王 斌，汪 玲，閆 華，姜啟興，于沛沛，夏文水

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

甲殼素廣泛存在于蝦蟹殼、昆蟲(chóng)的表皮和各種真菌的細(xì)胞壁中，是自然界中僅次于纖維素的第二大聚合物[1]。殼聚糖是甲殼素降解和脫乙酰得到的自然界中唯一的陽(yáng)離子多糖，因?yàn)槠淞己玫纳锵嗳菪?、生物可降解性、無(wú)毒性和吸附性，作為功能材料得到廣泛的應(yīng)用[2]。但是，甲殼素和殼聚糖都是高分子聚合物，在中性pH值條件下溶解性差，這種特性限制了它們?cè)谑称?、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用[3]。然而，殼聚糖水解得到的聚合度在2～20之間的低分子殼寡糖具有很好的水溶性，2014年被國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委批準(zhǔn)為新食品原料[4]。殼寡糖被證實(shí)有很多的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗腫瘤、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、降血壓、降血脂、降膽固醇、促進(jìn)組織再生、增強(qiáng)藥物和DNA傳遞以及鈣的吸收等[5-7]，可有效治療和預(yù)防許多威脅生命的疾病，如癌癥、心臟病、糖尿病、肥胖和阿爾茨海默病等[8-10]。

在研究殼寡糖生理活性機(jī)制前，必須要明確殼寡糖在體內(nèi)消化、吸收、分布和代謝等過(guò)程。而目前關(guān)于殼寡糖的體內(nèi)消化吸收分布及其代謝途徑方面的研究還存在很多的爭(zhēng)議。陳佳祎[11]建立了體外靜態(tài)模型，首次發(fā)現(xiàn)聚合度2～5的殼寡糖不受胃腸道消化的影響，其結(jié)構(gòu)和含量保持不變；而聚合度6～10的殼寡糖在胃和腸消化中會(huì)降解為聚合度2～5的殼寡糖。早在1999年，有研究就發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的50%脫乙酰度殼聚糖在小鼠腹腔給藥后，能夠快速移動(dòng)到腎臟并通過(guò)尿液排出（大部分在14 h后通過(guò)尿液排出），幾乎不會(huì)分布到肝、脾、腹水和血漿中，排出的殼聚糖分子質(zhì)量變小，證實(shí)了大分子殼聚糖的生物可降解和不蓄積的特性[12]。Zeng Lintao等[13]研究了不同分子質(zhì)量和不同溶解度殼聚糖在小鼠體內(nèi)的吸收分布排泄情況，發(fā)現(xiàn)殼聚糖能夠被小鼠小腸吸收，可以分布到肝、腎、脾、胸腺、心、血液和肺中，在肝中的濃度明顯高于其他組織，隨著殼聚糖分子質(zhì)量減小，其水溶性增和腸道吸收率增加。王敏[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明FITC標(biāo)記的聚合度1～3的殼寡糖和8～11的殼寡糖混合物入血入腸比例分別為5.68∶1和9.84∶1，認(rèn)為殼寡糖在腸道的吸收比與殼寡糖的分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。無(wú)標(biāo)記的殼寡糖單體（聚合度2～5）體內(nèi)吸收研究結(jié)果顯示，只有殼二糖（chitobiose，COS2）和殼三糖（chitotriose，COS3）可以吸收入血，殼四糖（chitotetraose，COS4）和殼五糖（chitopentose，COS5）不能[15]。但是，Zhao Qini等[16]的研究表明，無(wú)標(biāo)記的COS5、殼六糖、殼七糖和殼八糖均可在大鼠血清中檢測(cè)到，隨著聚合度的增加吸收量降低。Zhu Limeng等[17]通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)殼寡糖混合物（聚合度2～7）具有良好的血腦屏障穿透能力。

