何敏怡， 鄧汶圃， 李彥男， 謝慧嫻， 梁曉玲， 岳陽， 吳毅 ， 余文華

（廣州大學生命科學學院，華南生物多樣性保護與利用重點實驗室，廣州510006）

翼手目Chiroptera是哺乳動物中第二大類群，也是唯一真正適應飛翔的哺乳動物（Wilson &Reeder，2005），目前記錄有 18科 202屬 1 401種（Wilson & Mittermeier，2019），我國有 8科 36屬140種，其中菊頭蝠科Rhinolophidae菊頭蝠屬Rhinolophus19種（魏輔文等，2021）。該類群一般棲息于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，為洞穴型常見種類，以昆蟲為食，是生態(tài)系統(tǒng)中重要的成員之一（吳毅等，1997；Csorbaet al.，2003；張成菊，吳毅，2006）。

馬鐵菊頭蝠R. ferrumequinum于1774年由Schreber命名，分布遍及非洲北部、歐洲南部和亞洲南部（Csorbaet al.，2003；Wilson & Mittermeier，2019）。根據(jù)形態(tài)和分子遺傳學的差異劃分為不同亞種，如指名亞種R. f. ferrumequinum、日本亞種R. f. nippon和尼泊爾亞種R. f. tragatus等（Corbet，1978；Oscar，1995；Benda & Vallo，2012）。在中國，一般認為分布有2個亞種：尼泊爾亞種，分布于云南和貴州；日本亞種，分布于吉林、遼寧、河北和北京等地（王應祥，2003）。本研究組在西藏自治區(qū)錯那縣與墨脫縣開展翼手目物種多樣性調(diào)查時，使用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到4只菊頭蝠，經(jīng)形態(tài)學和分子系統(tǒng)學分析，鑒定為馬鐵菊頭蝠。

1 研究材料與方法

1.1 標本采集

2019年7月5日在西藏自治區(qū)錯那縣（91°47′52″E，27°53′42″N，海拔3 108 m）使用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到 3只菊頭蝠（1♂：GZHU 19422，2♀：GZHU 19423和GZHU 19424）；2021年7月27日在西藏自治區(qū)墨脫縣（95°19′8.8″E，29°18′49.8″N，海拔1 263 m）采集到1只菊頭蝠（1♀：GZHU 21206）。以上標本均保存于廣州大學華南生物多樣性保護與利用重點實驗室。

1.2 形態(tài)測量

按照哺乳動物測量標準（楊奇森等，2007），使用數(shù)顯游標卡尺（MNT-150，上海美耐特實業(yè)有限公司；精度0.01 mm）對外形和頭骨進行測量，電子數(shù)字天平（i2000，永康市艾瑞貿(mào)易有限公司；精度0.1 g）稱量體質(zhì)量。外形測量指標包括：體質(zhì)量（body mass，MASS）、頭體長（head and body length，HB）、前臂長（forearm length，F(xiàn)A）、脛骨長（tibia length，TIB）、尾長（tail length，TL）、耳長（ear length，E）和后足長（hindfoot length，HF）。頭骨測量指標包括：顱全長（greatest length of skull，GTL）、顱基長（condylobasal length，CBL）、枕犬長（condylo-canine length，CCL）、腭長（palatal length，PL）、腦顱寬（breadth of braincase，BB）、后頭寬（mastoid width，MW）、顴寬（zygomatic width，ZW）、眶間距（interorbital width，IOW）、上齒列長（maxillary tooth length，C1-M3L）、上犬齒寬（upper canine width，C1-C1W）、上臼齒寬（maxillary third molar width，M3-M3W）、下齒列長（mandibular toothrow length，C1-M3L）、下頜長（mandibular length，ML）、下頜高（mandibular height，MH）。

