劉玉猛，蔣潔蘭，毛明光*，朱詩(shī)裕，王 偉

(1.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連 116023；2.海南熱帶海洋學(xué)院崖州灣創(chuàng)新研究院，海南三亞 572024；3.海南熱帶海洋學(xué)院/海南熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南三亞 572022)

鮭鱒，是鮭魚和鱒魚的統(tǒng)稱[1]。我國(guó)鮭鱒養(yǎng)殖是從20世紀(jì)60年代開始的，經(jīng)歷了60多年的發(fā)展，已經(jīng)形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，并帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[2]。隨著國(guó)內(nèi)需求的增加，養(yǎng)殖體量也不斷增加，2018年我國(guó)第一個(gè)深海網(wǎng)箱建成并投入使用[3]，我國(guó)鮭鱒受精卵受制于歐洲，苗種是目前亟待解決的問題，優(yōu)質(zhì)的苗種可為下游養(yǎng)成打好基礎(chǔ)和保障。

丹東華美漁業(yè)有限公司位于丹東市鴨綠江畔，該公司以鴨綠江為基地，從國(guó)外引種優(yōu)質(zhì)雜交鮭，并進(jìn)行了推廣養(yǎng)殖，是當(dāng)?shù)刂匾膭?chuàng)匯來源之一。其引進(jìn)的雜交鮭優(yōu)點(diǎn)明顯，生長(zhǎng)速度快，抗病力強(qiáng)，肉質(zhì)優(yōu)良，因肉色似楓葉的顏色，故名“楓葉鮭”。由于楓葉鮭屬于外來物種，且商業(yè)品系的信息不全面，尤其是其遺傳信息不明確，這為我國(guó)自主繁育造成了瓶頸，也對(duì)該地區(qū)物種來說是一種潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域[4-5]，但其在魚類親子鑒定方面鮮見報(bào)道。筆者利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)楓葉鮭胸腺和頭腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過轉(zhuǎn)錄本拼接、基因功能注釋，揭示楓葉鮭的基因表達(dá)特點(diǎn)，根據(jù)線粒體母源傳遞的特點(diǎn)，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組中線粒體基因比對(duì)分析，確定其母本來源，并根據(jù)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄探討楓葉鮭抗病優(yōu)勢(shì)的原因，旨在為今后利用轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)快速揭示未知來源物種的遺傳信息提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料楓葉鮭由丹東華美漁業(yè)有限公司提供，為400 g。采樣所需的手術(shù)剪、咬骨鉗、鑷子等器械均事先通過高壓滅菌鍋進(jìn)行121 ℃，2 h 滅菌，采樣前使用75%乙醇擦拭且經(jīng)火焰消毒。將試驗(yàn)魚解剖，分別取胸腺和頭腎組織儲(chǔ)存于10倍體積的 RNA later。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)。利用RNA提取試劑盒提取楓葉鮭胸腺和頭腎的總RNA。為了保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，將上述提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度與濃度。將檢驗(yàn)合格的RNA用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。將上述cDNA文庫(kù)利用Qubit DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA 精確定量，以方便按照1∶1 的比例等量混合后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2文庫(kù)質(zhì)檢和測(cè)序。將上述檢驗(yàn)合格的cDNA文庫(kù)在Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，首先過濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、末端質(zhì)量低、含測(cè)序引物的reads，得到clean reads，然后再進(jìn)行de novo拼接，最后通過CAP3軟件拼接來獲得最終Unigene序列集合[6]。cDNA 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控與組裝。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)中含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列[去除帶N堿基的序列；去除reads中的接頭序列；reads 3′—5′去除低質(zhì)堿基(Q值<20)；reads 5′—3′去除低質(zhì)堿基(Q值<20)；去除reads長(zhǎng)度小于35 nt的reads及其配對(duì)reads]。為了保證信息分析質(zhì)量，必須對(duì)原始數(shù)據(jù)過濾，得到Clean數(shù)據(jù)。

1.2.4基因功能注釋和分類。利用BLAST軟件[7]將Unigene序列分別與NR(NCBI non-redundant protein sequences)[7]、NT(NCBI non-redundant nucleic acid sequences)[7]、GO(Gene ontology)[7]、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[8]、KOG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[9]、Uniprot(universal protein)[10]以及PFAM(protein family)[11]7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲得Unigene的注釋信息，并對(duì)基因功能進(jìn)行分類。獲取楓葉鮭胸腺和頭腎基因序列與近緣物種基因序列的相似性以及楓葉鮭胸腺和頭腎基因的功能信息，并按照分子功能、細(xì)胞組分和生物過程3個(gè)大類對(duì)其進(jìn)行GO功能分類。此外，還進(jìn)行了KOG功能分類，同時(shí)獲得 KEGG代謝通路分析結(jié)果。

