肖雨嫣，任澤華，楊 宇，高 源，劉建立

(1.江南大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.無(wú)錫小天鵝電器有限公司，江蘇無(wú)錫 214028)

衣物在儲(chǔ)存或穿著過(guò)程中因微生物污染造成“發(fā)霉”現(xiàn)象，在衣物上形成霉斑，造成衣物異味，影響衣物的外觀和壽命。穿著發(fā)霉衣物容易造成皮膚交叉感染，存在健康風(fēng)險(xiǎn)[1]。人體分泌的代謝物如皮脂，汗液等吸附到衣物上給微生物提供營(yíng)養(yǎng)使在其上繁殖生長(zhǎng)[2-3]。因此，衣物在日常生活的環(huán)境中很容易被微生物污染，在潮濕的陰雨環(huán)境中霉菌更易滋生。衣物上的霉菌與日常生活中霉菌真菌種類息息相關(guān)。已有學(xué)者圍繞紡織品致霉微生物提取和鑒定開(kāi)展了研究工作。李世超等[4]對(duì)絲綢上霉菌進(jìn)行研究，最終確定了引起絲綢紋樣霉變的微生物菌屬為根霉屬、擬青霉屬和黑曲霉屬等。劉俊等[5]對(duì)皮革上的霉菌進(jìn)行分離鑒定，研究結(jié)果表明皮革制品的優(yōu)勢(shì)霉菌主要為曲霉屬和青霉屬。不同織物上霉菌的種類存在差異，因此需要鑒定衣物的霉菌微生物種類，針對(duì)衣物上霉菌的優(yōu)勢(shì)菌種，采用有效的抑菌劑，保護(hù)紡織品，延長(zhǎng)其使用壽命。

目前，紡織品微生物的研究主要集中在抗菌面料領(lǐng)域，但屬于霉菌抗菌研究還相對(duì)較少。常用的化學(xué)抗菌劑的應(yīng)用研究在主要集中在山梨酸鹽、丙酸鈣鹽及磷酸鹽等方面[6]。其中苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價(jià)格低廉，又具有廣譜的抑菌效果，被廣泛使用在抗菌領(lǐng)域中。López等[7]制備的山梨酸鉀抗菌膜材對(duì)乳酪上常見(jiàn)的青霉菌、沙門氏菌有一定的抑制效果。Fasihnia等[8]研究發(fā)現(xiàn)聚丙烯中添加少量的山梨酸鉀制備的包裝膜，對(duì)黑曲霉有一定的抑制效果。此外，邢海麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉對(duì)白色葡萄球菌有較好的抑制效果。Sun等[10]研究發(fā)現(xiàn)了金屬鋅化物對(duì)細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌等都具有良好抗菌活性。

本文從霉變衣物上提取霉菌，在PDA培養(yǎng)基采取適宜的溫度和濕度進(jìn)行培養(yǎng)分離和純化。將得到的純化的單一菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析，確定了衣物上霉菌的種類。并將優(yōu)勢(shì)菌種接種到棉織物上，為了模擬霉菌在棉衣物上真實(shí)生長(zhǎng)情況，將人體皮脂作為微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抗菌劑，探究3種抑制劑的抑菌效果以及最佳添加量。為闡明棉衣物霉變機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)參考，為開(kāi)發(fā)有效的紡織品防霉技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

霉變衣物：視覺(jué)可見(jiàn)霉斑的5件全棉衣物，來(lái)源地為河南省。

織物：全棉14.5 tex平紋漂白機(jī)織物。經(jīng)向密度：524根/10 cm，緯向密度：283根/10 cm，平方米質(zhì)量：120 g/m2。

藥品：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；PBS緩沖液(上海泰坦科技股份有限公司)；角鯊烯(化學(xué)純，阿拉丁試劑有限公司)；吐溫80、三油酸甘油酯、油酸(化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；乳酸石炭酸棉藍(lán)(福州飛凈生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

LHS-80HC-II型恒溫恒濕箱(上海珂淮儀器有限公司)、YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海雙旭電子有限公司)、VHX-5000超景深三維數(shù)碼顯微鏡(基恩士公司)、P-BO型軋壓機(jī)(無(wú)錫銘翔機(jī)械設(shè)備有限公司)、J-2型菌落計(jì)數(shù)器(無(wú)錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 衣物上霉菌的分離純化

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016《霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的方法，裁剪10 g的霉變棉衣物，隨后加入90 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，搖床設(shè)置28 ℃、180 r/ min震蕩12 h后取出。提取菌液，逐次稀釋10倍。將稀釋后的菌液滴1 mL在培養(yǎng)基中，隨后密封放置在恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置28 ℃，95%溫濕度培養(yǎng)。觀察霉菌生長(zhǎng)情況，將得到的菌落按照不同的形態(tài)、顏色進(jìn)行篩選。之后，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基中純化，放置恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。重復(fù)3次，得到純化好的單一菌落。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