目前的相關(guān)研究表明，高分子殼聚糖和低分子殼寡糖在動(dòng)物體內(nèi)均可以被吸收，吸收量與分子質(zhì)量和水溶性呈負(fù)相關(guān)，并且可以分布到心、肝、脾、肺、腎等器官中[18]，聚合度2～7的殼寡糖還可以跨過(guò)血腦屏障[17]。由于目前關(guān)于體內(nèi)吸收分布的研究大多采用殼寡糖混合物，成分難以定性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以重現(xiàn)，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能明確可以被吸收并分布到相應(yīng)靶器官發(fā)揮作用的主要結(jié)構(gòu)成分。同時(shí)由于殼寡糖口服給藥后經(jīng)過(guò)首過(guò)效應(yīng)，血藥濃度會(huì)降低，受不同檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度的影響，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大誤差，因此不同檢測(cè)方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異性，甚至出現(xiàn)相悖的結(jié)果。綜上，當(dāng)前對(duì)于不同聚合度殼寡糖單體的體內(nèi)吸收和各組織中分布的差異性還不明確。

本研究通過(guò)FITC標(biāo)記在消化道不被降解的殼寡糖單體（COS2、COS3、COS4和COS5），并灌胃昆明小鼠，借助小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)，直觀地觀察不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內(nèi)和離體組織器官中的吸收分布情況，進(jìn)一步解剖取得組織進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，分析不同聚合度殼寡糖在小鼠體內(nèi)的吸收分布的差異性，為殼寡糖功能活性機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系的研究提供理論支撐和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（39±2）g，7～8 周齡，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。實(shí)驗(yàn)小鼠自由飲食，在一個(gè)可控制的環(huán)境中飼養(yǎng)，控制溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%。光照黑暗各12 h，光照時(shí)間從早上8∶00到晚上22∶00。所有動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作都通過(guò)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理與動(dòng)物福利委員會(huì)審核，審核編號(hào)為JN.No20210415c1080520[077]。

COS2、COS3、COS4和COS5（純度大于90%）由實(shí)驗(yàn)自制；FITC（純度大于90%） 上海麥克林生化科技有限公司；TLC Silica gel 60 F254薄層硅膠板 德國(guó)Merck公司；其他相關(guān)試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

P型立式T216200層析缸（200 mmh 200 mm）上海信誼儀器廠有限公司；Scientz-10ND冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；IVIS Spectrum型小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng) 美國(guó)珀金埃爾默儀器公司；G9800A熒光分光光度汁 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 FITC標(biāo)記殼寡糖單體的制備

稱取0.2 g制備的殼寡糖單體（COS2、COS3、COS4和COS5）溶解在20 mL二甲基亞砜中，配制為10 mg/mL的溶液；稱取0.5 g FITC（與殼寡糖單體質(zhì)量比大于1∶2.42），溶解在無(wú)水甲醇中，配制為10 mg/mL溶液，用5 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值大于7.5（FITC溶液顏色為橙黃色后基本不再變化）；邊劇烈攪拌邊向殼寡糖溶液中緩慢滴加FITC溶液；避光攪拌反應(yīng)12 h，離心，取上清液，加入5 倍體積的丙酮，離心，棄掉上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，直到上清液中檢測(cè)不到FITC的熒光。將沉淀溶解在去離子水中，再次離心，取上清液冷凍干燥得到FITC標(biāo)記的殼寡糖單體粉末。

1.3.2 FITC標(biāo)記產(chǎn)物純度鑒定

通過(guò)薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法[18]對(duì)制備的FITC標(biāo)記產(chǎn)物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4、FITC-COS5進(jìn)行純度鑒定。以V（異丙醇）∶V（氨水）∶V（水）＝15∶7.5∶1為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣量為1 μL。待薄層色譜展開(kāi)結(jié)束，用吹風(fēng)機(jī)吹干，在波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈下觀察發(fā)光情況，鑒定游離FITC的殘留量和合成熒光標(biāo)記物。在硅膠板上噴灑0.2%的茚三酮顯色劑，熱風(fēng)吹至顯色，放置1 h，顯色后觀察殼寡糖殘留情況。

