■杜 穩(wěn) 孫 晶 趙一凡 孫長坡 尹 鵬 劉虎軍*

(1.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037；2.國家糧食與物資儲備局標(biāo)準質(zhì)量中心，北京 100037)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）又稱嘔吐毒素，是一種由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族劇毒次級代謝產(chǎn)物，主要在作物生長、儲藏、加工等環(huán)節(jié)造成污染[1-2]。DON 污染嚴重影響了糧食、飼料以及相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)及質(zhì)量安全，對人和動物的生命健康造成重大威脅。研究表明，長期暴露于低劑量的DON 下，人和動物會產(chǎn)生慢性不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[3-6]，當(dāng)攝入過量的DON，會出現(xiàn)急性中毒癥狀，嚴重時導(dǎo)致直接死亡[7-8]。因此，去除糧油及飼料中的DON意義重大。

德沃斯氏菌（Devosiasp.）屬好氧型或者兼性厭氧型革蘭氏陰性菌，于1996 年由Nakagawa 等[9]根據(jù)16S rRNA序列分析和化學(xué)分類方法進行歸類劃分。近年研究表明該菌可以高效降解DON[10]，可以產(chǎn)生兩種降解酶（DepA和DepB），其中DepA作為氧化酶，DepB作為還原酶，作用于DON的3位羥基，使DON發(fā)生異構(gòu)化，形成具有低毒性的DON異構(gòu)體（3-epi-DON），從而達到安全高效降解DON的效果[11-14]。此外，動物毒理性和安全性評價表明德沃斯氏菌低毒且安全，動物有效性評價表明它可以有效緩解DON引起的平均日增重和平均日采食量降低、肝臟腫大等癥狀[10，15]。目前，對德沃斯氏菌的發(fā)酵工藝研究相對較少，因此，提高菌株發(fā)酵生物量，將該菌應(yīng)用于飼料中的DON降解，在畜牧生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Back propagation neural network）是一種多層前反饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以實現(xiàn)從輸入到輸出的任意非線性映射[16]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）是依據(jù)達爾文的“適者生存”學(xué)說發(fā)展起來的一種組合優(yōu)化算法，它將一組變量進行二進制編碼，并將這些編碼排列組合，形成基因鏈，并定義為個體，將一定量的個體形成種群，并在種群中將各個體進行選擇、交叉、變異等操作來實現(xiàn)遺傳機制，以適應(yīng)度函數(shù)作為評價依據(jù)，不斷進行迭代進化，逐漸逼近并得到最優(yōu)解[17-19]。將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與GA進行耦合，可以在試驗變量組成的多維空間立體范圍內(nèi)進行全局尋優(yōu)，從而使優(yōu)化過程更加快速精準，結(jié)果具有更高的準確性。雷虹等[20]通過該方法優(yōu)化細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后細菌纖維素產(chǎn)量提高了1.18倍，王云龍等[21]通過該對L-天冬酰胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，酶活較優(yōu)化前提高了90.9%。

在之前的工作中，本團隊篩選獲得了一株高效降解DON的德沃斯氏菌D-8[22]，為提高該菌發(fā)酵培養(yǎng)的生物量，本研究通過單因素、正交試驗以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA 等對該菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期獲得發(fā)酵培養(yǎng)該菌株的最佳培養(yǎng)基，為該菌的后期工業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種與培養(yǎng)基

降解DON的德沃斯氏菌D-8，由國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油加工研究所糧油真菌毒素防控實驗室提供。

活化培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 試劑及儀器

酵母浸粉、蛋白胨，Thermo Fisher Scientific公司；NaCl、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4，國藥集團。

Ecotron 型恒溫搖床，瑞士Infors 公司；HV-110型滅菌鍋，日本NIRAYAMA 公司；Evolution 300 紫外可見分光光度計，美國Thermo Fisher 公司；PP60 型pH計，德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化與種子液的制備

將保藏于-80 ℃冰箱的D-8菌種取出，室溫解凍后在活化培養(yǎng)平皿上進行三區(qū)劃線復(fù)蘇，30 ℃培養(yǎng)16 h。將復(fù)蘇的D-8 單菌落轉(zhuǎn)劃到新的活化培養(yǎng)基平皿上，30 ℃培養(yǎng)48 h 后挑取單菌落接到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，獲得種子液。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件及生物量的測定

將種子液以5%的接種量接到無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)30 h，發(fā)酵結(jié)束后測定培養(yǎng)液生物量，并以O(shè)D600nm表示。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

1.3.3.1 碳源、氮源的篩選

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定氮源與無機鹽，分別添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、麥芽糊精、甘油、麩皮、糖蜜作為碳源，研究不同碳源對D-8菌生長的影響。

