黎俏靈，李鶴年，郭靜科，朱則亮，滕 薇，胡雨嘉，羅圓圓，王夢田，劉樹滔,*

（1.福州大學生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福州大學至誠學院，福建 福州 350002）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種特發(fā)性腸道炎癥，可導致便血便稀、腹痛、體質(zhì)量下降，甚至胃腸道穿孔、排泄失禁等癥狀[1]，極大地危害了人們的身心健康；且UC近年來發(fā)病率持續(xù)上升，已成為全球性備受關(guān)注的問題[2]。目前UC病因的潛在機制尚未完全闡明，但有研究表明氧化應(yīng)激是導致UC的一個重要的因素?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）指通過氧分子還原產(chǎn)生的初始物質(zhì)及其次級反應(yīng)產(chǎn)物，具有高度反應(yīng)活性。當機體內(nèi)ROS過量生成且無法被及時清除時便會破壞原有的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而導致氧化應(yīng)激，進而引起細胞膜脂質(zhì)過氧化作用并造成機體的損傷，包括腸道通透性增加甚至腸道細胞溶解，導致UC發(fā)生[3-4]。過量的ROS會破壞腸上皮細胞蛋白，進而破壞胃腸道屏障，增加腸道通透性，導致炎癥的發(fā)生[5]。很多研究表明腸黏膜中ROS的過量產(chǎn)生可增強炎癥反應(yīng)，導致黏膜損傷，加速炎癥反應(yīng)，發(fā)生腸潰瘍[6]。因此，清除ROS已被用作緩解UC的有效策略[7-9]，如周曉玲等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)南極磷蝦油可以通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的表達以及調(diào)節(jié)核因子紅細胞2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelchlike ECH-associated protein，Keap）1信號通路減少ROS含量，從而改善UC小鼠的氧化損傷。

SOD是一種內(nèi)源性抗氧化物酶，能催化超陽陰離子自由基生成O2和H2O2。SOD具有抑制ROS作用，并由于其良好的抗炎、抗氧化等活性，在保健食品或者食品營養(yǎng)強化劑中具有廣泛的應(yīng)用，因此SOD可作為食品功能因子預(yù)防或者緩解UC癥狀[10-12]。但SOD在胃腸道中的性質(zhì)不穩(wěn)定，口服后易因胃液極低的pH值和胃蛋白酶破壞損失酶活性[13-14]，因此，SOD在實際應(yīng)用中常需要通過變性、重組、修飾和包埋等手段提高其生物利用度[15-16]。

納米遞送具有低毒副作用、高穩(wěn)定性、緩釋和控釋活性物質(zhì)及蛋白靶向釋放等優(yōu)點，因此納米遞送系統(tǒng)在活性物質(zhì)遞送和營養(yǎng)素遞送領(lǐng)域中受到廣泛關(guān)注和研究[17]。目前遞送系統(tǒng)主要包括納米乳、納米囊、脂質(zhì)體納米顆粒和聚合物膠束等[18]，已被運用于各種天然活性成分、營養(yǎng)素以及微量元素的遞送。其中脂質(zhì)體由可食用的生物材料組成，具有無毒、可緩釋活性物質(zhì)和生物相容性高等優(yōu)點[19]，因此被廣泛用于天然活性成分遞送系統(tǒng)，如Jubeh等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂質(zhì)體包埋后的SOD能更好地降低UC大鼠結(jié)腸組織中乳酸脫氫酶含量進而預(yù)防腸道氧化應(yīng)激損傷；周建森等[21]評估發(fā)現(xiàn)反式激活蛋白-SOD經(jīng)過脂質(zhì)體包埋后對于UC大鼠具有更好的改善作用，且脂質(zhì)體包埋可以提高反式激活蛋白-SOD對胃酸及胃蛋白酶的耐受性，降低機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，進而修復結(jié)腸組織損傷并發(fā)揮其改善UC的作用。