1.3.3 FITC標(biāo)記率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]測(cè)定FITC的標(biāo)記率，準(zhǔn)確稱取一定量FITC溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4，下同）溶液中，配制成1 μg/mL的FITC溶液，用PBS稀釋得到0.1、0.2、0.4、0.4、0.8 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)FITC溶液，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm、激發(fā)光狹縫寬度10 nm、發(fā)射光狹縫寬度2.5 nm條件下測(cè)定吸光度A，以A為縱坐標(biāo)，F(xiàn)ITC質(zhì)量濃度/（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

準(zhǔn)確稱取1～3mg的各FITC熒光標(biāo)記物溶于500～1000 mL的PBS中，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm、激發(fā)光狹縫寬度10 nm、發(fā)射光狹縫寬度2.5 nm條件下測(cè)定吸光度A，帶入FITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出FITC質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算各FITC標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率。

1.3.4 定性檢測(cè)

1.3.4.1 活體成像

17 只雄性昆明小鼠（38～42 g）提前一天進(jìn)行剃毛。一只作為空白對(duì)照，灌胃等量的生理鹽水（0.1 mL/10 mg）。剩余16 只隨機(jī)分為4 組，每組4 只，每組分別灌胃FITC-COS2（210 mg/kgmb）、FITC-COS3（123 mg/kgmb）、FITC-COS4（107 mg/kgmb）和FITC-COS5（97 mg/kgmb），通過(guò)不同單體的標(biāo)記率換算為COS2、COS3、COS4和COS5的劑量統(tǒng)一為65 mg/kgmb（殼寡糖的人體推薦劑量為低于0.5 g/d[4]，按照男性平均體質(zhì)量70 kg[20]，轉(zhuǎn)化系數(shù)為9.1，得到小鼠劑量為65 mg/kgmb）。每組4 只小鼠分別在灌胃0.5、1、2 h和4 h，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm條件下，用IVIS SPECTRUM型小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)熒光分布情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.2 離體組織成像

對(duì)灌胃1 h的小鼠活體成像后，在暗室內(nèi)解剖，取血、腦、心、肝、脾、肺、腎、胃腸道，將組織放進(jìn)檢測(cè)室內(nèi)，用IVIS SPECTRUM型小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)離體器官的熒光分布情況。

1.3.5 定量檢測(cè)

1.3.5.1 FITC-COS的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取一定量的標(biāo)記產(chǎn)物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4、FITC-COS5，用PBS配制為1～3 μg/mL的溶液，進(jìn)行梯度稀釋，得到一系列FITCCOS標(biāo)準(zhǔn)溶液，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm、激發(fā)光狹縫寬度10 nm、發(fā)射光狹縫寬度10 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)ITC-COS質(zhì)量濃度/（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.3.5.2 動(dòng)物組織采集

雄性KM小鼠（38～42 g）85 只，隨機(jī)分為17 組，每組5 只。分別為空白組、COS2（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組、COS3（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組、COS4（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組和COS5（0.5、1、2 h和4 h各一組）4 組?？瞻讓?duì)照組灌胃等量的生理鹽水（0.1 mL/10 mg），實(shí)驗(yàn)組各4 組小鼠灌胃FITC-COS2（210 mg/kgmb）、FITC-COS3（123 mg/kgmb）、FITCCOS4（107 mg/kgmb）和FITC-COS5（97 mg/kgmb），通過(guò)不同單體的標(biāo)記率換算為COS2、COS3、COS4和COS5的劑量統(tǒng)一為65 mg/kgmb。4 組小鼠分別在灌胃0.5、1、2 h和4 h各解剖一組，眼球取血后，收集腦、心、肝、脾、肺、腎組織。全血在靜置1 h以后，3500 r/min離心10 min，取血清；其他組織分別稱質(zhì)量后收集；所有樣品放置在－20 ℃避光保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.5.3 各組織熒光強(qiáng)度測(cè)定