1.3 DNA提取與擴增

取約20 mg肝臟或肌肉組織，使用DNA試劑盒（AG通用型基因組AG21009，艾科瑞生物）提取樣品總DNA。在PRIMER 3（Koressaaret al.，2018）中設計引物cyt b-F：5’-CCGCCCCATCAAGTATCTCT-3’和cyt b-R：5’-GCGATGCTTGCAAGTGGTAT-3’擴增cyt b基因；PCR反應總體系為 30 μL：Premix TaqTM15 μL，引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 13 μL；PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1 min，48個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。應用引物（Bakeret al.，2000）Rag2-F1：5’-GGCYG GCCCAARAGATCCTG-3’；Rag2-R1：5’-AACYTG YTTATTGTCTCCTGGTATGC-3’擴增Rag2基 因，PCR反應總體系為 25 μL：Premix TaqTM12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62.5 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進行測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學分析

采用 GENEIOUS 9.1.8（Drummondet al.，2016）對測序結(jié)果進行人工拼接與校對。從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載已有菊頭蝠屬物種的cyt b和Rag2基因部分序列用于后續(xù)分析，將大蹄蝠Hipposideros armiger和中蹄蝠H. larvatus基因序列設置為外群（表1），使用MUSCLE（Edgar，2004）對序列矩陣進行排序比對。應用MrModelTest 2.4（Nylander，2004）明確最佳核苷酸替換模型為GTR+I+G（cyt b）和 HKY+G（Rag2）。 MrBayes 3.2（Ronquistet al.，2012）分別構(gòu)建貝葉斯樹，設置總抽樣代數(shù)為2 000萬代，抽樣頻率為1 000，丟棄前25%數(shù)據(jù)。

表1 用于菊頭蝠屬系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的cyt b基因序列號Table 1 Sequences of cyt b gene used in phylogenetic analysis of genus Rhinolophus

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學特征

本研究的標本體型較大，體質(zhì)量17.4～21.8 g，頭體長 56.45～66.61 mm，前臂長 60.13～63.04 mm（表2）。體毛細密柔軟，背毛棕褐色，腹毛淺棕色。耳殼大且寬闊，尖端稍尖窄，具有對耳屏。正面及側(cè)面觀察頭部前端具發(fā)達的鼻葉（圖1：A，B），頂葉近三角形；中間突出部分為鞍狀葉和聯(lián)接葉，鞍狀葉兩側(cè)向中部微凹，呈提琴狀，鞍狀葉和聯(lián)接葉幾乎等高，“T”型連接處有一小凹陷；馬蹄葉寬圓。頭骨狹長（圖1：C～E），顱全長25.36～26.11 mm，矢狀嵴發(fā)達，人字嵴明顯，鼻隆近圓形，眶間距狹窄，顴弓發(fā)達，顴寬12.75～13.26 mm。齒式為1.1.2.3/2.1.2.3=30，上頜門齒較小，幾乎不見（圖1：C），上下犬齒（C）發(fā)達，上頜第一前臼齒（P2）極?。▓D1：G）位于上犬齒和第二上前臼齒（P4）連接處外側(cè)或缺失（圖1：H）；下門齒的齒冠都具有3個尖端（圖1：F），第一下前臼齒（P2）小于第二下前臼齒（P4），下臼齒齒冠“W”型，且后側(cè)“V”型齒尖略低于前側(cè)。

圖1 西藏地區(qū)馬鐵菊頭蝠外部形態(tài)和頭骨特征Fig. 1 External and craniodental characteristics of Rhinolophus ferrumequinum from Tibet， China

表2 馬鐵菊頭蝠的外形及頭骨特征比較Table 2 Comparison of external and craniodental measurements of Rhinolophus ferrumequinum

