗菌劑，探究3種抑制劑的抑菌效果以及最佳添加量。為闡明棉衣物霉變機理提供實驗參考，為開發(fā)有效的紡織品防霉技術奠定基礎。

1 實 驗

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 實驗材料

霉變衣物：視覺可見霉斑的5件全棉衣物，來源地為河南省。

織物：全棉14.5 tex平紋漂白機織物。經(jīng)向密度：524根/10 cm，緯向密度：283根/10 cm，平方米質(zhì)量：120 g/m2。

藥品：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上?；瘜W試劑有限公司)；PBS緩沖液(上海泰坦科技股份有限公司)；角鯊烯(化學純，阿拉丁試劑有限公司)；吐溫80、三油酸甘油酯、油酸(化學純，上?；瘜W試劑有限公司)；乳酸石炭酸棉藍(福州飛凈生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗設備

LHS-80HC-II型恒溫恒濕箱(上海珂淮儀器有限公司)、YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海雙旭電子有限公司)、VHX-5000超景深三維數(shù)碼顯微鏡(基恩士公司)、P-BO型軋壓機(無錫銘翔機械設備有限公司)、J-2型菌落計數(shù)器(無錫杰瑞安儀器設備有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 衣物上霉菌的分離純化

參照國家標準GB 4789.15—2016《霉菌和酵母計數(shù)》中的方法，裁剪10 g的霉變棉衣物，隨后加入90 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，搖床設置28 ℃、180 r/ min震蕩12 h后取出。提取菌液，逐次稀釋10倍。將稀釋后的菌液滴1 mL在培養(yǎng)基中，隨后密封放置在恒溫培養(yǎng)箱中，設置28 ℃，95%溫濕度培養(yǎng)。觀察霉菌生長情況，將得到的菌落按照不同的形態(tài)、顏色進行篩選。之后，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基中純化，放置恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。重復3次，得到純化好的單一菌落。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

將得到的形態(tài)單一的菌落采用接種針取菌絲，點在PDA培養(yǎng)基中，放置恒溫恒濕箱中倒置培養(yǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，通過《中國真菌匯總》[11]進行霉菌形態(tài)學的鑒定。

1.2.3 菌體形態(tài)觀察

觀察純化后的霉菌個體形態(tài)，通過透明膠帶鏡檢法[12]，在載玻片上滴乳酸石炭酸棉蘭染液，使用透明膠帶輕輕粘取菌落，蓋于玻片上。將載玻片置于超景深顯微鏡載物臺上，選擇筒形透視光源，超景深倍鏡放大1000倍，觀察霉菌菌絲的形態(tài)和孢子形狀。

1.2.4 ITS擴增及測序

基于ITS序列對分離菌株進行分子鑒定。通用引物ITSl(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4(5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR選取50 μL反應體系：10×buffer 5 μL；模板引物1 μL；引物各2 μL ；dNTP 4 μL；MgCl24 μL；Tag酶1μL；加入50 μL雙蒸水。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；72 ℃延伸50 s；循環(huán)30次；72 ℃保溫5 min[13]。擴增完成后，采用1%的瓊脂糖進行電泳，送往天霖生物科技有限公司進行測定。

1.2.5 序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫輸入得到的序列結果，采用BLAST同源性進行比較分析，根據(jù)比對的結果獲取對應霉菌菌株的種屬信息。使用MEGA7.0軟件選擇Neighbor-Joining鄰接法，檢驗1000次，繪制系統(tǒng)進化樹[13]。

1.2.6 皮脂污染試樣制備

皮脂污染液制備：根據(jù)人體皮脂含量，制備質(zhì)量分數(shù)為4%混合皮脂污染液，稱取角鯊烯、油酸、三油酸甘油酯和1%吐溫80乳化劑加入攪拌杯中，再加入適量的去離子水至200 mL，放置高速攪拌機轉(zhuǎn)速18 000 r /min，攪拌 5 min，得到穩(wěn)定的皮脂組分乳化液[14-15]，其配方如表1所示。

表1 混合皮脂污染液配比

皮脂污染試樣制備將棉織物原樣裁剪成 8 cm×8 cm(10 g)的正方形，浸入上述質(zhì)量分數(shù)為4%的皮脂組分乳液中，用玻璃棒輕壓使試樣浸潤在溶液中，15 min后取出，在軋車上浸軋。浸軋后，織物平鋪晾干，紫外線殺菌之后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 霉菌污染試樣制備

孢子懸浮液制備在純化好的霉菌培養(yǎng)基中加入10 mL的無菌水，用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基，隨后倒入含有玻璃珠的錐形瓶中，手搖震蕩以分散成團孢子液使孢子液充分混勻。將孢子液倒入離心管前使用濾紙進行過濾，以除去菌絲等雜物。設置高速離心機4500 r/min離心，10 min后取出。隨后去除上層的清液，再加入15 mL無菌水，重復上述步驟3次。獲得的孢子液即為實驗用的孢子液[16]。孢子液以 1 mL 的用量滴加在1.2.6制備的皮脂污染試樣上以作霉菌污染試樣。