將得到的形態(tài)單一的菌落采用接種針取菌絲，點(diǎn)在PDA培養(yǎng)基中，放置恒溫恒濕箱中倒置培養(yǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，通過(guò)《中國(guó)真菌匯總》[11]進(jìn)行霉菌形態(tài)學(xué)的鑒定。

1.2.3 菌體形態(tài)觀察

觀察純化后的霉菌個(gè)體形態(tài)，通過(guò)透明膠帶鏡檢法[12]，在載玻片上滴乳酸石炭酸棉蘭染液，使用透明膠帶輕輕粘取菌落，蓋于玻片上。將載玻片置于超景深顯微鏡載物臺(tái)上，選擇筒形透視光源，超景深倍鏡放大1000倍，觀察霉菌菌絲的形態(tài)和孢子形狀。

1.2.4 ITS擴(kuò)增及測(cè)序

基于ITS序列對(duì)分離菌株進(jìn)行分子鑒定。通用引物ITSl(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4(5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR選取50 μL反應(yīng)體系：10×buffer 5 μL；模板引物1 μL；引物各2 μL ；dNTP 4 μL；MgCl24 μL；Tag酶1μL；加入50 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；72 ℃延伸50 s；循環(huán)30次；72 ℃保溫5 min[13]。擴(kuò)增完成后，采用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，送往天霖生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)輸入得到的序列結(jié)果，采用BLAST同源性進(jìn)行比較分析，根據(jù)比對(duì)的結(jié)果獲取對(duì)應(yīng)霉菌菌株的種屬信息。使用MEGA7.0軟件選擇Neighbor-Joining鄰接法，檢驗(yàn)1000次，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[13]。

1.2.6 皮脂污染試樣制備

皮脂污染液制備：根據(jù)人體皮脂含量，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%混合皮脂污染液，稱取角鯊烯、油酸、三油酸甘油酯和1%吐溫80乳化劑加入攪拌杯中，再加入適量的去離子水至200 mL，放置高速攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速18 000 r /min，攪拌 5 min，得到穩(wěn)定的皮脂組分乳化液[14-15]，其配方如表1所示。

表1 混合皮脂污染液配比

皮脂污染試樣制備將棉織物原樣裁剪成 8 cm×8 cm(10 g)的正方形，浸入上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的皮脂組分乳液中，用玻璃棒輕壓使試樣浸潤(rùn)在溶液中，15 min后取出，在軋車上浸軋。浸軋后，織物平鋪晾干，紫外線殺菌之后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 霉菌污染試樣制備

孢子懸浮液制備在純化好的霉菌培養(yǎng)基中加入10 mL的無(wú)菌水，用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基，隨后倒入含有玻璃珠的錐形瓶中，手搖震蕩以分散成團(tuán)孢子液使孢子液充分混勻。將孢子液倒入離心管前使用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，以除去菌絲等雜物。設(shè)置高速離心機(jī)4500 r/min離心，10 min后取出。隨后去除上層的清液，再加入15 mL無(wú)菌水，重復(fù)上述步驟3次。獲得的孢子液即為實(shí)驗(yàn)用的孢子液[16]。孢子液以 1 mL 的用量滴加在1.2.6制備的皮脂污染試樣上以作霉菌污染試樣。

1.2.8 抑菌液的制備

分別選擇山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑，每種抑菌劑分別稱量0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g加入100 mL的去離子水中配置成不同濃度的抑菌液。

1.2.9 棉織物上菌落個(gè)數(shù)的測(cè)定

將培養(yǎng)好的棉織物取出，采用霉菌計(jì)數(shù)器記錄不同濃度的抑制劑處理下棉織物上霉菌的總數(shù)。探究不同抑制劑對(duì)棉衣物上霉菌的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的形態(tài)學(xué)分析

對(duì)從霉變棉衣物上提取的霉菌進(jìn)行分離純化，純化后觀察菌落形態(tài)和菌落顏色等，并且使用超景深顯微鏡觀察霉菌的分生孢子和頂囊等形狀情況[13]，初步鑒定得到7種霉菌，編號(hào)依次為A、B、C、D、E、F和G。采用相機(jī)拍攝7種霉菌，菌落圖片如圖1所示。衣物上霉菌的個(gè)體形態(tài)如圖2所示。表2 為衣物上霉菌的形態(tài)的描述。通過(guò)霉菌形態(tài)和資料查詢，初步鑒定結(jié)果為菌種A為根霉屬、B和E為青霉屬、C和F為曲霉屬、D為枝孢屬以及G為莖點(diǎn)霉屬。由形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果可得到青霉屬和曲霉屬菌種占比較多，屬棉衣物上的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖1 衣物霉菌菌株培養(yǎng)后菌落形態(tài)