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于982 bp線粒體基因cyt b和683 bp核基因Rag2部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：本研究序列分別與從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載的馬鐵菊頭蝠序列聚為高支持度的一支，后驗概率分別為0.99（圖2：A）和0.97（圖2：B），且基于cyt b基因的貝葉斯樹顯示，本研究標本與歐洲地區(qū)（保加利亞、西班牙、斯洛伐克）馬鐵菊頭蝠指名亞種具有一定差異。另外，本研究標本與印度尼西亞和中國地區(qū)（貴州、江西、云南）的中菊頭蝠R. affinis位于不同分支。

3 討論

在形態(tài)上，馬鐵菊頭蝠與中菊頭蝠鼻葉結(jié)構(gòu)相似，但在體型及遺傳上存在差異，中菊頭蝠體型比較?。厚R鐵菊頭蝠前臂長一般大于56 mm，中菊頭蝠則小于56 mm（劉延德等，2006；Smith，解焱，2009；劉少英等，2020）。本研究標本的前臂長均大于56 mm（表2）；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，該批標本與中菊頭蝠處于不同分支，且與馬鐵菊頭蝠聚為一支（圖2）。因此，外部形態(tài)和分子結(jié)果均提示為馬鐵菊頭蝠。

圖2 基于cyt b （A）和Rag2 （B）基因構(gòu)建的菊頭蝠屬Rhinolophus貝葉斯樹Fig. 2 Bayesian trees of genus Rhinolophus based on cyt b （A） and Rag2 （B）genes

在外形和頭骨特征上，本研究標本的頭體長、脛骨長和上齒列長均與四川和貴州標本基本吻合，前臂長、尾長、顱全長、顴寬、眶間距稍大于四川和貴州標本，而耳長、腦顱寬小于四川和貴州標本（表2）。本研究標本前臂長（67.70 mm vs.貴州56.32 mm）和顱全長（25.85 mm vs.四川23.67 mm）等與四川和貴州的標本存在一定差異，但該差異是否源于遺傳差異或標本量不足仍有待核實。同時，本研究中的部分標本（GZHU 19422和GZHU 19424）上頜第一前臼齒缺失，與Csorba等（2003）報道的一致。

基于cyt b基因構(gòu)建的貝葉斯樹顯示，本研究序列與NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中的馬鐵菊頭蝠序列聚為一支的支持度較高，后驗概率為0.99，然而亞洲地區(qū)（中國吉林、河南、云南和日本、韓國）的馬鐵菊頭蝠單系性存疑（支持度較低，后驗概率為0.76）。由于該系統(tǒng)發(fā)生樹為單基因樹，因此有待進一步增加分子標記來探討該拓撲關系和開展更為細致的親緣地理學分析。

馬鐵菊頭蝠主要分布于歐洲南部、非洲北部、大多數(shù)地中海地區(qū)和東南亞地區(qū)，在中國分布有日本亞種和尼泊爾亞種（王應祥，2003），由于樣本量和數(shù)據(jù)的局限性，本研究難以明確西藏標本的亞種歸屬。值得注意的是，Wilson和Mittermeier（2019）將馬鐵菊頭蝠日本亞種提升為種，即日本馬鐵菊頭蝠R. nippon，其內(nèi)設置2個亞種，即指名亞種和尼泊爾亞種。由于該分類設置仍有待基因組學及其他證據(jù)的核實，故本研究采用魏輔文等（2021）的分類設置，但不排除后續(xù)學名變動的可能。

馬鐵菊頭蝠為廣布種，迄今為止，在中國記錄于云南、貴州、吉林、遼寧、河北、北京、河南、山東、山西、江蘇、上海、浙江、安徽、福建、湖南、廣西、四川、湖北、陜西、甘肅、寧夏、江西、重慶（王應祥，2003；Smith & 解焱，2009；蔣志剛等，2015）。本次馬鐵菊頭蝠在西藏自治區(qū)的發(fā)現(xiàn)為該區(qū)域翼手目分布新記錄，豐富了西藏地區(qū)哺乳動物物種多樣性，為西藏野生動物管理部門提供了基礎生物學數(shù)據(jù)。