血清用PBS稀釋一定的倍數(shù)；收集的各組織取0.3 g左右，記錄準(zhǔn)確質(zhì)量，按照體積比1∶9添加預(yù)冷的PBS，加入兩顆小磁珠，使用高通量組織研磨機(jī)60 Hz運(yùn)行90 s，重復(fù)3 次。10000 r/min離心10 min，取上清液；在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm、激發(fā)光狹縫寬度10 nm、發(fā)射光狹縫寬度10 nm條件下，以空白組小鼠組織勻漿液為空白調(diào)零后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，帶入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各殼寡糖單體的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖表繪制方法

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 FITC標(biāo)記殼寡糖分析結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)物純度鑒定結(jié)果

通過(guò)TLC分析定性鑒定了制備得到的熒光標(biāo)記產(chǎn)物純度，結(jié)果如圖1所示。在FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的反應(yīng)產(chǎn)物中均沒(méi)有檢測(cè)到游離的FITC（圖1A1、B1、C1、D1），說(shuō)明未反應(yīng)的FITC已經(jīng)除凈；FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的反應(yīng)產(chǎn)物中沒(méi)有檢測(cè)到游離的殼寡糖單體（圖1A2、B2、C2、D2），說(shuō)明標(biāo)記產(chǎn)物中沒(méi)有殼寡糖單體殘留，得到的均為FITC標(biāo)記物，可用于后續(xù)體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)的研究。

圖1 不同聚合度殼寡糖單體FITC標(biāo)記產(chǎn)物的TLC圖Fig.1 TLC profiles of FITC labeled COS monomers with different degrees of polymerization

2.1.2 不同聚合度殼寡糖單體FITC標(biāo)記率的測(cè)定

游離FITC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝599.0486－4.0458，R2＝0.9995。通過(guò)測(cè)定并計(jì)算得到COS2的標(biāo)記率為0.69，轉(zhuǎn)換為物質(zhì)的量比為1.95∶1（n（FITC）∶n（COS2）），表明COS2的氨基反應(yīng)率高；COS3、COS4和COS5的標(biāo)記率分別為0.47、0.39和0.33，轉(zhuǎn)換為物質(zhì)的量比分別為1.14∶1（n（FITC）∶n（COS3））、1.09∶1（n（FITC）∶n（COS4））和1.04∶1（n（FITC）∶n（COS5）），反應(yīng)率比較低。FITC標(biāo)記殼寡糖的標(biāo)記率隨著聚合度增加而降低，糖鏈越長(zhǎng)，反應(yīng)效率越低。

2.2 定性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 活體成像檢測(cè)結(jié)果

給小鼠灌胃FITC-COS2～FITC-COS5，采用IVIS SPECTRUM型小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。FITC-COS2快速分布到全身，1 h達(dá)到最大分布；FITC-COS3在0.5 h檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度很弱，在1 h和2 h能夠分布到全身，而FITC-COS4和FITC-COS5在小鼠體內(nèi)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度很弱，基本檢測(cè)不到。因?yàn)镃OS3、COS4和COS5的FITC標(biāo)記率遠(yuǎn)低于COS2，在寡糖的灌胃劑量一致的情況下，COS3、COS4和COS5的熒光信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于COS2。

圖2 不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內(nèi)的活體成像Fig.2 In vivo imaging of distribution of COS monomers with different DPs in mice

