高 立，徐 飄，任嬌艷

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

α-碳作為氨基酸的立體中心，連接著氨基、羧基、氫原子和側(cè)鏈基團(tuán)，自然界構(gòu)成蛋白質(zhì)的20 種氨基酸中，除甘氨酸外，其他19 種氨基酸的α-碳均可作為手性碳原子而使其具有兩個(gè)互為鏡像的立體異構(gòu)體（D-和L-）（圖1）。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為L-氨基酸是參與生命活動(dòng)的主體，而D-氨基酸在生物體內(nèi)的存在及生理活性尚未被重視。隨著氨基酸手性分析技術(shù)發(fā)展，在包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物、植物、微生物等有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)存在大量D-氨基酸及含有D-氨基酸的生物活性肽。越來越多的研究證實(shí)，D-氨基酸具備獨(dú)特的生理活性（如在神經(jīng)信號傳導(dǎo)、激素調(diào)節(jié)等方面），且含有D-氨基酸的肽（如細(xì)胞信號肽及宿主防御肽等）也在生物體中發(fā)揮著不可替代的功能[1-2]，這表明D-氨基酸與人體健康密切相關(guān)。

圖1 L-/D-氨基酸的立體構(gòu)型示意圖Fig.1 Diagram of stereoscopic configuration of L-/D-amino acids

食品中存在的D-氨基酸也不容忽視。研究表明，人類日均從食物中攝入高達(dá)100 mg的D-氨基酸[3]。食品中的D-氨基酸主要在某些加工條件下產(chǎn)生，少量來自食品原料本身。天然D-氨基酸含量較高的食物主要為果蔬，其D-氨基酸的相對含量約在0.7%～3.4%[4]。加工食品中尤以發(fā)酵制品的D-氨基酸相對含量較高（通常高于8%），這主要源于微生物的新陳代謝活動(dòng)，同時(shí)也與發(fā)酵條件（pH值、溫度等）密切相關(guān)。其中，乳酸發(fā)酵是產(chǎn)生D-氨基酸的重要途徑之一[5]，例如乳酸發(fā)酵的酸奶中D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸相對含量分別高達(dá)53.8%、40.3%、24.2%[6]。不僅如此，D-氨基酸在食品的風(fēng)味形成及抗菌防腐方面具有突出貢獻(xiàn)，但目前關(guān)于其機(jī)制研究尚不充分。由此可見，食品中的D-氨基酸與人類健康密切相關(guān)，深入理解D-氨基酸的形成機(jī)制及其生理功能對于有效調(diào)控食品加工中的D-氨基酸及發(fā)掘其潛在營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

1 食品中的D-氨基酸及其形成機(jī)制

天然食品中存在一定量的D-氨基酸（表1）。更值得關(guān)注的是，特定的食品加工條件可引發(fā)L-氨基酸外消旋形成D-氨基酸。

表1 天然食品中的D-氨基酸含量Table 1 Contents of D-amino acids in natural foods

1.1 微生物發(fā)酵

目前的研究認(rèn)為，發(fā)酵食品中的D-氨基酸主要是由微生物消旋酶的作用而產(chǎn)生。用于食品發(fā)酵的菌株主要為酵母菌、乳酸菌、醋酸菌，其對發(fā)酵食品中D-氨基酸的形成具有不可忽視的作用[10]。