基于口服給藥方便且使用依從性高，蔡麗萍等[22]通過加熱制備自組裝SOD納米顆粒物以提高SOD的活力、穩(wěn)定性以及其生物利用度。本實驗將納米-SOD（nano-SOD，以下簡稱ΔSOD）包埋于脂質(zhì)體中得到L-ΔSOD，探討L-ΔSOD改善UC模型小鼠的作用。SOD在水溶液中加熱易于自組裝成納米顆粒，而脂質(zhì)體包封過程簡單且可重復，有利于維持蛋白質(zhì)的生物活性并提高SOD在胃腸道中的穩(wěn)定性，并有利于SOD靶向至炎癥部位[23-24]。所以本實驗分析脂質(zhì)體包埋ΔSOD對UC模型小鼠的改善作用，以期為UC的輔助治療食品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

ICR清潔型小鼠購于浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。

SOD凍干粉 天津生命科學研究所；膽固醇、胃蛋白酶（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）Annexin V細胞凋亡檢查試劑盒I 生工生物（上海）股份有限公司；胰酶（分析純） 美國Amersco公司；大豆卵磷脂（分析純） 薩恩化學技術(shù)（上海）有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、細胞增殖試劑盒（cell-counting kit，CCK）-8、Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養(yǎng)基、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）（純度≥98%） 美國MP Biomedicals公司；HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、TritonX-114（純度≥99%） 美國Sigma公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH-Px試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

1384型生物安全柜、3111型CO2培養(yǎng)箱、石蠟切片機美國Thermo Forma公司；CFX96實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；AE-6450蛋白電泳儀美國ATTO公司；JS-680D全自動凝膠成像儀 上海培清科技公司；KZ-III勻漿儀 美國Servicebio公司；Cp70ne超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；Nano ZS90激光粒度儀 美國Malvern Panalytica公司；SpectraMax ID3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；CARY50紫外-可見分光光度計 美國VAP公司；A1激光共聚焦顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔSOD的制備與活力的測定

配制1.00 mg/mL的SOD溶液，于60 ℃水浴鍋中預(yù)熱1 h后，再75 ℃加熱1 h，得到粗納米SOD顆粒；經(jīng)超濾和0.45 μm濾膜過濾后，得到ΔSOD，然后利用鹽酸羥胺法[22]測定SOD活力，并用于后續(xù)實驗研究。

1.3.2 ΔSOD在Caco-2細胞中的跨膜能力分析

將需要偶聯(lián)的SOD和ΔSOD蛋白用堿性碳酸反應(yīng)液（17 g NaCO3和28 g NaHCO3溶解于1 L去離子水）透析1 h，然后分別取300 μL于盛有20 μL FITC 1.5 mL棕色EP管中，避光振蕩反應(yīng)1 h；把標記好的蛋白樣品裝于1 mL的Sephadex G-25 Superfine凝膠柱中，洗脫后得到SOD-FITC和ΔSOD-FITC溶液[23,25]。將對數(shù)生長期的Caco-2細胞以4h 104個/孔接種于24 孔板中，在培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2，下同）中孵育24 h，待細胞完全貼壁后吸棄培養(yǎng)液，然后每孔加入400 μL含0.50 mg/mL SOD-FITC或ΔSOD-FITC溶液的完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育3 h；取200 μL培養(yǎng)液于不透光的96 孔板中，用多功能酶標儀檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm。按照BCA試劑盒說明書測定細胞蛋白含量。以1 mg蛋白對應(yīng)的熒光強度表征跨膜能力。

1.3.3 ROS水平的測定

取生長良好的Caco-2細胞接種于24 孔板和激光共聚焦培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加入400 μL含有500 U/mL SOD及ΔSOD的DMEM孵育3 h后，在避光條件下用培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA探針至5 μmol/L，按照500 μL/孔加入含DCFH-DA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，每孔加入100 μL H2O2溶液（終濃度200 μmol/L）氧化刺激3 h后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，每孔加入250 μL細胞裂解液，振蕩2 min，4 ℃靜置15 min，常溫下1200 r/min離心5 min，取200 μL于不透光的96 孔板中，用多功能酶標儀檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm。按照BCA試劑盒說明書測定細胞蛋白含量，以1 mg蛋白對應(yīng)的熒光強度表征ROS水平。參照上述方法處理激光共聚焦培養(yǎng)皿中的Caco-2細胞，并采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4 ΔSOD脂質(zhì)體的制備與包埋率的測定