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定最佳碳源（20 g/L添加量）與無機鹽，分別選擇添加10 g/L 的有機氮源（胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、月示蛋白胨、魚蛋白胨）、無機氮源（硫酸銨、尿素）、生物復(fù)合氮源（玉米漿干粉、棉籽餅粉、花生餅粉、黃豆餅粉）作為氮源，研究不同氮源對D-8菌生長的影響。

發(fā)酵生物量以O(shè)D600nm作為檢測指標(biāo)，以添加不同碳源、氮源的培養(yǎng)基作為對照，含有生物復(fù)合氮源的發(fā)酵液1 000 r/min 離心10 s 去除不溶沉淀后進行OD600nm檢測。

1.3.3.2 碳源、氮源最佳添加量的優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基固定無機鹽的基礎(chǔ)上，選擇最佳氮源（10 g/L 添加量），分別將最佳碳源設(shè)定10、15、20、25、30、35 g/L 和40 g/L，研究最佳碳源添加量對D-8菌生長的影響。在固定無機鹽的基礎(chǔ)上，選擇最佳碳源及添加量，分別將最佳氮源設(shè)定為5、10、15、20、25 g/L 和30 g/L，研究最佳氮源不同添加量對D-8 菌生長的影響。

1.3.3.3 無機鹽和微量元素主要因子篩選試驗

基于碳源、氮源的優(yōu)化結(jié)果，選取NaCl、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4等7 個因素，各因素分別設(shè)計高低兩個水平，采用Design Expert 12.0軟件進行部分因子試驗設(shè)計，并進行數(shù)據(jù)分析與模型的建立，篩選影響D-8 菌生長的主要因素。7個因素的編碼及水平見表1。

表1 無機鹽及微量元素部分因子試驗設(shè)計

1.3.3.4 無機鹽及微量元素最佳添加量優(yōu)化

在最佳碳源、氮源及最佳添加量的基礎(chǔ)上，選擇無機鹽和微量元素主要影響因素，分別設(shè)置KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 添加量為1、2、3、4、5、6、7、8 g/L，確定各因素的最佳添加量。

1.3.3.5 正交試驗

將篩選出的碳源、氮源、無機鹽作為變量，選擇4 因素3水平進行正交試驗，各因素及水平見表2。根據(jù)試驗設(shè)計出的不同組別進行發(fā)酵試驗。

表2 各因素正交表L9（34）（g/L）

1.3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及GA優(yōu)化尋優(yōu)

使用Python 2.7 軟件，以正交試驗和結(jié)果作為訓(xùn)練和測試數(shù)據(jù)樣本，根據(jù)培養(yǎng)基各組分和發(fā)酵生物量確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入輸出，構(gòu)建BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并用GA 對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的初始權(quán)值和閾值進行優(yōu)化，通過對培養(yǎng)基各因素全局尋優(yōu)確定最佳培養(yǎng)基配比。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗重復(fù)3 次取平均值，試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 12.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本T檢驗進行分析，顯著性水平設(shè)定為0.05；3組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析的Duncan’s法進行兩兩比較，顯著性水平同樣設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源、氮源的篩選

不同碳源對D-8 菌生長的影響結(jié)果如圖1a 所示，糖蜜作為碳源時，D-8 菌的生物量顯著高于其他碳源（P＜0.05），OD600nm為10.36；其次為蔗糖，說明以蔗糖為主的碳源更有利于該菌的生長。不同氮源對D-8菌生長的影響結(jié)果如圖1b所示，當(dāng)酵母浸粉作為氮源時，D-8 菌的生物量顯著高于其他氮源（P＜0.05），OD600nm為9.39。而利用無機氮源及其他有機氮源效果相對較差，說明其利用大蛋白能力及氮轉(zhuǎn)化能力較弱。

圖1 碳源、氮源的篩選

2.2 碳源、氮源最佳添加量的優(yōu)化

碳源的最佳添加量由圖2a 可見，隨著糖蜜添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)糖蜜添加量為25 g/L時生物量最大，OD600nm為12.49，隨著糖蜜添加量的繼續(xù)增加，生物量逐漸下降，由此可見，糖蜜的適宜添加范圍為20～30 g/L。氮源的最佳添加量由圖2b可見，隨著酵母浸粉添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)?shù)刺砑恿繛?0 g/L 時生物量最大，OD600nm為12.62，隨著酵母浸粉添加量的增加，生物量逐漸下降。由此可見，酵母浸粉的適宜添加范圍為10～20 g/L。