研究人員測定了11 種不同工藝發(fā)酵制成的食醋中D-氨基酸含量，結(jié)果表明，相對于未經(jīng)乳酸發(fā)酵體系中總D-氨基酸濃度（237.7 μmol/L）而言，經(jīng)乳酸發(fā)酵后體系中總D-氨基酸濃度（3773.2 μmol/L）顯著增加；而在酒精或醋酸發(fā)酵期間未有如此顯著的增加。這體現(xiàn)乳酸菌較酵母菌和醋酸菌而言產(chǎn)D-氨基酸的能力更強(qiáng)[10]。隨著紅葡萄酒和白葡萄酒發(fā)酵的進(jìn)行，D-丙氨酸、D-谷氨酸和D-賴氨酸的濃度均增加，并且在這兩種酒中分別檢測到除釀酒酵母外的乳酸菌（酒酒球菌）和醋酸菌（食蔗糖葡糖酸醋桿菌）。D-丙氨酸、D-谷氨酸可能由這些微生物中含有的丙氨酸消旋酶和谷氨酸消旋酶同系物作用而形成，但D-賴氨酸的來源尚未明晰，推測可能是由其中底物特異性較低的消旋酶作用而產(chǎn)生[11]。在日本清酒的釀造過程中，釀造用水、釀造工藝、大米拋光率、清酒酵母種類以及清酒中存在的微生物都會(huì)影響其中D-氨基酸濃度。Gogami等從日本清酒中檢測到15 種D-氨基酸（D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-組氨酸、D-酪氨酸、D-賴氨酸、D-絲氨酸、D-纈氨酸和D-苯丙氨酸），其中以D-丙氨酸、D-天冬氨酸和D-谷氨酸濃度最高（66.9～524.3 μmol/L），D-對映體占比分別為34.4%、12.0%和14.6%[12]。該研究團(tuán)隊(duì)隨后又發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)生的D-氨基酸對清酒風(fēng)味具有突出貢獻(xiàn)，尤其是D-丙氨酸含量升高可提升清酒的鮮味[13]。Erbe等[14]檢測了多種啤酒中的D-氨基酸含量，其總D-氨基酸質(zhì)量濃度為12.2～88.8 mg/L（0.7%～11.7%）；其中，柏林白啤酒的D-丙氨酸（22.5 mg/L；30.1%）和D-脯氨酸（51.9 mg/L；21.1%）含量之高尤為突出，此外還檢測到D-天冬氨酸（5.2 mg/L；14.7%）、D-谷氨酸（6.6 mg/L；10.9%）、D-賴氨酸（1.3 mg/L；4.0%）和D-苯丙氨酸（1.3 mg/L；3.2%），Erbe等[14]推測這些D-氨基酸的產(chǎn)生主要緣于乳酸菌中消旋酶的作用。隨著存放時(shí)間的延長，食醋和酒中的D-氨基酸含量也有所增加[14-15]。發(fā)酵乳制品酸奶和奶酪中也含有豐富的D-氨基酸，如奶酪中相對含量較高的D-丙氨酸、D-天冬氨酸和D-谷氨酸的占比范圍分別達(dá)16.1%～48.1%、13.9%～46.3%和10.9%～26.6%；另外還存在相對豐度較低的D-賴氨酸、D-纈氨酸、D-脯氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸等[16]。酸奶也主要含有D-丙氨酸、D-谷氨酸和D-天冬氨酸[16]。發(fā)酵乳制品中的D-氨基酸含量也是評價(jià)發(fā)酵程度的指標(biāo)之一[17]。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的橙汁含有游離D-纈氨酸（62.3%）、D-丙氨酸（32.7%）、D-苯丙氨酸（20.0%）、D-谷氨酸（24.3%）、D-絲氨酸（2.6%）、D-天冬氨酸（0.8%）[18]。Abe等[19]測定了60 種發(fā)酵魚露中的游離D-氨基酸，主要存在的D-氨基酸為D-丙氨酸、D-天冬氨酸和D-谷氨酸，其中以D-丙氨酸含量最高。值得注意的是，多數(shù)D-氨基酸（除D-脯氨酸和D-天冬氨酸外）具有甜味，對于發(fā)酵食品的風(fēng)味具有獨(dú)特的貢獻(xiàn)[13,19-20]。各類乳制品及發(fā)酵食品中的D-氨基酸含量如表2和表3所示。

表2 乳制品中的D-氨基酸含量Table 2 Contents of D-amino acids in dairy products

表3 其他發(fā)酵食品中的D-氨基酸含量Table 3 Contents of D-amino acids in other fermented foods

1.2 溫度和pH值

除了在相關(guān)酶的催化下可形成D-氨基酸外，極端pH值和/或加熱條件也可誘導(dǎo)食品中的L-氨基酸發(fā)生外消旋化而形成D-氨基酸。

未陳年和陳年的日本甜米酒中均有D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-絲氨酸、D-纈氨酸、D-酪氨酸檢出；陳年甜米酒中的D-丙氨酸（2.1%～15.1%）、D-天冬氨酸（0.3%～10.9%）、D-谷氨酸（0.4%～54.2%）的平均含量占比高于未陳年甜米酒[25]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甜米酒熟化過程中伴隨著美拉德反應(yīng)，同時(shí)體系pH值會(huì)隨著熟化時(shí)間延長而降低，D-天冬氨酸的占比也受pH值的影響：D-天冬氨酸在pH 4.0時(shí)的占比（11.3%）高于pH 5.6（5.1%）。陳年甜米酒中D-氨基酸含量較高可能是由不同pH值下烯醇化途徑的變化引起的。美拉德反應(yīng)中Amadori重排產(chǎn)物在酸性條件下主要經(jīng)歷1,2-烯醇化，在中性條件下主要經(jīng)歷2,3-烯醇化[31]，而所有烯醇（1,2-和2,3-烯醇）可以形成各自的碳陰離子，故Inoue等[25]推測兩個(gè)碳負(fù)離子之間的結(jié)構(gòu)差異會(huì)影響氨基酸的外消旋度。Taniguchi等[24]探究了在不同儲(chǔ)藏溫度下的泡菜中游離D-氨基酸含量的變化，12 種D-氨基酸（D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-絲氨酸、D-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-天冬酰胺、D-組氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-酪氨酸和D-甲硫氨酸）的含量隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長均升高，且在25 ℃下的變化較4 ℃顯著，尤其是在25 ℃下D-丙氨酸、D-谷氨酸和D-精氨酸的占比分別高達(dá)22.2%、23.4%和34.3%。