2.2.2 離體組織成像檢測(cè)結(jié)果

為了更進(jìn)一步確定不同聚合度殼寡糖單體在小鼠體內(nèi)的吸收和組織中的分布情況，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中血藥質(zhì)量濃度最大的時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行解剖[15]，取其主要器官，用IVIS Spectrum型小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)各器官中的熒光分布情況，結(jié)果如圖3所示。給小鼠灌胃FITC-COS2～FITC-COS51 h后，F(xiàn)ITC-COS2在腦、肝、肺、腎和胃腸道中均檢測(cè)到熒光信號(hào)，在心、脾和血清中幾乎檢測(cè)不到熒光信號(hào)；FITC-COS3在腦、肝、肺、腎和胃腸道中檢測(cè)到熒光信號(hào)，在心、脾和血清中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)；FITC-COS4在腦、肝、腎、血清和胃腸道中檢測(cè)到信號(hào)，在心、脾、肺和血清中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)；FITC-COS5在腦、肝、肺、腎和胃腸道中檢測(cè)到熒光信號(hào)，在心、脾和血清中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITCCOS5灌胃給小鼠1 h后，在腦、肝、腎和胃腸道均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，而在心、脾和血清中則未檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，肺中僅FITC-COS4未檢測(cè)到熒光信號(hào)。

圖3 不同聚合度殼寡糖單體的離體組織成像Fig.3 In vitro imaging of distribution of COS monomers with different DPs in mouse tissues

2.3 定量檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 不同聚合度殼寡糖單體FITC標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程不同聚合度殼寡糖單體的熒光標(biāo)記產(chǎn)物，根據(jù)熒光定量得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示。根據(jù)各組織上清液測(cè)定的熒光強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)應(yīng)組別的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到該組織中的FITC-COS2～FITC-COS5的質(zhì)量濃度，再根據(jù)不同聚合度殼寡糖單體的標(biāo)記率轉(zhuǎn)換后可以得到該組織中COS2～COS5的質(zhì)量濃度，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)不同聚合度殼寡糖單體吸收分布量的比較。

表1 不同聚合度殼寡糖單體熒光標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard curves for determination of fluorescence labelled COS monomers with different DPs

2.3.2 不同聚合度殼寡糖單體的吸收

殼寡糖的血清質(zhì)量濃度一定程度上可以反映殼寡糖在體內(nèi)被吸收的情況[13]。COS2、COS3、COS4和COS5在灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)的血清質(zhì)量濃度如圖4所示，在給藥后0.5 h和1 h，不同聚合度殼寡糖的血清質(zhì)量濃度為COS2＞COS4＞COS3＞COS5；在給藥2 h時(shí)，不同聚合度殼寡糖的血清質(zhì)量濃度為COS2＞COS3＞COS5＞COS4；在給藥4 h時(shí)，不同聚合度殼寡糖的血清質(zhì)量濃度為COS2＞COS3＞COS4＞COS5。COS2和COS4在給藥后1 h血清質(zhì)量濃度達(dá)到最大，而COS3和COS5在2 h血清質(zhì)量濃度達(dá)到最大；血清中的峰值質(zhì)量濃度為COS2＞COS4＞COS3＞COS5。

圖4 不同聚合度殼寡糖單體的血清質(zhì)量濃度Fig.4 Serum concentrations of COS monomers with different DPs at different times after administration

2.3.3 不同聚合度殼寡糖單體在不同組織中的分布

圖5顯示了COS2、COS3、COS4和COS5灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)在所測(cè)各組織中的分布情況。可以看出，殼寡糖能分布到所有被檢測(cè)的組織中（腦、心、肝、脾、肺和腎）。COS2灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心＞脾＞肺＞腦；在1 h和2 h時(shí)的分布趨勢(shì)一樣，由高到底依次為腎＞脾＞心＞肝＞肺＞腦；在4 h時(shí)各組織器官中依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在各組織器官中峰值含量依次為腎＞脾＞心＞肝＞肺＞腦。COS3灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心≈脾≈肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺，腦組織中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在4 h時(shí)各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心≈脾，肺和腦中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在各組織器官中的峰值含量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦。COS4灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心＞脾＞肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞脾＞心＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦組織中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在4 h時(shí)各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在各組織器官中的峰值分布量依次為腎＞肝＞脾＞心＞肺＞腦。COS5灌胃0.5 h后，在各組織器官中的分布量依次為肝＞腎＞心≈脾＞肺＞腦；在1 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦；在2 h的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦組織中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在4 h時(shí)各組織器官中的分布量依次為腎＞肝＞心＞脾，肺和腦中未檢測(cè)到熒光信號(hào)；在各組織器官中的峰值分布量依次為腎＞肝＞心＞脾＞肺＞腦。