圖2 碳源、氮源最佳添加量

2.3 無機鹽和微量元素主要影響因子篩選試驗

為避免在后期優(yōu)化試驗中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費試驗資源，采用多因素部分因子試驗設(shè)計從眾多因素中快速有效地篩選出對試驗結(jié)果有顯著影響的因素。采用Design Expert 12.0軟件進行多因素部分因子試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，各因素的主要效應(yīng)分析見表4。通過方差分析，模型的F值為5.21，P＜0.05，表明模型顯著。根據(jù)P值可以看出，各無機鹽及微量元素的顯著因素為B（KH2PO4）、C（K2HPO4）、D（Na2HPO4·12H2O）。根據(jù)方差分析得到各因素的回歸方程：Y=9.105 13-0.318A+0.597B-0.54C+0.652D-0.206E-0.358F-0.04G。由方程各因素系數(shù)可見，K2HPO4為負效應(yīng)，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 為正效應(yīng)，所以對這兩個正效應(yīng)因素進行研究。

表3 主要因子篩選兩水平部分試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 主要因子篩選試驗結(jié)果顯著性分析

2.4 無機鹽最佳添加量優(yōu)化

無機鹽的最佳添加量如圖3所示，隨著KH2PO4添加量的增加，D-8 菌的生物量隨之增加，當(dāng)其添加量為4 g/L 時，生物量達到最大值，OD600nm為12.55，此后逐漸下降。隨著Na2HPO4·12H2O 添加量的增加，D-8菌的生物量隨之增加，當(dāng)其添加量為6 g/L時，生物量達到最大值，OD600nm為13.4，此后逐漸下降。通過單因素優(yōu)化后，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的最佳添加量分別為4 g/L 和6 g/L，KH2PO4的添加范圍為3～5 g/L，Na2HPO4·12H2O的添加范圍為5～8 g/L。

圖3 無機鹽最佳添加量

2.5 正交試驗結(jié)果及方差分析

以D-8 菌發(fā)酵后的生物量（OD600nm）為指標(biāo)進行正交試驗，以獲得各組分在不同濃度下的試驗數(shù)據(jù)結(jié)果，每個試驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，結(jié)果見表5。由試驗結(jié)果可以看出，第6 組試驗的發(fā)酵結(jié)果最佳，D-8 菌的最大生物量為13.778。根據(jù)極差可以看出4 個因素對D-8菌生長的影響主次順序分別為糖蜜＞KH2PO4＞酵母浸粉＞Na2HPO4·12H2O。

對正交試驗結(jié)果進行方差分析，因為4因素的正交表試驗誤差自由度為1，各因素變異來源的F值不靈敏且不顯著，通過分析正交試驗結(jié)果，Na2HPO4·12H2O添加量變化對試驗結(jié)果的波動影響最小，所以將該因素的各變異項的離差平方和和自由度并入誤差項的平方和及自由度，從而提高假設(shè)檢驗的靈敏度，通過方差分析，結(jié)果見表6。由表6 可見，糖蜜添加量變化對D-8菌的生長具有顯著性（P＜0.05），酵母浸粉和KH2PO4的添加量變化對D-8菌的生長不顯著（P＞0.05）。

表6 D-8菌發(fā)酵正交試驗方差分析

2.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA優(yōu)化最佳培養(yǎng)基配方

2.6.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

在正交試驗中，各個因素濃度梯度設(shè)置較大，為更加快速、精準地優(yōu)化各組分的最佳配比，以發(fā)酵培養(yǎng)基組分（糖蜜、酵母浸粉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O）作為BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入神經(jīng)元，以發(fā)酵后D-8 菌的生物量（OD600nm）作為輸出神經(jīng)元，以表5 中9 組正交試驗及結(jié)果作為訓(xùn)練集，構(gòu)建拓撲結(jié)構(gòu)為4-N-1 的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。將變量數(shù)據(jù)進行歸一化處理，收斂精度在[0,1]之間，輸入層-隱含層以tansig函數(shù)傳遞，隱含層-輸出層以pureline 函數(shù)傳遞，訓(xùn)練函數(shù)為梯度下降函數(shù)trainlm，設(shè)置最大迭代次數(shù)1 000 次，學(xué)習(xí)目標(biāo)為10-3，學(xué)習(xí)率為0.1。以訓(xùn)練誤差大小作為指標(biāo)，經(jīng)過訓(xùn)練后，確定隱藏神經(jīng)元節(jié)點數(shù)為10個，訓(xùn)練擬合決定系數(shù)R2為0.910 88，說明經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能較好地對數(shù)據(jù)樣本進行擬合，實測值和預(yù)測的結(jié)果見圖4。