圖2 衣物霉菌菌落培養(yǎng)后菌體形態(tài)

表2 衣物霉菌菌落形態(tài)和菌體形態(tài)描述

2.2 ITS序列分析鑒定

將得到的7種霉菌進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的序列結(jié)果進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。檢索分離出的菌株和數(shù)據(jù)庫(kù)的菌株同源性達(dá)到99%以上，可視為同一種[11]。微生物的 ITS序列分析如表3所示，進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。因此，A、B、C、D、E、F、G分別為匍枝根霉、頂青霉、黃曲霉、芽枝狀枝孢霉、桔青霉、雜色曲霉和莖點(diǎn)霉菌。從提取的7種霉菌的ITS序列測(cè)序結(jié)果中選取與對(duì)應(yīng)菌株同源性較高的序列構(gòu)發(fā)育樹(shù)[16]。由圖3可知，7種霉菌的ITS序列分為4個(gè)分支，青霉屬和曲霉屬是同種屬的進(jìn)化關(guān)系且為霉變棉衣物上的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖3 衣物上霉菌微生物的ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表3 衣物上霉菌的ITS序列分析鑒定結(jié)果

2.3 不同抑菌劑對(duì)單菌落的影響

對(duì)霉變棉衣物上分離出的優(yōu)勢(shì)菌屬：黃曲霉、頂青霉、桔青霉和雜色曲霉進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，探究3種抑制劑對(duì)單一霉菌的抑制效果，將制備好的單一霉菌菌液滴在裁剪好的棉織物上，然后放置恒溫恒濕箱中14天后取出，采用菌落計(jì)數(shù)器記錄棉織物上霉菌菌落個(gè)數(shù)，探究抑制劑抑菌情況。圖4、圖5、圖6和圖7分別為3種不同濃度抑菌劑對(duì)棉織物上黃曲霉、頂青霉、桔青霉以及雜色曲霉的霉菌個(gè)數(shù)的抑制情況。

由圖4可知，棉織物上黃曲霉總菌落個(gè)數(shù)隨著3種抑菌劑濃度的增加而減少。硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制劑效果好，當(dāng)棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，織物上黃曲霉菌落個(gè)數(shù)為0，此時(shí)硫酸鋅抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，織物上霉菌菌落個(gè)數(shù)為0，此濃度下的苯甲酸鈉可以有效抑制黃曲霉在棉織物上的生長(zhǎng)；棉織物上山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，織物上霉菌菌落個(gè)數(shù)為6，織物上還存在少量黃曲霉菌落。當(dāng)山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時(shí)，織物上無(wú)霉菌生長(zhǎng)，此濃度下的山梨酸鉀具有較好得到抑制效果。

圖4 抑菌劑質(zhì)量濃度對(duì)棉織物上黃曲霉菌落個(gè)數(shù)的影響

由圖5可知，硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制劑效果好。當(dāng)棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，織物上頂青霉菌落個(gè)數(shù)為0，此濃度下的硫酸鋅對(duì)頂青霉有良好的抑制效果；棉織物上山梨酸鉀質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，織物上霉菌菌落個(gè)數(shù)為0，此時(shí)苯甲酸鈉抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，織物上霉菌菌落個(gè)數(shù)為35，織物上邊緣生長(zhǎng)少量頂青霉菌落。當(dāng)苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時(shí)，織物上視覺(jué)不可見(jiàn)霉菌生長(zhǎng)，用菌落計(jì)數(shù)器放大觀察，發(fā)現(xiàn)邊緣地區(qū)個(gè)別菌落，此濃度下的苯甲酸鈉對(duì)棉織物上的頂青霉有好的抑制效果。

圖5 抑菌劑質(zhì)量濃度對(duì)棉織物上頂青霉菌落個(gè)數(shù)的影響

由圖6可知，硫酸鋅和山梨酸鉀的抑制效果較苯甲酸鈉的抑制效果好。當(dāng)棉織物上硫酸鋅和山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，織物上桔青霉菌落個(gè)數(shù)為0，此濃度下兩種抑菌劑抑菌效果良好；棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，織物上幾乎無(wú)霉菌生長(zhǎng)，邊緣部分有2個(gè)桔青霉菌落，此濃度下的苯甲酸鈉對(duì)棉織物上桔青霉的抑菌效果較好。