圖5 不同聚合度殼寡糖單體在小鼠腎（A）、肝（B）、心（C）、脾（D）、肺（E）和腦（F）中的含量Fig.5 Concentrations of COS monomers with different DPs in kidney(A),liver (B),heart (C),spleen (D),lung (E) and brain (F) tissues at different times after administration

COS2、COS3、COS4和COS5灌胃后0.5～4 h在腎、心、脾、肺和腦組織中的分布量總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在1 h達(dá)到最大峰值。但是，COS2、COS3、COS4和COS5在肝中的分布量在0.5 h最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢下降。COS2、COS3、COS4和COS5在心、脾、肺和腦組織中1 h的分布趨勢(shì)和血清的峰值濃度趨勢(shì)具有重合性，均為COS2＞COS4＞COS3＞COS5。而COS2、COS3、COS4和COS5在肝和腎中的分布，不同時(shí)間點(diǎn)均為COS5＞COS4＞COS3＞COS2，隨著聚合度增加而增加。

3 討論

殼寡糖的單體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與體內(nèi)的多種單糖（葡萄糖、半乳糖等）結(jié)構(gòu)相似，缺乏特征的官能團(tuán)，經(jīng)過(guò)口服吸收入血含量極低且內(nèi)源性糖類對(duì)其測(cè)定也會(huì)產(chǎn)生一定的干擾[21]。熒光探針標(biāo)記操作簡(jiǎn)單，且熒光的檢測(cè)敏感性比傳統(tǒng)紫外-可見(jiàn)光譜法高3～4 個(gè)數(shù)量級(jí)[22]，熒光標(biāo)記以后，殼寡糖在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀和雙光子激發(fā)熒光成像技術(shù)等熒光檢測(cè)儀器下變得“可視化”，從而能夠在細(xì)胞、組織乃至活體水平上對(duì)其進(jìn)行定位檢測(cè)[21]。FITC最大吸收光波長(zhǎng)為490～495 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530 nm，因具有溫度系數(shù)低、壽命長(zhǎng)、光穩(wěn)定性好、量子產(chǎn)率高和標(biāo)記效率高等優(yōu)點(diǎn)，被用作蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的熒光探針，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用，是熒光標(biāo)記分析方法中常見(jiàn)的方法之一；在堿性條件下，F(xiàn)ITC分子中的異硫氰基可通過(guò)親核加成反應(yīng)與本身具有活性氨基基團(tuán)的多糖直接共價(jià)偶聯(lián)，完成多糖的FITC熒光標(biāo)記[23]。FITC作為目前應(yīng)用最廣泛的熒光標(biāo)記方法之一，已實(shí)現(xiàn)了對(duì)殼聚糖、麥冬多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、灰樹(shù)花多糖等多種多糖的標(biāo)記[24]。已有研究證明FITC標(biāo)記對(duì)殼寡糖的體內(nèi)吸收代謝幾乎沒(méi)有影響[19]，并且FITC在胃腸道消化道內(nèi)不會(huì)從殼寡糖分子上脫落[14]。本研究采用FITC對(duì)不同聚合度殼寡糖單體進(jìn)行標(biāo)記，每一個(gè)聚合度的殼寡糖都有一個(gè)游離的氨基，殼寡糖連接FITC的最大結(jié)合數(shù)即為殼寡糖的聚合度。FITC分子質(zhì)量為389.4 Da，殼寡糖單糖分子質(zhì)量為161 Da，故0.2 g殼寡糖可共價(jià)結(jié)合0.484 g的FITC，即殼寡糖與FITC的質(zhì)量比為1：2.42[14]。因此選擇0.2 g殼寡糖，加入0.5 g FITC進(jìn)行反應(yīng)，以保證FITC過(guò)量，從而保證殼寡糖單體的標(biāo)記率。最后，得到4 個(gè)標(biāo)記后的產(chǎn)物FITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITCCOS5，標(biāo)記率以質(zhì)量比公式計(jì)算分別為0.69、0.47、0.39和0.33，結(jié)果表明隨著聚合度增加，殼寡糖的標(biāo)記率降低，這可能與殼寡糖單體的空間結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性。如果要統(tǒng)一各組殼寡糖單體COS2、COS3、COS4和COS5的灌胃劑量均為65 mg/kgmb，那么每組FITC標(biāo)記物FITCCOS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5的灌胃劑量分別為65/（1－0.69）＝210 mg/kgmb、65/（1－0.47）＝123 mg/kgmb、65/（1－0.39）＝107 mg/kgmb和65/（1－0.33）＝97 mg/kgmb。