采用逆向蒸發(fā)法制備L-ΔSOD。稱取一定量的ΔSOD凍干粉溶于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其終質(zhì)量濃度為1 mg/mL；將質(zhì)量比為4∶1的卵磷脂和膽固醇混合物按照質(zhì)量比1∶3溶解于乙醚中，將上述有機相與ΔSOD溶液按照體積比3∶1混合，超聲處理6 min，形成穩(wěn)定的油包水型乳液。將所得乳液于40 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，形成乳濁液。獲得的乳濁液經(jīng)過8000hg離心5 min，收集的上清液即為粒徑均勻的L-ΔSOD懸液，于4 ℃冰箱避光保存中備用[26]。將5 mL L-ΔSOD稀釋7 倍，4 ℃、100000hg離心10 min，收集上清液為游離的ΔSOD，利用BCA試劑盒測定其蛋白質(zhì)量濃度，按照式（1）計算包埋率。

1.3.5 ΔSOD以及L-ΔSOD性質(zhì)表征

采用激光粒度儀測定ΔSOD和L-ΔSOD的粒徑、ζ電位、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。

1.3.6 ΔSOD脂質(zhì)體在模擬消化液中的降解情況

參考Brodkorb等[27]的方法配制含胃蛋白酶（2000 U/mL）、pH 2.0的模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）以及含胰蛋白酶（100 U/mL）、pH 7.0的模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF），將1.00 mg/mL ΔSOD與L-ΔSOD分別與SGF以體積比1∶3混合，于37 ℃振蕩水浴，并分別測定0、0.5、1.0、2.0 h時SOD活力/（U/mL），然后將模擬胃液消化2.0 h后的混合液與SIF以體積比1∶2混合后于37 ℃振蕩水浴120 min測定SOD活力/（U/mL）。SOD活力回收率按式（2）計算。

1.3.7 動物實驗

1.3.7.1 動物分組

將36 只ICR雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始動物實驗。將小鼠隨機分成2 組：正常組小鼠（6 只）飲用無菌水，模型組小鼠（30 只）自由飲用3.0 g/100 mL DSS溶液，連續(xù)飲用7 d，期間環(huán)境及飼養(yǎng)條件保持不變，在造模期間每天固定時間測定小鼠體質(zhì)量、糞便形態(tài)及血便程度指標。造模結(jié)束后，進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，并將模型組小鼠隨機分為5 組：模型組、SOD組、ΔSOD組、空白脂質(zhì)體（L）組和L-ΔSOD組，每組6 只。各組分別灌胃0.02 mL/（gmbg d）滅菌水、SOD溶液、ΔSOD乳液、空白脂質(zhì)體（不添加SOD）、L-ΔSOD乳液，SOD干預(yù)劑量50 U/（gmbg d），連續(xù)灌胃7 d，每天進行DAI評分。干預(yù)結(jié)束后，小鼠禁食禁水12 h，采用頸椎脫臼處死小鼠，解剖后收集直腸觀察并拍照，測定直腸長度同時收集小鼠脾臟和結(jié)腸。

1.3.7.2 疾病活動指數(shù)及結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)測定

DAI可用于評估UC的嚴重程度，評分具體細則如表1[28-29]所示，每天固定時間稱量小鼠體質(zhì)量、觀察糞便形態(tài)和血便情況，以3 項指標評分的平均值作為DAI評分。參考Wallace等[30]的結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosal damage index，CMDI）評分標準（表2）進行評價，并按照式（3）計算結(jié)腸密度。

表1 DAI評分標準[28-29]Table 1 Criteria for DAI scores[28-29]

表2 CMDI評分標準[30]Table 2 Criteria for colonic mucosal damage index (CDMI) scores[30]

1.3.7.3 小鼠脾臟系數(shù)測定

參照文獻[31]的方法，解剖小鼠取脾臟并稱質(zhì)量，按式（4）計算脾臟系數(shù)。

1.3.7.4 結(jié)腸組織的蘇木精-伊紅染色

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑對質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定的小鼠結(jié)腸組織進行染色處理。

1.3.7.5 結(jié)腸組織氧化指標的測定

取結(jié)腸組織按照1∶9（m/V）添加質(zhì)量分數(shù)0.9%生理鹽水制備結(jié)腸組織勻漿，4 ℃、3000 r/min離心10 min，收集上清液備用。采用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。參考對應(yīng)試劑盒說明書測定結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標MDA含量和GSH-Px活力。