在一定溫度和pH值的食品加工體系中常伴隨著美拉德反應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)產(chǎn)物中的Amadori化合物也是D-氨基酸形成的一種前體[31-32]。P?tzold等[31]發(fā)現(xiàn)在微波爐中對蜂蜜進(jìn)行微波加熱（180 W、3 min或700 W、1 min）處理后，D-氨基酸含量顯著增加，并指出D-天冬氨酸、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸和D-亮氨酸可以在體系中葡萄糖的誘導(dǎo)下消旋形成。P?tzold等提出的外消旋化機(jī)制為：美拉德反應(yīng)的Amadori重排產(chǎn)物形成后，氨基酸與葡萄糖的反應(yīng)便開始。Amadori重排產(chǎn)物容易發(fā)生烯醇化，烯醇化有利于從鍵合氨基酸的α-碳原子中提取質(zhì)子，形成中間體sp3雜化碳陰離子。這些反應(yīng)也可能有利于分子內(nèi)氫橋的形成。平面碳負(fù)離子的兩側(cè)可發(fā)生再質(zhì)子化反應(yīng)，從而產(chǎn)生部分外消旋的氨基酸。而外消旋程度取決于氨基酸側(cè)鏈的空間和電子性質(zhì)[31,33]。在可可豆在熱加工過程中，D-氨基酸含量會(huì)隨著溫度升高而增加。一種產(chǎn)自非洲象牙海岸的可可豆在150 ℃下烘焙 2 h后，D-氨基酸的相對含量升高（D-脯氨酸37.0%、D-丙氨酸17.0%、D-異亮氨酸11.7%、D-天冬氨酸和D-天冬酰胺11.1%、D-酪氨酸7.9%、D-絲氨酸5.8%、D-亮氨酸4.8%、D-苯丙氨酸4.3%和D-纈氨酸1.2%）[34]。P?tzold等[31,34]推測可可豆中D-氨基酸是由美拉德反應(yīng)的Amadori產(chǎn)物形成。并合成了果糖-L-苯丙氨酸和果糖-D-苯丙氨酸加以驗(yàn)證，將二者在200 ℃下加熱 5～60 min后，生成了11.7%D-苯丙氨酸和11.8%L-苯丙氨酸[34]。與之相類似，在煙草、雪茄[35]、水果（葡萄、蘋果、梨、石榴、棗）和各種其他植物（多肉瑪瑙、甜菜根、甘蔗、角豆）的加工汁液[36]、麥汁和香醋[37]中也檢測到經(jīng)美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生的D-氨基酸。

在一定的堿性條件下，質(zhì)子從氨基酸的不對稱碳原子中被去除而形成帶負(fù)電荷的碳負(fù)離子。當(dāng)碳負(fù)離子與質(zhì)子結(jié)合時(shí)，理論上將形成等量的D-和L-對映體（各占50%）[26,38]，因而食品加工中的高溫堿性環(huán)境也可能會(huì)促進(jìn)L-氨基酸消旋形成D-氨基酸。研究人員將α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白以及混合的游離氨基酸在pH 9、83 ℃的環(huán)境下反應(yīng)0.5～24 h或96 h后發(fā)現(xiàn)，大多氨基酸均發(fā)生消旋化反應(yīng)而生成D-氨基酸，其中半胱氨酸、絲氨酸和天冬氨酸的消旋率較高[39]。進(jìn)一步的研究表明，對于游離氨基酸，其外消旋速率約為結(jié)合殘基的10%，外消旋化的主要驅(qū)動(dòng)力是側(cè)鏈的吸電子能力（天冬氨酸除外）；而對于結(jié)合態(tài)氨基酸，其外消旋化受氨基側(cè)鏈效應(yīng)、與主體蛋白質(zhì)相關(guān)因素以及堿性條件的誘導(dǎo)[39]。橄欖中富含D-氨基酸，其總量達(dá)18.6～38.2 mg/100 g，主要的D-氨基酸為D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-絲氨酸和D-亮氨酸[8]。據(jù)報(bào)道，橄欖中游離氨基酸在堿液（pH 8.3～10.3）中熱處理（121 ℃）時(shí)的外消旋程度顯著增加，尤以L-絲氨酸和L-丙氨酸的消旋程度變化最為明顯。121 ℃下加熱35 min后，橄欖中的游離D-絲氨酸和D-丙氨酸占比分別約為20%和11%。隨著環(huán)境pH值的增加，L-絲氨酸、L-丙氨酸和L-天冬酰胺的外消旋值隨之增加，而L-天冬氨酸的外消旋值略有下降，L-谷氨酸的外消旋值變化不大；并且高溫滅菌工藝也會(huì)提升部分氨基酸的外消旋程度[8]。Chang等[26]研究了蛋清和蛋黃中的氨基酸在堿性條件處理下的消旋程度變化，發(fā)現(xiàn)蛋清中氨基酸的消旋值依次為：絲氨酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞苯丙氨酸＞亮氨酸＞纈氨酸＞蘇氨酸＝異亮氨酸（消旋能力依次減弱），而蛋黃中氨基酸的消旋值順序依次為：天冬氨酸＞谷氨酸＞苯丙氨酸＞亮氨酸＞纈氨酸，進(jìn)而指出氨基酸外消旋化趨勢與其側(cè)鏈的性質(zhì)、pH值和處理時(shí)間密切相關(guān)。