1.2.8 抑菌液的制備

分別選擇山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑，每種抑菌劑分別稱量0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g加入100 mL的去離子水中配置成不同濃度的抑菌液。

1.2.9 棉織物上菌落個數(shù)的測定

將培養(yǎng)好的棉織物取出，采用霉菌計數(shù)器記錄不同濃度的抑制劑處理下棉織物上霉菌的總數(shù)。探究不同抑制劑對棉衣物上霉菌的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 霉菌的形態(tài)學分析

對從霉變棉衣物上提取的霉菌進行分離純化，純化后觀察菌落形態(tài)和菌落顏色等，并且使用超景深顯微鏡觀察霉菌的分生孢子和頂囊等形狀情況[13]，初步鑒定得到7種霉菌，編號依次為A、B、C、D、E、F和G。采用相機拍攝7種霉菌，菌落圖片如圖1所示。衣物上霉菌的個體形態(tài)如圖2所示。表2 為衣物上霉菌的形態(tài)的描述。通過霉菌形態(tài)和資料查詢，初步鑒定結果為菌種A為根霉屬、B和E為青霉屬、C和F為曲霉屬、D為枝孢屬以及G為莖點霉屬。由形態(tài)學的鑒定結果可得到青霉屬和曲霉屬菌種占比較多，屬棉衣物上的優(yōu)勢菌屬。

圖1 衣物霉菌菌株培養(yǎng)后菌落形態(tài)

圖2 衣物霉菌菌落培養(yǎng)后菌體形態(tài)

表2 衣物霉菌菌落形態(tài)和菌體形態(tài)描述

2.2 ITS序列分析鑒定

將得到的7種霉菌進行ITS序列擴增，擴增產(chǎn)物進行測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫將得到的序列結果進行BLAST對比分析。檢索分離出的菌株和數(shù)據(jù)庫的菌株同源性達到99%以上，可視為同一種[11]。微生物的 ITS序列分析如表3所示，進化樹如圖3所示。因此，A、B、C、D、E、F、G分別為匍枝根霉、頂青霉、黃曲霉、芽枝狀枝孢霉、桔青霉、雜色曲霉和莖點霉菌。從提取的7種霉菌的ITS序列測序結果中選取與對應菌株同源性較高的序列構發(fā)育樹[16]。由圖3可知，7種霉菌的ITS序列分為4個分支，青霉屬和曲霉屬是同種屬的進化關系且為霉變棉衣物上的優(yōu)勢菌屬。

圖3 衣物上霉菌微生物的ITS系統(tǒng)進化樹

表3 衣物上霉菌的ITS序列分析鑒定結果

2.3 不同抑菌劑對單菌落的影響

對霉變棉衣物上分離出的優(yōu)勢菌屬：黃曲霉、頂青霉、桔青霉和雜色曲霉進行抑菌實驗，探究3種抑制劑對單一霉菌的抑制效果，將制備好的單一霉菌菌液滴在裁剪好的棉織物上，然后放置恒溫恒濕箱中14天后取出，采用菌落計數(shù)器記錄棉織物上霉菌菌落個數(shù)，探究抑制劑抑菌情況。圖4、圖5、圖6和圖7分別為3種不同濃度抑菌劑對棉織物上黃曲霉、頂青霉、桔青霉以及雜色曲霉的霉菌個數(shù)的抑制情況。

由圖4可知，棉織物上黃曲霉總菌落個數(shù)隨著3種抑菌劑濃度的增加而減少。硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制劑效果好，當棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，織物上黃曲霉菌落個數(shù)為0，此時硫酸鋅抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，織物上霉菌菌落個數(shù)為0，此濃度下的苯甲酸鈉可以有效抑制黃曲霉在棉織物上的生長；棉織物上山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，織物上霉菌菌落個數(shù)為6，織物上還存在少量黃曲霉菌落。當山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時，織物上無霉菌生長，此濃度下的山梨酸鉀具有較好得到抑制效果。

圖4 抑菌劑質(zhì)量濃度對棉織物上黃曲霉菌落個數(shù)的影響

由圖5可知，硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制劑效果好。當棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，織物上頂青霉菌落個數(shù)為0，此濃度下的硫酸鋅對頂青霉有良好的抑制效果；棉織物上山梨酸鉀質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，織物上霉菌菌落個數(shù)為0，此時苯甲酸鈉抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，織物上霉菌菌落個數(shù)為35，織物上邊緣生長少量頂青霉菌落。當苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時，織物上視覺不可見霉菌生長，用菌落計數(shù)器放大觀察，發(fā)現(xiàn)邊緣地區(qū)個別菌落，此濃度下的苯甲酸鈉對棉織物上的頂青霉有好的抑制效果。