1.3.7.6 促炎因子質(zhì)量濃度的測定

參考對應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書測定結(jié)腸組織中促炎細胞因子（腫瘤壞死因子（tumor necrosisi factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6與IL-1β）的質(zhì)量濃度。

1.3.7.7 結(jié)腸組織緊密連接蛋白mRNA相對表達水平測定

使用TRIzol試劑提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，使用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒測定緊密連接蛋白基因（ZO-1和Occludin）mRNA相對表達水平，以正常組為對照，引物序列如表3所示。

表3 qPCR引物序列Table 3 Sequences of the primers used for real-time polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 24軟件進行Duncan多重比較檢驗，P＜0.05表示差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔSOD活力

SOD經(jīng)過一定條件的加熱導致α-螺旋含量顯著減少、β-折疊和無序結(jié)構(gòu)含量顯著增加而發(fā)生變性，從而使SOD聚集體絮凝成納米顆粒；天然的SOD活力為（26512.41±2732.09）U/mL，經(jīng)2 h的加熱后得到ΔSOD活力比天然SOD提高了26.81%，可能具有更高的生物活性，SOD的每個亞基的活性中心是由β-折疊互相環(huán)繞而形成的活性通道[32]，ΔSOD活力更高可能是由于其中的β-折疊含量上升。

2.2 ΔSOD在Caco-2細胞中的跨膜能力

細胞受損后，胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的自由基，而細胞內(nèi)有限的SOD無法達到清除效果，細胞需借助外源抗氧化物酶，使SOD與ROS維持平衡，才可以有效地清除細胞內(nèi)的自由基。本實驗利用熒光標記的方法來評估ΔSOD的跨膜能力，由圖1可知，F(xiàn)ITC標記的蛋白孵育Caco-2細胞3 h后，ΔSOD組跨膜能力顯著提高至SOD組的（2.89±0.20）倍（P＜0.05），表明ΔSOD比SOD具有更顯著的跨膜效果。有研究表明納米顆粒能附著在細胞膜上，細胞膜內(nèi)陷形成小囊，顆粒會被包圍在小囊內(nèi)，然后小囊從細胞膜上分離而形成小泡，通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)部；內(nèi)吞作用包括吞噬和胞飲作用，當納米顆粒的直徑小于500 nm時，其通過胞飲作用進入細胞[33]。相比于SOD，ΔSOD因其納米性質(zhì)具有的黏附細胞膜的能力，并由于其是納米級顆粒，能通過胞飲作用方式更多地跨膜進入細胞。

圖1 SOD和ΔSOD對Caco-2細胞跨膜能力的比較Fig.1 Comparison of transmembrane capacity SOD and ΔSOD for Caco-2 cells

2.3 ΔSOD的ROS清除能力

H2O2進入細胞發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量的羥自由基，導致機體產(chǎn)生嚴重的氧化應(yīng)激[34-35]。將Caco-2細胞分別與等濃度的天然SOD和ΔSOD混合進行孵育3 h，通過多功能酶標儀和激光共聚焦顯微鏡探究SOD和ΔSOD清除ROS的能力[22]。定量分析結(jié)果如圖2A所示，正常組與模型組中ROS水平具有顯著差異（P＜0.05），表明H2O2能刺激細胞產(chǎn)生大量的ROS。與模型組相比，SOD與ΔSOD ROS水平顯著降低（P＜0.05），且SOD與ΔSOD的ROS清除效果具有顯著性差異（P＜0.05）；如圖2B所示，模型組和SOD組因細胞產(chǎn)生了大量自由基而導致熒光強度很高。相比模型組，SOD和ΔSOD均可顯著降低熒光強度，而ΔSOD組熒光強度相對于SOD組弱，表明ΔSOD的清除效果更強。其原因是在相同蛋白質(zhì)量濃度下ΔSOD比SOD活力高且具有更好的跨膜效果，因此ΔSOD更易進入細胞內(nèi)發(fā)揮更強的自由基清除能力，進而更好地減弱熒光強度。目前關(guān)于SOD緩解UC癥狀的研究很多，但與已報道的從嗜熱菌中分離的超穩(wěn)定的SOD[36]相比，本實驗的SOD納米顆粒制備簡單、酶活力高、細胞跨膜以及ROS清除能力強，具備顯著生物活性，因此有利于探究ΔSOD緩解UC癥狀的效果。