圖6 抑菌劑質(zhì)量濃度對(duì)棉織物上桔青霉菌落個(gè)數(shù)的影響

由圖7可知，硫酸鋅的抑制效果較其他兩種抑制效果好。當(dāng)棉織物上硫酸鋅的質(zhì)量濃度為1.20 g/mL時(shí)，織物上雜色曲霉菌落個(gè)數(shù)為0，此濃度下的硫酸鋅對(duì)棉織物上雜色曲霉的抑菌效果良好；當(dāng)山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，織物上雜色曲霉菌落個(gè)數(shù)為0，此時(shí)抑制效果良好；當(dāng)棉織物上苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，采用菌落計(jì)數(shù)器發(fā)現(xiàn)織物上霉菌個(gè)數(shù)為3，但視覺(jué)不可見(jiàn)霉菌生長(zhǎng)，此濃度下的抑菌效果良好。

圖7 抑菌劑質(zhì)量濃度對(duì)棉織物上雜色曲霉菌落個(gè)數(shù)的影響

2.4 不同抑制劑對(duì)衣物優(yōu)勢(shì)菌落的影響

將從霉變棉衣物分離出的優(yōu)勢(shì)菌屬，頂青霉、黃曲霉、桔青霉和雜色曲霉制成混合菌液，采用移液槍取1 mL菌液滴于裁剪好的1 0g的棉織物上，待完全吸收后，再加入1 mL配置好的不同濃度的3種抑菌液。最后將制備好的試樣放入28 ℃，95% RH的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)14 d取出。由圖8、圖9和 圖10 抑菌劑對(duì)棉織物霉菌的抑菌效果圖可知，將混合菌液接種在棉織物上，14 d之后棉織物上生長(zhǎng)大量霉菌，覆蓋棉織物表面。隨著3種抑菌劑添加量增多，棉織物上霉菌總數(shù)不斷減少。

圖8 山梨酸鉀抑菌效果

圖9 硫酸鋅抑菌效果

圖10 苯甲酸鈉抑菌效果

在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在織物表面滴加的山梨酸鉀質(zhì)量濃度為0.10 g/100 mL時(shí)，棉織物上霉菌面積較少，但邊緣地區(qū)還有少量生長(zhǎng)。山梨酸鉀質(zhì)量濃度達(dá)到0.12 g/100 mL時(shí)，棉織物無(wú)霉菌生長(zhǎng)，此時(shí)山梨酸鉀抑菌效果較好。當(dāng)硫酸鋅質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 g/100 mL時(shí)，棉織物上還有較多霉菌生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度達(dá)0.12 g/100 mL 時(shí)，棉織物上無(wú)霉菌生長(zhǎng)，此濃度下硫酸鋅對(duì)棉織物上優(yōu)勢(shì)霉菌有良好的抑菌效果。當(dāng)織物表明滴加苯甲酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)到0.12 g/100 mL時(shí)，棉織物上還有少量霉菌生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度達(dá)0.14 g/100 mL時(shí)，棉織物上無(wú)霉菌生長(zhǎng)，此濃度下的苯甲酸鈉能有效抑菌。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基分離純化河南地區(qū)5件霉變棉衣物上的霉菌微生物，通過(guò)形態(tài)學(xué)初步鑒定出7種的霉變微生物，通過(guò)ITS序列分析和同源性比較，鑒定出這7種霉變微生物分別為匍枝根霉、頂青霉、黃曲霉、芽枝狀枝孢霉、桔青霉、雜色曲霉和莖點(diǎn)霉菌。其中曲霉屬和青霉屬占比約60%，為棉衣物上致霉的優(yōu)勢(shì)霉菌菌屬。將棉衣物上單一的優(yōu)勢(shì)霉菌菌屬分別接種到棉織物上，采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑，當(dāng)棉織物上硫酸鋅質(zhì)量濃度為1.40 g/mL，苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL，山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.80 g/mL時(shí)，對(duì)棉織物上黃曲霉和頂青霉有良好的抑菌效果；硫酸鋅和山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL，苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為1.60 g/mL時(shí)，對(duì)織物上桔青霉的抑菌效果良好；硫酸鋅的質(zhì)量濃度為1.20 g/mL，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的質(zhì)量濃度為1.40 g/mL時(shí)，能有效抑制棉織物上雜色曲霉的生長(zhǎng)。

為了模擬真實(shí)衣物上霉菌的抑制效果，將優(yōu)勢(shì)霉菌制成混合菌液接種到棉織物上，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)山梨酸鉀和硫酸鋅添加量為0.12 g/100mL時(shí)，苯甲酸鈉添加量為0.14 g/100mL時(shí)對(duì)棉織物優(yōu)勢(shì)霉菌的抑菌效果良好。