2 食品中D-氨基酸的檢測方法

食品中D-氨基酸的檢測可為控制加工食品的品質(zhì)、研究食源性D-氨基酸的營養(yǎng)代謝及生理功能等方面的研究提供不可或缺的信息。

2.1 高效液相色譜/超高效液相色譜法

HPLC的原理為利用高壓輸液系統(tǒng)，通過將不同極性的流動(dòng)相泵入內(nèi)置固定相色譜柱中而分離出樣品中的不同成分，最后經(jīng)檢測器完成檢測。在食品D-氨基酸的檢測中，基于不同的檢測原理又可將HPLC或UPLC分為直接法和間接法。

直接法是指基于手性固定相或非手性衍生試劑的方法，然后在手性固定相或流動(dòng)相上分離氨基酸對映體[3]。Sardella等[40]優(yōu)化了一套基于手性配體交換型固定相分離檢測氨基酸對映體的方法，用以評估兩種西班牙奶酪樣品中D-丙氨酸、D-天冬氨酸和D-谷氨酸的含量變化。首先用強(qiáng)陰離子交換樹脂和離子強(qiáng)度梯度洗脫法提取氨基酸，通過優(yōu)化反向HPLC流動(dòng)相中的離子對試劑使丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸與其他氨基酸完全區(qū)分開，再利用基于七氟丁酸為離子對試劑的離子對反相-HPLC（配備蒸發(fā)光散射檢測器）進(jìn)行分離檢測。Xu Yu等[41]基于HPLC-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜建立了一套針對茶葉中D-氨基酸的檢測方法，將茶葉提取物通過離子交換固相萃取富集后，利用配備手性柱的HPLC分離氨基酸對映體，隨后使用高分辨率四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測和鑒定。