1.2.5基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的楓葉鮭親本鑒定和雜種抗病優(yōu)勢(shì)分析。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選以及利用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)分析，將篩選得到的線粒體DNA(mtDNA)基因序列和基因組基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，分別確定楓葉鮭的母本及父本來源。將篩得到的免疫相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，探討楓葉鮭所具有的抗病優(yōu)勢(shì)來源。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)質(zhì)控采用雙端測(cè)序法并經(jīng)過質(zhì)量控制后[12]，共獲得胸腺的7.29 Gb總堿基數(shù)，GC含量為 47.73%，Q30堿基比例平均超過95.33%；共獲得頭腎的6.30 Gb 總堿基數(shù)，GC含量為 48.63%，Q30堿基比例平均超過95.12%。

2.2 轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝、拼接[12]，結(jié)果表明，胸腺樣本共得到358 880條Transcript和169 204條Unigene，Transcript與Unigene的N50分別為1 463和896 bp；頭腎樣本共得到282 289條Transcript和132 292條Unigene，Transcript與Unigene的N50分別為1 491和918 bp，表明組裝完整性較高。

2.3 基因注釋將楓葉鮭胸腺和頭腎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選所得的Unigene序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和注釋。依據(jù)各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的Unigene序列數(shù)量和比例可知，各數(shù)據(jù)庫(kù)由于篩選條件不同，成功注釋的基因數(shù)也不同。胸腺和頭腎基因中以NT數(shù)據(jù)庫(kù)成功注釋的Unigene序列最多，胸腺基因達(dá)116 178條，占68.66%；頭腎基因達(dá)92 700條，占70.07%，這與其采用序列相似性比對(duì)搜索有關(guān)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的信息最少，胸腺基因僅有3 451條，占2.04%；頭腎基因僅有3 203條，占2.42%。

2.4 NR庫(kù)比對(duì)注釋通過與NR庫(kù)的比對(duì)，結(jié)果見圖1。從圖1可見物種轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的近似情況，以及同源序列的功能信息。在所有注釋成功的 Unigene 中，與 NR庫(kù)比對(duì)的物種相比，楓葉鮭與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的基因相似度最高，其次是大西洋鮭魚(Salmosalar)，胸腺分別達(dá)32 360條(50.48%)和25 492條(39.77%)，頭腎分別達(dá)25 721條(49.90%)和20 920條(40.59%)。

注：A為胸腺，B為頭腎。 Note:A is thymus,B is head kidney.圖1 NR庫(kù)比對(duì)注釋Fig.1 NR database comparison note

2.5 功能分類注釋通過GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋，結(jié)果如圖2、3所示，胸腺中共得到50 027條注釋基因，約占總Unigene的29.57%；頭腎中共得到40 853條注釋基因，約占總Unigene的30.88%。GO數(shù)據(jù)庫(kù)將注釋基因總共分為三大類別，分別為分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組分(cellular component)。胸腺和頭腎基因中生物過程(biological process)占比最多的是細(xì)胞過程(cellular process)，分別為33 722條(67.51%)和27 959(68.44%)；細(xì)胞組分(cellular component)占比最多的是細(xì)胞(Cell)，分別為34 404(68.77%)和28 662(70.16%)；分子功能(molecular function)占比最多的是結(jié)合活性(binding)，分別為31 739(63.44%)和26 151(64.01%)。

胸腺和頭腎基因中分別有22 962條和19 648條Unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中成功進(jìn)行功能注釋，合計(jì)25類。其中數(shù)量最多的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms)，胸腺有5 044條(21.97%)，頭腎有4 072條(20.72%)。

胸腺和頭腎KEGG通路富集分類中分別有5 275和4 820個(gè)差異表達(dá)基因參與到四大類23小類代謝通路中。注釋基因最多的3個(gè)通路首先是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(signal transduction pathway)，其次是運(yùn)輸和分解代謝通路(transport and catabolism pathway)，排第3位的通路在胸腺和頭腎中分別為細(xì)胞群落通路(cellular community pathway)和折疊分類和降解通路(folding sorting and degradation pathway)。

圖2 GO注釋上的胸腺基因功能分類Fig.2 The functional classification of thymus genes on GO annotation

圖3 GO注釋上的頭腎基因功能分類Fig.3 The functional classification of head and kidney genes on GO annotation