圖2 ΔSOD對由H2O2誘導Caco-2細胞產(chǎn)生ROS的清除效果Fig.2 Scavenging effect of ΔSOD on free radical produced by Caco-2 cells induced by H2O2

2.4 L-ΔSOD的性質(zhì)表征

如表4所示，L-ΔSOD平均粒徑為（276.60±1.78）nm，ζ電位為（－31.30±0.14）mV，PDI為0.254±0.014。由于納米體系中ζ電位的絕對值越大，表明體系越穩(wěn)定，因此ζ電位可作為考察納米顆粒穩(wěn)定性的指標[37]。因此，與ΔSOD（（－11.44±1.17）mV）相比，L-ΔSOD具有較高的穩(wěn)定性；L-ΔSOD的包埋率為（29.72±0.01）%，能夠?qū)ΖOD起到一定的保護作用。

表4 L-ΔSOD的性質(zhì)Table 4 Characteristics of L-ΔSOD

2.5 L-ΔSOD體外模擬胃腸道的穩(wěn)定性

如表5所示，在SGF的作用下，ΔSOD的活力迅速降低，0.5 h后幾乎全部失活，這表明ΔSOD易受到胃酸和胃蛋白酶的破壞與降解[13,38]。而ΔSOD經(jīng)脂質(zhì)體包埋可以減少酶活力的損失，L-ΔSOD活力為（3157.75±206.12）U/mL，經(jīng)過體外胃腸液消化后的Δ S O D 活力為（1278.23±15.01）U/mL，酶活力回收率為40.90%，表明脂質(zhì)體對胃腸液在一定程度上具有耐受性，有利于研究口服ΔSOD脂質(zhì)體對UC癥狀的作用效果[39]。

表5 ΔSOD和L-ΔSOD模擬消化后的活力及其活力回收率Table 5 Residual activity and activity recovery rate of ΔSOD and L-ΔSOD after simulated digestion

2.6 L-ΔSOD對UC小鼠DAI評分的影響

DSS破壞結(jié)腸黏膜屏障，導致腸道炎癥發(fā)生、出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、便血便稀等臨床癥狀，DAI評分是評價結(jié)腸炎嚴重程度的一個指標。如圖3所示，經(jīng)7 d造模后，除正常組外，其余各組DAI評分均維持在一定水平，表明造模成功。以不同樣品灌胃干預(yù)7 d后，各樣品均可以不同程度地降低小鼠DAI評分。與模型組相比，樣品組以不同程度降低小鼠的DAI改善小鼠UC，緩解小鼠便血便稀等病理學特征。其中樣品組緩解UC模型小鼠的病理學特征作用依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質(zhì)體。

圖3 小鼠灌胃階段DAI（A）與第14天DAI（B）評分Fig.3 DAI score during intragastric administration (A) and DAI score on the 14th day (B)

2.7 L-ΔSOD對UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

當小鼠結(jié)腸遭DSS損傷時，結(jié)腸容易發(fā)生充血腫脹現(xiàn)象，其中CMDI可以反映結(jié)腸大體損傷程度，同時從形態(tài)學角度分析L-ΔSOD對UC小鼠的改善情況。如圖4A所示，正常組結(jié)腸組織呈均勻細長狀，腸壁細膩光滑有彈性，無充血腫脹現(xiàn)象；模型組的結(jié)腸組織呈充血腫脹狀態(tài)，近盲腸端腫脹尤為明顯，腸壁質(zhì)地脆弱且極易斷裂，肉眼可見盲腸與結(jié)腸內(nèi)含血性不成形的糞便內(nèi)容物[40]；樣品組的結(jié)腸組織形態(tài)相比于模型組均有不同程度的好轉(zhuǎn)，結(jié)腸充血現(xiàn)象且腫脹程度大幅減輕，腸壁質(zhì)地恢復一定的彈性且不易斷裂尤其是L-ΔSOD組結(jié)腸已接近正常結(jié)腸組織形態(tài)。如圖4B所示，與模型組相比，樣品組的CMDI均下降，其中樣品組降低小鼠CMDI的能力依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質(zhì)體，表明L-ΔSOD恢復結(jié)腸組織形態(tài)為最佳。

圖4 小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（A）和小鼠CMDI評分（B）Fig.4 Morphology (A) and CMDI score (B) of mouse colon tissue