圖4 實測值與預(yù)測值比較

2.6.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA的優(yōu)化結(jié)果及驗證

R2作為決定系數(shù)評價神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的好壞，R2越接近1，說明構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型越好。在構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的初始權(quán)值和閾值是隨機產(chǎn)生的，所以為了使構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合更加精確，使用GA優(yōu)化對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值和閾值進行優(yōu)化，以得到最佳的權(quán)值和閾值，從而構(gòu)建擬合更加精確的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置GA的初始化種群規(guī)模為50，遺傳代數(shù)100代，GA采用ga函數(shù)，經(jīng)過選擇、交叉和變異，通過遺傳迭代57次，適應(yīng)度達到最大值，誤差平方和達到最小且趨于穩(wěn)定，迭代曲線見圖5，GA優(yōu)化后得到最佳模型。將培養(yǎng)基4種組分分別選擇合適的步長并進行全局尋優(yōu)，在53 361種組合中選擇最大的預(yù)測值即OD600nm為14.53，4種培養(yǎng)基組分為：糖蜜30 g/L，酵母浸粉20 g/L，KH2PO44.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 7 g/L。利用此配方重復(fù)3次進行驗證試驗，發(fā)酵結(jié)束后，D-8菌的OD600nm為14.68，與預(yù)測值較為接近，說明該優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)模型可以有效地預(yù)測D-8菌的最佳培養(yǎng)基。

圖5 遺傳迭代圖

3 討論

鄒球龍等[23]的研究表明，蔗糖可以作為有效碳源應(yīng)用于德沃斯氏菌的培養(yǎng)基優(yōu)化，本研究中優(yōu)化的最佳碳源為糖蜜，糖蜜中總糖含量為40%～50%，且主要為蔗糖（30%～40%），說明該菌可以很好地利用蔗糖作為碳源，這與鄒球龍等[23]的研究結(jié)果相一致。此外，糖蜜作為碳源較蔗糖效果更佳，分析原因，糖蜜作為蔗糖生產(chǎn)加工的副產(chǎn)物，其主要成分除糖類之外還含有蛋白質(zhì)及豐富的微量元素和活性物質(zhì)[24]，能有效地促進該菌的生長；并且在工業(yè)生產(chǎn)中，糖蜜的價格相較于蔗糖更加低廉，有利于降低發(fā)酵生產(chǎn)成本。優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基中無機鹽為KH2PO4、Na2HPO4·12H2O，而這兩個組分是磷酸緩沖液的主要成分；通過優(yōu)化，這兩個組分以一定比例組合，構(gòu)成了適用于該菌發(fā)酵生長的緩沖體系，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，調(diào)控了發(fā)酵液中的酸堿環(huán)境和滲透壓，從而使D-8菌的發(fā)酵生物量得以增加。

以正交試驗及結(jié)果作為訓(xùn)練樣本進行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并耦合GA對該模型進行優(yōu)化后全局尋優(yōu)，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并以該配方進行驗證，D-8菌生物量（OD600nm）為14.68，與模型預(yù)測值相差1.01%，說明優(yōu)化后的模型可以有效地預(yù)測該菌株的最佳培養(yǎng)基。該菌培養(yǎng)基優(yōu)化前生物量僅為2.137，正交試驗優(yōu)化后生物量為13.778，而BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合GA優(yōu)化后，生物量是優(yōu)化前的6.87倍，比正交試驗提高了6.55%，較正交試驗結(jié)果顯著提高（P＜0.05），說明該方法能更為有效地優(yōu)化了D-8 菌的培養(yǎng)基配比。后續(xù)將在此配方的基礎(chǔ)上，進行發(fā)酵條件的優(yōu)化及規(guī)?；l(fā)酵放大，以進一步提高該菌的生物量，為該菌在糧油加工及飼料生產(chǎn)行業(yè)生物法脫除DON提供有力幫助。

4 結(jié)論

本研究對一株可以降解DON 的德沃斯氏菌D-8進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，以該菌發(fā)酵生物量（OD600nm）作為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和部分因子設(shè)計試驗，篩選并確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽及各組分的濃度范圍。以正交試驗及結(jié)果作為訓(xùn)練樣本進行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建，并耦合GA對該模型進行優(yōu)化后全局尋優(yōu)得到最佳的培養(yǎng)基配比：糖蜜30 g/L、酵母浸粉20 g/L、KH2PO44.4 g/L、Na2HPO4·12H2O 7 g/L，生物量為14.68。該培養(yǎng)基配方為D-8菌株后續(xù)規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。