圖5 抑菌劑質(zhì)量濃度對棉織物上頂青霉菌落個數(shù)的影響

由圖6可知，硫酸鋅和山梨酸鉀的抑制效果較苯甲酸鈉的抑制效果好。當棉織物上硫酸鋅和山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，織物上桔青霉菌落個數(shù)為0，此濃度下兩種抑菌劑抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，織物上幾乎無霉菌生長，邊緣部分有2個桔青霉菌落，此濃度下的苯甲酸鈉對棉織物上桔青霉的抑菌效果較好。

圖6 抑菌劑質(zhì)量濃度對棉織物上桔青霉菌落個數(shù)的影響

由圖7可知，硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制效果好。當棉織物上硫酸鋅的質(zhì)量濃度為1.20 g/mL時，織物上雜色曲霉菌落個數(shù)為0，此濃度下的硫酸鋅對棉織物上雜色曲霉的抑菌效果良好；當山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，織物上雜色曲霉菌落個數(shù)為0，此時抑制效果良好；當棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，采用菌落計數(shù)器發(fā)現(xiàn)織物上霉菌個數(shù)為3，但視覺不可見霉菌生長，此濃度下的抑菌效果良好。

圖7 抑菌劑質(zhì)量濃度對棉織物上雜色曲霉菌落個數(shù)的影響

2.4 不同抑制劑對衣物優(yōu)勢菌落的影響

將從霉變棉衣物分離出的優(yōu)勢菌屬，頂青霉、黃曲霉、桔青霉和雜色曲霉制成混合菌液，采用移液槍取1 mL菌液滴于裁剪好的1 0g的棉織物上，待完全吸收后，再加入1 mL配置好的不同濃度的3種抑菌液。最后將制備好的試樣放入28 ℃，95% RH的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)14 d取出。由圖8、圖9和 圖10 抑菌劑對棉織物霉菌的抑菌效果圖可知，將混合菌液接種在棉織物上，14 d之后棉織物上生長大量霉菌，覆蓋棉織物表面。隨著3種抑菌劑添加量增多，棉織物上霉菌總數(shù)不斷減少。

圖8 山梨酸鉀抑菌效果

圖9 硫酸鋅抑菌效果

圖10 苯甲酸鈉抑菌效果

在實驗中，當在織物表面滴加的山梨酸鉀質(zhì)量濃度為0.10 g/100 mL時，棉織物上霉菌面積較少，但邊緣地區(qū)還有少量生長。山梨酸鉀質(zhì)量濃度達到0.12 g/100 mL時，棉織物無霉菌生長，此時山梨酸鉀抑菌效果較好。當硫酸鋅質(zhì)量濃度達到0.10 g/100 mL時，棉織物上還有較多霉菌生長，質(zhì)量濃度達0.12 g/100 mL 時，棉織物上無霉菌生長，此濃度下硫酸鋅對棉織物上優(yōu)勢霉菌有良好的抑菌效果。當織物表明滴加苯甲酸鈉質(zhì)量濃度達到0.12 g/100 mL時，棉織物上還有少量霉菌生長，質(zhì)量濃度達0.14 g/100 mL時，棉織物上無霉菌生長，此濃度下的苯甲酸鈉能有效抑菌。

3 結 論

本實驗采用PDA培養(yǎng)基分離純化河南地區(qū)5件霉變棉衣物上的霉菌微生物，通過形態(tài)學初步鑒定出7種的霉變微生物，通過ITS序列分析和同源性比較，鑒定出這7種霉變微生物分別為匍枝根霉、頂青霉、黃曲霉、芽枝狀枝孢霉、桔青霉、雜色曲霉和莖點霉菌。其中曲霉屬和青霉屬占比約60%，為棉衣物上致霉的優(yōu)勢霉菌菌屬。將棉衣物上單一的優(yōu)勢霉菌菌屬分別接種到棉織物上，采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑，當棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL，苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL，山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時，對棉織物上黃曲霉和頂青霉有良好的抑菌效果；硫酸鋅和山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL，苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時，對織物上桔青霉的抑菌效果良好；硫酸鋅的質(zhì)量濃度為1.20 g/mL，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時，能有效抑制棉織物上雜色曲霉的生長。

為了模擬真實衣物上霉菌的抑制效果，將優(yōu)勢霉菌制成混合菌液接種到棉織物上，實驗表明，當山梨酸鉀和硫酸鋅添加量為0.12 g/100mL時，苯甲酸鈉添加量為0.14 g/100mL時對棉織物優(yōu)勢霉菌的抑菌效果良好。