間接法是指基于手性試劑的柱前衍生方法，通過將氨基酸對映體與手性試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)，拆分后形成非對映體，然后通過色譜進(jìn)分離和檢測，具有準(zhǔn)確性高、分析時(shí)間短、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)[42]。鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）已被廣泛用作拆分對映體氨基酸的衍生化試劑。OPA在堿性介質(zhì)以及手性硫醇化合物存在的環(huán)境中，與氨基酸對映體反應(yīng)生成可發(fā)熒光的非對映異構(gòu)體產(chǎn)物，故能夠利用配備熒光檢測器的HPLC進(jìn)行分析[43]。Inoue等[25]將米酒經(jīng)OPA和N-異丁?；?L-半胱氨酸衍生化處理后，利用反向HPLC進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了米酒中的L-天冬氨酸在陳年過程中會(huì)經(jīng)美拉德反應(yīng)消旋為D-天冬氨酸。Csapo等[44]為探究不同水解條件對牛乳蛋白中氨基酸消旋的影響，將乳蛋白水解物經(jīng)OPA和2,3,4,6-O-四乙?；?1-硫代-β-D-葡萄糖（2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranoside，TATG）衍生化后，通入氮?dú)饣旌暇鶆虿㈧o置，再進(jìn)行HPLC分析。Casado等[8]在探究不同堿性加工條件對橄欖中D-氨基酸形成的影響時(shí)，將橄欖中提取的氨基酸經(jīng)OPA和N-異丁基L-Cys（N-isobutyryl-L-cysteine，IBLC）或N-異丁基D-Cys（N-isobutyryl-D-cysteine，IBDC）衍生化，再進(jìn)行HPLC分析。1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺（1-fluoro-2-4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide，F(xiàn)DAA）[45]是一種常用的衍生劑，在40 ℃堿性環(huán)境中，F(xiàn)DAA可在不發(fā)生外消旋反應(yīng)的情況下，與L-和D-氨基酸的α-氨基發(fā)生化學(xué)計(jì)量反應(yīng)而產(chǎn)生非對映體，因其各自產(chǎn)生的非對映體的容量因子差異較大，因此可以通過HPLC進(jìn)行分離和檢測，其精度可達(dá)納摩爾級別[46]。Manabe[47]采用薄層色譜和HPLC相結(jié)合的方法分析納豆黏液中的D-氨基酸組成，其將納豆黏液部分提取出的氨基酸經(jīng)FDAA衍生化處理后，將衍生物經(jīng)薄層色譜分離，再將分離得到的組分通過HPLC進(jìn)一步分析，結(jié)果表明其中含有的D-氨基酸為D-谷氨酸、D-丙氨酸和D-天冬氨酸。最近，Jin Yueying等[29]合成了一種新型熒光衍生試劑DBD-(S)-2-甲基脯氨酸（DBD-trans-2-methyl-L-proline，DBD-M-Pro）并應(yīng)用于UPLC分析，該試劑可以用于高效、靈敏地檢測納豆中游離D/L-氨基酸。從納豆中提取的氨基酸與DBD-M-Pro在60 ℃下反應(yīng)60 min后，經(jīng)BEH C18柱梯度分析20 min即可完成檢測；4 種氨基酸（D/L-谷氨酰胺、D/L-天冬氨酸、D/L-谷氨酸和D/L-丙氨酸）衍生后的非對映體分辨率為1.65～3.50，檢測限達(dá)0.25～2.50 pmol，平均回收率為86.65%～118.70%。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜與質(zhì)譜儀串聯(lián)使用可達(dá)到更高的靈敏度、選擇性、檢測精度和分析效率，更適用于分析氨基酸含量較低的食品樣本。利用GC-MS法檢測氨基酸對映體時(shí)通常使用手性固定相（如Chirasil-L-Val毛細(xì)管柱）分離對映體。Ali等[35]用GC-MS在選擇離子監(jiān)測模式下測定了25 種歐洲鼻煙和8 種咀嚼煙草中游離L-和D-氨基酸的含量，以探究不同煙草樣品中的D-氨基酸譜。在此方法中，煙葉中的氨基酸通過陽離子交換劑純化而得，再經(jīng)乙酰氯衍生化，在Chirasil-L-Val毛細(xì)管柱上通過GC-MS-選擇離子監(jiān)測模式對氨基酸對映體進(jìn)行分離和定量。與之相類似，P?tzold等[34]使用陽離子交換劑從可可豆及其制品中分離氨基酸，并將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性氨基酸衍生物，并在Chirasil-L-Val毛細(xì)管柱上通過配備火焰離子化檢測器的GC-MS進(jìn)行分析。Abe等[48]建立了一種檢測葡萄酒中氨基酸對映體的氣相色譜法。葡萄酒中的氨基酸對映體先在堿性水介質(zhì)中與新戊酰氯酰化，再與甲基硅基重氮甲烷發(fā)生酯化反應(yīng)，由此得到的氨基酸衍生物在涂有聚二甲基硅氧烷的毛細(xì)管柱上進(jìn)行分離。Casal等[49]為對比研究不同品種咖啡豆中的氨基酸譜，將咖啡豆中提取出的氨基酸經(jīng)2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇/吡啶混合物和氯甲酸乙酯衍生，利用氯仿萃取后經(jīng)Chirasil-L-Val毛細(xì)管柱并通過氫火焰離子檢測器進(jìn)行分析；該方法的回收率在90.5%～102.6%，定量限為0.3～12.0 mg/kg。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是一種結(jié)合了電遷移和色譜技術(shù)的檢測方法，因其具備分析成本較低，短時(shí)高效等特點(diǎn)而越來越廣泛地應(yīng)用于食品中氨基酸對映體的分析。此方法通常需使用衍生化試劑（如異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）并結(jié)合質(zhì)譜或微電動(dòng)色譜（micellar electrokinetic chromatography，MEKC）等進(jìn)行檢測分析[50]。Sánchez-Hernández等[51]優(yōu)化了基于電泳-串聯(lián)質(zhì)譜測定蛋白水解物中氨基酸對映體的方法。提取的游離氨基酸經(jīng)FITC衍生化處理，一方面使氨基酸在電噴霧電離-質(zhì)譜檢測中具備更高的靈敏度；另一方面，氨基酸的衍生化部分與環(huán)糊精產(chǎn)生額外的相互作用也助于分離性能的提高。在環(huán)糊精作為手性選擇劑的體系中，通過毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水解蛋白肥料中所含游離氨基酸的外消旋程度。在分辨率高于1.0且檢測限為0.02～0.80 μmol/L的條件下，實(shí)現(xiàn)了多達(dá)14 種氨基酸對映體的分離，此方法被應(yīng)用于控制水解蛋白肥料的純度[51]。雖然手性電泳-質(zhì)譜方法已具有良好的選擇性以及可以通過分子質(zhì)量測定以準(zhǔn)確定性的優(yōu)點(diǎn)，但為了進(jìn)一步提升檢測靈敏度，與毛細(xì)管電動(dòng)色譜-激光誘導(dǎo)熒光（micellar electrokinetic chromatography-laser-induced fluorescence，MEKC-LIF）相結(jié)合的氨基酸對映體檢測方法因運(yùn)而生。Carlavilla等[52]優(yōu)化了一種基于MEKC-LIF能夠高效靈敏地定量分析醋中D-/L-氨基酸的方法。提取出的氨基酸經(jīng)FITC衍生后，通過手性MEKC-LIF程序得以檢測，實(shí)現(xiàn)了5 對氨基酸對映體（脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸）的分離，20 min內(nèi)即可完成分析且檢測限在16.6 nmol/L以下。