給小鼠灌胃后，活體成像結(jié)果顯示FITC-COS4、FITC-COS5的熒光信號(hào)基本檢測(cè)不到。而離體組織成像結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-COS2、FITC-COS3、FITC-COS4和FITC-COS5灌胃小鼠1 h后，在腦、肝、腎和胃腸道均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，而在心、脾和血清中則未檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，肺中僅FITC-COS4未檢測(cè)到熒光信號(hào)。但是，對(duì)解剖的組織處理以后，熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)的結(jié)果顯示，聚合度2～5的殼寡糖單體均可以吸收入血，能分布到腎、肝、心、脾、肺和腦組織中。這三者實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在矛盾之處。研究表明，動(dòng)物組織中的成分如水、脂肪、氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和黑色素等在200～650 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見(jiàn)光區(qū)域具有很強(qiáng)的吸收和散射特性，導(dǎo)致FITC熒光染料其組織穿透深度有限，光只可以穿透幾百微米到一毫米的深度，組織自身熒光信號(hào)強(qiáng)度和攝入食物引起的背景信號(hào)強(qiáng)度也比較高，從而可能導(dǎo)致“可視化”水平的檢測(cè)存在一定的偏差[25-26]。因此，采用活體成像很難進(jìn)行定量分析，但是采用活體成像技術(shù)對(duì)離體組織進(jìn)行觀察，可以直觀地看到4 個(gè)殼寡糖單體均可以跨過(guò)血腦屏障分布到腦組織，而實(shí)際上進(jìn)行熒光分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)，腦組織中的分布量是最低的。而對(duì)于心、脾、血清等血紅色的組織，由于濃度低且背景熒光強(qiáng)而導(dǎo)致殼寡糖單體在離體組織成像時(shí)檢測(cè)不到。但是，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)解剖組織進(jìn)行勻漿處理以后得到澄清透明的液體，不僅可以除去組織和血液中的氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白，而且可以避免因?yàn)榇┩干疃炔粔蛞约氨尘盁晒舛鴮?dǎo)致的結(jié)果偏差，進(jìn)一步確定殼寡糖單體在組織中的分布情況，并進(jìn)行不同聚合度單體的比較。