2.8 L-ΔSOD對UC小鼠結(jié)腸長度和密度的影響

DSS誘導的UC模型容易發(fā)生纖維化導致結(jié)腸長度縮短和結(jié)腸密度升高，可通過結(jié)腸長度和密度評估樣品改善UC的效果。由圖5可知，與模型組相比，樣品組結(jié)腸長度增加，結(jié)腸密度降低，其中ΔSOD和L-ΔSOD改善效果最顯著（P＜0.05），而空白脂質(zhì)體的干預(yù)對其無顯著影響（P＞0.05）。

圖5 小鼠結(jié)腸長度（A）和結(jié)腸密度（B）Fig.5 Length (A) and density (B) of mouse colon tissue

2.9 L-ΔSOD對UC小鼠脾臟系數(shù)的影響

脾臟作為機體的免疫器官，當機體發(fā)生UC炎癥時脾臟會腫大，因此脾臟系數(shù)能從側(cè)面評估L-ΔSOD改善UC的療效。如圖6所示，與模型組相比，樣品組的脾臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05），其中樣品組降低UC模型小鼠脾臟系數(shù)的能力依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質(zhì)體，且L-ΔSOD組的脾臟系數(shù)顯著低于SOD組（P＜0.05），表明SOD通過自組裝和脂質(zhì)體包埋后能更有效地改善UC。

圖6 小鼠脾臟系數(shù)Fig.6 Spleen index of mice

2.10 L-ΔSOD干預(yù)后UC小鼠結(jié)腸組織切片染色觀察結(jié)果

如圖7所示，正常組小鼠結(jié)腸的黏膜上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，無腫脹現(xiàn)象，隱窩結(jié)構(gòu)規(guī)則，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，杯狀細胞含量高。模型組小鼠結(jié)腸糜爛，腺體結(jié)構(gòu)破損，隱窩結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則狀態(tài)，腸絨毛變形破損，杯狀細胞缺失，伴有大量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，SOD、L、ΔSOD組和L-ΔSOD組均有明顯修復，其中ΔSOD組與L-ΔSOD組修復效果更加明顯，結(jié)腸表現(xiàn)和正常組相似。說明各樣品組對DSS誘導的UC模型中均有修復作用，各樣品修復UC模型小鼠的結(jié)腸狀態(tài)的效果依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞空白脂質(zhì)體＞SOD。

圖7 小鼠結(jié)腸組織病理切片HE染色結(jié)果（200×）Fig.7 Hematoxylin-eosin staining results of pathological sections of mouse colon tissue (200 ×)

2.11 L-ΔSOD對UC小鼠的結(jié)腸抗氧化指標的影響

GSH-Px具有抗氧化作用，在機體中作為質(zhì)子供體清除H2O2以及脂質(zhì)氫過氧化物。氧化應(yīng)激會引起細胞膜的脂質(zhì)過氧化，而MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一[41]。如圖8所示，相比模型組，L-ΔSOD中的GSH-Px活力顯著增加（P＜0.05），MDA含量明顯降低，說明L-ΔSOD在一定程度上能有效改善UC氧化應(yīng)激。

圖8 小鼠結(jié)腸內(nèi)GSH-Px活力（A）和MDA含量（B）Fig.8 GSH-Px activities (A) and MDA contents (B) in mouse colon

2.12 L-ΔSOD對UC小鼠結(jié)腸炎癥因子質(zhì)量濃度的影響

DSS誘導的UC模型會有大量炎性細胞浸潤至結(jié)腸黏膜固有層，炎性介質(zhì)使巨噬細胞轉(zhuǎn)化為促炎表型從而被激活，產(chǎn)生大量促炎細胞因子如TNF-α、IL-6以及IL-1β[42]。如圖9所示，相對于模型組，樣品組均可以不同程度地降低促炎性因子釋放量，其中以ΔSOD和L-ΔSOD效果最顯著（P＜0.05），表明兩種樣品均可以通過降低促炎性因子釋放量、減輕促炎性因子浸潤來改善UC。

圖9 小鼠結(jié)腸內(nèi)TNF-α（A）、IL-6（B）以及IL-1β（C）質(zhì)量濃度Fig.9 TNF-α (A),IL-6 (B) and IL-1β (C) contents in mouse colon