2.6 楓葉鮭mtDNA及基因組信息分析將胸腺和頭腎Unigene序列中與mtDNA相關(guān)的基因和基因組基因進(jìn)行篩選，分別篩選出與mtDNA相關(guān)基因序列和基因組基因序列，再利用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果見表1、2。通過mtDNA基因序列包含12S rRNA、16S rRNA、28S rRNA、細(xì)胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)和細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase)在內(nèi)的基因序列比對(duì)結(jié)果以及根據(jù)mtDNA具有的母系遺傳特點(diǎn)[13-14]，可以初步判斷楓葉鮭的母本為虹鱒(Oncorhynchusmykiss)(表1)。

通過比對(duì)基因組基因序列包含E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,E3)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)、T細(xì)胞表面抗原CD2(T-cell surface antigen CD2,CD2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)、不依賴陽離子的甘露糖-6-磷酸受體(Cation-independent mannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)型含SH2蛋白(Cytokine-inducible SH2-containing protein,CISH)、肌生成調(diào)節(jié)糖苷酶(Myogenesis-regulating glycosidase,MYORG)結(jié)果可知，在大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅大麻哈魚(Oncorhynchusnerka)、銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)和大麻哈魚(Oncorhynchusketa)4種魚的基因序列比對(duì)中，基因組基因序列的同源性和大鱗大麻哈魚最高，因此初步判斷父本為大鱗大麻哈魚。

表1 線粒體基因序列比對(duì)結(jié)果Table 1 Results of mitochondrial gene sequence alignment

表2 基因組基因序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Genomic gene sequence alignment results

2.7 楓葉鮭抗病優(yōu)勢(shì)基因?qū)⑿叵俸皖^腎Unigene序列中與免疫相關(guān)的基因進(jìn)行篩選，再利用BLAST在線分析軟件對(duì)免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、T淋巴細(xì)胞相關(guān)基因(T lymphocyte related genes)和B淋巴細(xì)胞相關(guān)基因(B lymphocyte related genes)的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果見表3。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，推測(cè)雜交優(yōu)質(zhì)品種楓葉鮭所具有的抗病優(yōu)勢(shì)是遺傳其親本虹鱒而來。

表3 免疫相關(guān)基因序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Sequence alignment results of immune-related gene

3 討論與結(jié)論

3.1 楓葉鮭胸腺和頭腎無參轉(zhuǎn)錄組的組裝與注釋該研究對(duì)楓葉鮭進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組信息作出了親本鑒定和雜種優(yōu)勢(shì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。為了獲取楓葉鮭轉(zhuǎn)錄組信息，在未參照基因組的情況下對(duì)其胸腺、頭腎這2種組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)控后，采用Trinity軟件[15]組裝、拼接和轉(zhuǎn)錄本功能注釋，共得到13.59 Gb的轉(zhuǎn)錄組clean data信息，Q30堿基比例均超過95%。從轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量來看，測(cè)序數(shù)據(jù)的各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)序質(zhì)量較高，達(dá)到后續(xù)數(shù)據(jù)組裝分析的要求。

該研究分別對(duì)楓葉鮭胸腺和頭腎組織轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)組裝的169 204條Unigene和132 292條Unigene進(jìn)行了GO功能分類、KOG功能分類和KEGG代謝通路等分析。通過GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋，胸腺Unigene注釋比例較頭腎少1.31百分點(diǎn)。在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中成功進(jìn)行功能注釋的胸腺和頭腎Unigene序列，其中數(shù)量最多的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，胸腺Unigene注釋比例較頭腎多1.25百分點(diǎn)。通過KEGG代謝通路分析得到的胸腺Unigene注釋比例較頭腎少1.13百分點(diǎn)。該研究通過功能分類注釋獲得了大量的楓鮭胸腺和頭腎組織轉(zhuǎn)錄組信息，并且初步闡明楓鮭胸腺和頭腎組織相關(guān)的基因功能以及生物學(xué)過程、代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這對(duì)將來深入了解楓葉鮭基因功能至關(guān)重要，并為發(fā)掘楓葉鮭相關(guān)功能基因和研究相關(guān)生理功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 利用線粒體基因與基因組基因信息判斷楓葉鮭的遺傳背景線粒體是具有自身基因組的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，現(xiàn)已被證明至少有4種表觀遺傳機(jī)制：①調(diào)節(jié)核基因組表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制通過調(diào)節(jié)核編碼線粒體基因的表達(dá)來影響線粒體；②核基因的甲基化模式由細(xì)胞特異性mtDNA含量和線粒體活性決定;③核基因表達(dá)模式和核DNA甲基化水平受mtDNA變異影響;④mtDNA也被表觀遺傳修飾[16]。表觀遺傳修飾往往在不改變DNA序列的情況下引起基因表達(dá)的改變，包括DNA甲基化、非編碼RNA活性、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等[17-18]。作為一種常見的表觀遺傳現(xiàn)象，DNA甲基化可以改變DNA構(gòu)象或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及DNA的穩(wěn)定性，DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方式，并最終調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[19-21]。動(dòng)物mtDNA幾乎完全遺傳其母系而來，父本線粒體在受精過程中迅速降解[22]或在此后的復(fù)制過程中缺失[23]。 最新研究結(jié)果傾向于支持“瓶頸假說”，即mtDNA的母系遺傳是由上一代基因型的少數(shù)特殊種系mtDNA分子的差異擴(kuò)增介導(dǎo)的[24]。在現(xiàn)有的用于系統(tǒng)發(fā)育研究的基因中，Cyt b的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA上是較為清楚的，也是常用于進(jìn)行物種分類鑒定的基因[25]?；诰€粒體表觀遺傳受多種機(jī)制調(diào)控及DNA甲基化修飾調(diào)節(jié)機(jī)體基因表達(dá)等特點(diǎn)，再結(jié)合mtDNA母系遺傳的特點(diǎn)，該研究對(duì)楓葉鮭的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行處理分析，將篩選得到的mtDNA基因序列及基因組基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，最終初步得出虹鱒是母本，大鱗大麻哈魚是父本的結(jié)論。比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，有的基因組基因如肌生成調(diào)節(jié)糖苷酶與銀大麻哈魚的同源性也達(dá)到100%，這可能由楓葉鮭商業(yè)化生產(chǎn)中父本的來源不確定造成，因此對(duì)于父本鑒定的準(zhǔn)確性仍有待進(jìn)一步完善。