為適應(yīng)更高的檢測要求，各種新型檢測方法仍在不斷優(yōu)化與更新，例如基于傳感器檢測食品中D-氨基酸的新方法已有一定范圍的應(yīng)用[53-54]。此外，新型衍生化試劑、檢測器等也在不斷地發(fā)展與完善[55]。

3 D-氨基酸的生理功能

長期以來，D-氨基酸的生理功能未得到充分關(guān)注，人們對其功能尚未形成系統(tǒng)性認(rèn)知，目前關(guān)于其功能的認(rèn)知主要集中于以下兩方面：1）部分D-氨基酸作為細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層的組成成分[56]；2）D-氨基酸作為少數(shù)抗生素的組成成分。

3.1 神經(jīng)調(diào)節(jié)功能

在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)存在多種D-氨基酸，主要為D-絲氨酸、D-天冬氨酸、D-丙氨酸和D-半胱氨酸。這些D-氨基酸的存在引起了研究人員的興趣，其對于神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能正在逐步被揭示。在神經(jīng)系統(tǒng)中，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體介導(dǎo)突觸傳遞從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)，且在調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng)中的作用至關(guān)重要[57-58]。研究發(fā)現(xiàn)，D-絲氨酸、D-天冬氨酸和D-丙氨酸都能與NMDA受體結(jié)合。其中，早在20世紀(jì)90年代，D-絲氨酸已被發(fā)現(xiàn)是哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與著多種神經(jīng)信號傳導(dǎo)活動(dòng)[59]。進(jìn)一步研究揭示，D-絲氨酸是NMDA受體的共激動(dòng)劑，通過丙氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1或其他途徑進(jìn)入突觸，從而調(diào)節(jié)NMDA受體的活性，參與大腦皮層的信號傳遞[59]。D-絲氨酸水平下降可能導(dǎo)致NMDA受體功能受到抑制，從而引發(fā)類似精神分裂癥的癥狀[60]。在一項(xiàng)由28 名精神分裂癥患者參加的為期6 周的雙盲安慰劑對照實(shí)驗(yàn)中，患者在服用抗精神藥物的同時(shí)亦口服D-絲氨酸（30 mg/（kgmbg d）），患者認(rèn)知癥狀得到顯著改善[60]。近年，一項(xiàng)以果蠅為模型的研究揭示了D-絲氨酸亦可通過作用于NMDA受體而調(diào)節(jié)睡眠[61]。此外，D-天冬氨酸也作為NMDA受體的激動(dòng)劑，通過與NMDA受體的谷氨酸位點(diǎn)結(jié)合而參與調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)[62]。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)7 周攝入D-天冬氨酸可上調(diào)NMDA受體亞基的表達(dá)水平并改善學(xué)習(xí)記憶能力[63]。老年小鼠在灌胃D-天冬氨酸后，其海馬體中的突觸可塑性衰退得到緩解[64]。此外，D-天冬氨酸亦在增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力[65]和改善抑郁[66]方面具有潛在功能。早于1989 年，D-丙氨酸已被證實(shí)是N M D A 受體甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)的一種有效的立體選擇性協(xié)同激動(dòng)劑，在神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能[67]。在1 項(xiàng)由32 名精神分裂癥患者參加的為期6 周的雙盲安慰劑對照D-丙氨酸實(shí)驗(yàn)（100 mg/（kgmbg d））中，服用D-丙氨酸患者的臨床癥狀得到明顯改善[68]。D-半胱氨酸可以在D-氨基酸氧化酶的作用下產(chǎn)生H2S，從而間接促進(jìn)NMDA受體的神經(jīng)傳導(dǎo)功能[69]，其被視為一種潛在的新型神經(jīng)保護(hù)劑[70]。