2.13 L-ΔSOD對UC小鼠的結(jié)腸緊密連接蛋白mRNA相對表達水平的影響

有缺陷的腸上皮緊密連接屏障是導致UC發(fā)展的重要因素，緊密連接（tight junction，TJ）中的兩種關(guān)鍵蛋白ZO-1和Occludin是腸道屏障的重要組成部分，可通過調(diào)節(jié)上皮細胞的屏障功能和腸道屏障的選擇通透性來預(yù)防炎癥發(fā)生[43-44]。如圖10所示，DSS誘導的UC模型小鼠中ZO-1和Occludin表達量顯著降低，表明UC模型小鼠腸黏膜屏障受到損傷。L-ΔSOD組可以顯著促進ZO-1和Occludin表達（P＜0.05），結(jié)合小鼠總體狀態(tài)，結(jié)果表明L-ΔSOD可以通過促進ZO-1和Occludin表達來修復腸黏膜屏障損傷，進而改善UC。

圖10 小鼠結(jié)腸組織內(nèi)ZO-1（A）和Occludin（B）mRNA相對表達水平Fig.10 Relative mRNA expression levels of ZO-1 (A) and Occludin-1 (B)in mouse colon tissues

3 結(jié)論

本實驗利用SOD加熱自組裝形成ΔSOD納米顆粒，其活力較天然SOD提高26.81%；FITC熒光標記實驗結(jié)果表明ΔSOD跨膜能力是天然SOD的（2.89±0.20）倍；通過多功能酶標儀和共聚焦顯微鏡探究SOD和ΔSOD清除ROS能力，結(jié)果表明ΔSOD清除由H2O2誘導Caco-2細胞產(chǎn)生的ROS的能力更強。利用逆向蒸發(fā)法制備的ΔSOD脂質(zhì)體的包埋率為（29.72±0.01）%，模擬胃腸道穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示包埋于脂質(zhì)體內(nèi)的ΔSOD在模擬胃腸道中的保留率達到40%左右，有利于口服L-ΔSOD緩解UC癥狀。在動物實驗中，使用DSS對小鼠造模，造模成功后，利用SOD、ΔSOD、空白脂質(zhì)體和L-ΔSOD進行灌胃實驗。結(jié)果顯示：樣品組均可降低UC模型小鼠的DAI評分，恢復結(jié)腸長度、降低結(jié)腸密度和CMDI評分，與模型組相比空白脂質(zhì)體和SOD組均無顯著性差異，而ΔSOD和L-ΔSOD均有顯著性改善（P＜0.05）；通過結(jié)腸組織病理切片分析，樣品組可以恢復UC模型小鼠黏膜上皮細胞結(jié)構(gòu)完整性，增加杯狀細胞含量以及修復隱窩結(jié)構(gòu)和腸絨毛結(jié)構(gòu)，減輕炎性細胞在黏膜下層的浸潤，其中L-ΔSOD修復效果最為顯著，基本達到與正常組相似水平；同時L-ΔSOD可以降低結(jié)腸組織MDA含量、降低結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎細胞因子質(zhì)量濃度，減輕結(jié)腸組織過氧化損傷；提高結(jié)腸組織GSH含量和ZO-1和Occludin相對表達水平，進而提高結(jié)腸組織抗氧化以及腸道屏障功能，降低腸道內(nèi)氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護腸道、抑制炎癥作用。

綜上所述，灌胃L-ΔSOD相比于SOD、ΔSOD對于DSS誘導的UC模型小鼠有著更優(yōu)異的炎癥緩解效果，這可能是因為SOD經(jīng)過自組裝后形成的納米顆粒具有更高的酶活力和穩(wěn)定性，賦予其更強的自由基清除能力，并且脂質(zhì)體對ΔSOD有良好的保護作用，使ΔSOD在胃腸道刺激下能保持良好的酶活力。因此，L-ΔSOD作為食品功能因子通過飲食干預(yù)進行預(yù)防和緩解UC癥狀是具有良好的應(yīng)用前景。此外，目前的研究僅限于DSS誘導的小鼠急性結(jié)腸炎，還需要在其他臨床UC模型中進行驗證?？傊@些結(jié)果表明SOD經(jīng)過自組裝形成的納米顆粒有良好的生物利用度。本研究可促進基于ΔSOD作為食品功能因子在許多其他炎癥性疾病中的應(yīng)用。