3.3 雜交鮭抗病優(yōu)勢(shì)雜交育種在水產(chǎn)動(dòng)物的品種改良和生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。該方法利用孟德爾遺傳定律，如分離和自由組合定律及連鎖互換定律，重新構(gòu)建生物體的遺傳力，創(chuàng)造出理想的變異體[26]。雜交育種不產(chǎn)生新的基因，而是將現(xiàn)有生物資源的基因和性狀進(jìn)行重組，將分散在不同群體中的基因組合起來，建立符合人們意愿的基因型和表型[26-27]。而雜種優(yōu)勢(shì)是自然界普遍存在的生物現(xiàn)象，是指雜種后代在多個(gè)性狀(品質(zhì)、產(chǎn)量、適應(yīng)性、抗逆性、繁殖能力和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等)上超越親本的現(xiàn)象[28-30]。該研究中的楓葉鮭則是具有優(yōu)良抗病性狀的雜交鮭，對(duì)其抗病優(yōu)勢(shì)的遺傳信息進(jìn)行分析能更好地為其他水產(chǎn)動(dòng)物的雜交育種奠定基礎(chǔ)。

硬骨魚類的IgM為四聚體免疫球蛋白，在魚類的體液免疫中發(fā)揮著重要作用[31]，并對(duì)各種抗原產(chǎn)生有效的特異性體液抗體反應(yīng)。IgM是B淋巴細(xì)胞最早產(chǎn)生的免疫球蛋白分子,也是B淋巴細(xì)胞分化過程中的主要表面標(biāo)志[32]。細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)和控制免疫反應(yīng)的分子進(jìn)化過程中是高度保守的[33]。TNF-α是細(xì)胞因子家族的重要成員之一，是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體的重要因素，是一種重要的抗癌因子[34]。除了引起腫瘤細(xì)胞出血性壞死而凋亡外，它還可以介導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)免疫功能[34-35]。綜合IgM和TNF-α在魚類機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中所起到的重要作用，該研究篩選出了楓葉鮭轉(zhuǎn)錄組信息中的IgM、TNF-α基因序列和T、B淋巴細(xì)胞相關(guān)基因序列，并進(jìn)行了物種同源性比較。

該研究在探討了楓葉鮭品種的親本分別是虹鱒(母本)和大鱗大麻哈魚(父本)之后，對(duì)其抗病優(yōu)勢(shì)進(jìn)行分析，盡管該研究所列出的免疫相關(guān)基因序列與母本虹鱒的同源性更高，但根據(jù)雜交所產(chǎn)生的基因、性狀重組以及雜交子代會(huì)出現(xiàn)的雜種優(yōu)勢(shì)，又因?yàn)闂魅~鮭在商業(yè)化生產(chǎn)過程中父本的來源具有不確定性，因此，初步判斷楓葉鮭所具有的雜種抗病優(yōu)勢(shì)是由其親本雙方的抗病優(yōu)勢(shì)基因的基因重組所產(chǎn)生的結(jié)果。

該研究應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)楓葉鮭遺傳信息進(jìn)行了探討，可以快速判斷父、母本的來源，并獲得大量遺傳信息，具有較好的應(yīng)用前景，后續(xù)也可為其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的親本鑒定和雜種優(yōu)勢(shì)分析提供科學(xué)依據(jù)。