3.2 調(diào)節(jié)激素合成與分泌

生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)中廣泛存在著D-氨基酸，其中尤以D-天冬氨酸豐度最高。目前，D-天冬氨酸已多用于激素合成與釋放方面的研究。在大鼠松果體中，D-天冬氨酸可抑制褪黑素合成（半抑制濃度為75 μmol/L）[71]，并減少體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞中褪黑素的釋放[72]。D-天冬氨酸可通過增強(qiáng)類固醇生成酶活性以上調(diào)大鼠大腦中的性激素水平[73]。一項(xiàng)大鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服D-天冬氨酸使睪酮水平提升約110%，孕酮水平提升約40%，17β-雌二醇水平提升約35%[73]。在大鼠下丘腦中，D-天冬氨酸的水平在哺乳期間升高并會(huì)促進(jìn)催產(chǎn)素生成。D-天冬氨酸可通過NMDA受體直接刺激催乳素的釋放；D-天冬氨酸也可能通過減少垂體后葉γ-氨基丁酸的釋放來刺激催乳素的釋放[74]。在人體和大鼠實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)D-天冬氨酸可促進(jìn)垂體中黃體生成素的釋放[75]。不僅如此，D-天冬氨酸可調(diào)節(jié)多巴胺的釋放[76]。D-天冬氨酸亦在哺乳動(dòng)物的生殖功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在睪丸內(nèi)，D-天冬氨酸可促進(jìn)睪酮的釋放[75]，上調(diào)雄激素受體的表達(dá)并下調(diào)雌激素受體的表達(dá)[77]。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，服用D-天冬氨酸的亞生育期患者的精子的數(shù)量和活動(dòng)性得到改善，且其配偶的懷孕率得以提高[78]。存在于垂體中分泌促腎上腺皮質(zhì)激素的細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞中的D-丙氨酸參與哺乳動(dòng)物的血糖調(diào)節(jié)[79]。D-絲氨酸可能通過調(diào)節(jié)胰島素分泌而參與調(diào)控機(jī)體的糖代謝[79]。

3.3 抗生物膜形成

抑制生物膜形成是一種新型有效的抗菌治療策略，近年來，關(guān)于D-氨基酸在生物膜形成中的功能及應(yīng)用已備受關(guān)注[80-81]。體外實(shí)驗(yàn)表明，D-組氨酸、D-半胱氨酸和D-色氨酸在4 mmol/L時(shí)抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成（抑制率分別為47%、92%、75%）；D-半胱氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸在4 mmol/L時(shí)抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成（抑制率分別為32%、19%、25%）[82]。D-天冬氨酸（50 μg/mL）可有效抑制白色念珠菌黏附及其生物膜形成[27]。D-丙氨酸、D-絲氨酸、D-蛋氨酸和D-色氨酸可通過靶向抑制丙氨酸消旋酶的水平而抑制并分解由空腸梭菌和大腸桿菌形成的生物膜，且D-氨基酸混合物可將D-環(huán)絲氨酸抗生素的功效增強(qiáng)32%[83]。D-酪氨酸、D-天冬氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸可降低從自污泥中分離的混合微生物的黏附性和抑制生物膜形成[84]。單種D-氨基酸（D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸）和被等離子體聚合物包埋后的復(fù)合物均可破壞不同成熟度的糞腸球菌生物膜[85]。

3.4 免疫調(diào)節(jié)活性

哺乳動(dòng)物先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)通過使用模式識別受體來檢測保守的細(xì)菌和病毒成分[86]。雖然目前關(guān)于D-氨基酸與模式識別受體的識別結(jié)合作用尚不明晰，但已發(fā)現(xiàn)D-氨基酸可被一些受體（如G蛋白偶聯(lián)受體）和酶（如D-氨基酸氧化酶）識別，從而在機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性[87]。腸道中的D-氨基酸在D-氨基酸氧化酶的作用下產(chǎn)生抗菌產(chǎn)物H2O2以保護(hù)小腸黏膜表面免受霍亂病原體的侵害，進(jìn)而維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[88]。在誘導(dǎo)哮喘前給小鼠喂食D-色氨酸可增加肺和腸道的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，降低肺部輔助型T細(xì)胞2反應(yīng)，改善過敏性氣道炎癥及其高反應(yīng)性[89]。D-苯丙氨酸和D-色氨酸通過激活G蛋白偶聯(lián)受體GPR109B在人類中性粒細(xì)胞中引發(fā)趨化反應(yīng)[90]。在金黃色葡萄球菌感染情況下，D-亮氨酸和D-苯丙氨酸可激活先天免疫反應(yīng)，通過刺激T1R2/3甜味受體而抑制抗菌肽釋放以減緩感染[91-92]。

3.5 保護(hù)皮膚穩(wěn)態(tài)

部分D-氨基酸（D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-甲硫氨酸和D-谷氨酸）具有維護(hù)皮膚穩(wěn)態(tài)的功能。其中，D/L-丙氨酸均可有效促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的層黏連蛋白332的生成，從而增強(qiáng)基底膜修復(fù)，并且D-丙氨酸表現(xiàn)出比L-丙氨酸高4～5 倍的促進(jìn)效果[93]。在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞模型上，D-天冬氨酸能減緩真皮成纖維細(xì)胞的氧化毒性損傷[93]。D-甲硫氨酸（0.1～10.0 μmol/L）能夠顯著提高經(jīng)UVA 照射后真皮成纖維細(xì)胞的存活率，且在相同濃度下D-甲硫氨酸表現(xiàn)出較L-甲硫氨酸更強(qiáng)的保護(hù)作用[93]。D-谷氨酸是一種 NMDA 型離子通道的抑制劑，能夠抑制Ca2＋向細(xì)胞內(nèi)流入，從而維持細(xì)胞膜內(nèi)外電位差，進(jìn)而促進(jìn)皮膚屏障功能恢復(fù)[93]。

3.6 含D-氨基酸的肽的生物活性

目前，關(guān)于食品中含D-氨基酸的肽還鮮有報(bào)道，此類研究僅限于從低等生物中發(fā)掘出的含有D-氨基酸的生物活性肽[94]及人工合成含D-氨基酸的肽[95]。Carlo等[96]從南美樹蛙的皮膚中分離出1 種含D-丙氨酸的蛙皮啡肽，其是與μ-型阿片受體高親和力和選擇性結(jié)合的多肽，其在深度長效鎮(zhèn)痛方面較嗎啡強(qiáng)1000 倍。漏斗蛛網(wǎng)毒素是從漏斗網(wǎng)蜘蛛的毒液中鑒定出的一種由48 個(gè)氨基酸組成的天然多肽，其第46位為D-絲氨酸，該多肽是神經(jīng)系統(tǒng)中小腦浦肯野細(xì)胞的一種強(qiáng)效P型鈣通道抑制劑[97]。此后，陸續(xù)在多種生物（包括甲殼類動(dòng)物、軟體動(dòng)物和鴨嘴獸等）中也發(fā)現(xiàn)了具有各種生理活性的含D-氨基酸多肽[98]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了諸多含有D-氨基酸的細(xì)胞信號肽、宿主防御肽和多肽類激素[99-101]。多肽中的D-氨基酸通常會(huì)增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和活性[100]。目前的研究主要認(rèn)為D-氨基酸不是在前體多肽中被異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的，而是在合成多肽的翻譯后修飾過程中才被異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生成的[98,102]。

4 結(jié)語

近年來，以D-氨基酸為主要成分的功能性食品正在市場上嶄露頭角，如日本資生堂公司生產(chǎn)的富含D-氨基酸的美容養(yǎng)顏功能性食品（kireinosusume），其強(qiáng)調(diào)人類角質(zhì)層中存在多種D-氨基酸，而補(bǔ)充D-氨基酸有助于激活皮膚角質(zhì)層中的成纖維細(xì)胞以產(chǎn)生更多膠原蛋白[103]；美國Doctor’s Best公司也上市了一款用于維護(hù)情緒健康的D-苯丙氨酸膳食補(bǔ)充劑。D-氨基酸的重要性已受到越來越多的關(guān)注，其有望作為潛在的新型營養(yǎng)補(bǔ)充劑進(jìn)入功能性食品市場。

但相比于L-氨基酸，D-氨基酸的吸收代謝及營養(yǎng)功能方面的研究尚不充分，D-氨基酸作為天然存在于食品原料以及食品加工中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其在人體生理健康中發(fā)揮著的獨(dú)特作用仍亟待挖掘。未來在D-氨基酸的研究中有待解決的關(guān)鍵問題有：1）食源性攝入的D-氨基酸在人體內(nèi)吸收代謝機(jī)制，其中涉及是否存在尚未被鑒定的D-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體以及參與該過程的相關(guān)酶系等；2）食品中含D-氨基酸多肽的鑒定及功能機(jī)制研究；3）制備含有特定D-氨基酸的工業(yè)化產(chǎn)品以進(jìn)一步打造新型功能性食品。