胡錦珍[27]的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC標(biāo)記后的殼聚糖，通過(guò)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)物在各組織中的決定系數(shù)均大于0.9950，在血清和組織樣品中的回收率符合藥物體內(nèi)分析的技術(shù)要求；標(biāo)記的產(chǎn)物在各組織液中冷藏24 h和室溫貯藏4 h，熒光強(qiáng)度雖然有所下降，但是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，符合藥物分析技術(shù)要求。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果顯示COS2、COS3、COS4和COS5均能被小腸吸收，但是在血清中的濃度卻很低（相比腎、肝、脾和心），這主要與血清高效的殼聚糖清除作用有關(guān)。Ricardson等[28]研究發(fā)現(xiàn)，125I標(biāo)記的殼聚糖樣品經(jīng)過(guò)靜脈注射后很快被血清清除。Chen Ping[29]的研究表明，COS2、COS3、COS4和COS5在腸道的表觀滲透系數(shù)均大于1h 10－6cm/s，表明殼寡糖在小腸內(nèi)通過(guò)多種方式吸收，被動(dòng)擴(kuò)散以及載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)并存；COS2、COS3、COS4和COS5的表觀滲透系數(shù)由高到低依次為COS2＞COS4＞COS3＞COS5，與本次實(shí)驗(yàn)各聚合度殼寡糖在血清中峰值濃度趨勢(shì)表現(xiàn)出一致性。Chen Anshu等[15]研究發(fā)現(xiàn)給大鼠口服30 mg/kgmb殼寡糖后，只有COS2和COS3能被小腸吸收入血，并且在給藥1 h后血藥濃度達(dá)到最大，而其他聚合度殼寡糖無(wú)法被胃腸道吸收。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的矛盾，可能是因?yàn)楣辔负驝OS4和COS5的吸收量低，血液濃度較低，液相色譜的檢測(cè)方法檢出限達(dá)不到，也有可能是因?yàn)檠逯衅渌s蛋白和寡糖的影響，屏蔽了殼寡糖信號(hào)。陳佳祎[11]在研究殼寡糖體外消化時(shí)發(fā)現(xiàn)，體外模擬的小腸消化液中，COS2的出峰被影響而不能進(jìn)行定量。魏鵬等[30]采用高效陰離子交換色譜結(jié)合脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)非翻轉(zhuǎn)腸囊中殼寡糖吸收，發(fā)現(xiàn)COS5和殼六糖檢測(cè)受到影響，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，血清和各組織中的組分更加復(fù)雜，更加容易受影響。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，尿液排出是殼寡糖的主要清除方式[31]；本研究表明灌胃1、2 h和4 h后，COS2、COS3、COS4和COS5在腎的分布量最高，在1 h達(dá)到峰值后，分布量緩慢降低，表明殼寡糖確實(shí)有可能通過(guò)尿液在緩慢排泄。肝臟是外源化合物進(jìn)入體內(nèi)吸收的第一道屏障[32]，因此，殼寡糖在肝臟中的分布是反映吸收情況的一個(gè)重要參數(shù)[33]。COS2、COS3、COS4和COS5在灌胃后，0.5 h迅速到達(dá)肝，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在肝的含量逐漸降低，各聚合度殼聚糖在肝的含量與聚合度成正比；各聚合度殼寡糖在肝的分布量與其他組織相比明顯偏高，說(shuō)明殼寡糖在肝有一定的累積效應(yīng)，隨著分子質(zhì)量增加，累積效應(yīng)增強(qiáng)。這與Zeng Lintao等[13]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖在肝中的濃度明顯高于其他組織，隨著殼聚糖分子質(zhì)量降低，水溶性增加和腸道吸收率增加。COS2、COS3、COS4和COS5均可以分布到腦組織，這與之前研究所報(bào)道低分子質(zhì)量殼寡糖有良好的血腦屏障通透性[17]是一致的。COS2、COS3、COS4和COS5在心、脾和肺中分布量很少，甚至檢測(cè)不到，與文獻(xiàn)中報(bào)道的殼寡糖主要分布在有大血管分布的器官（肝和腎）中[34]具有一致性。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)聚合度2～5的殼寡糖單體均可以吸收入血，分布到腎、肝、心、脾、肺和腦組織中，在肝和腎中的分布與聚合度呈正相關(guān)，在其他組織中和血清中的峰值分布呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)（COS2＞COS4＞COS3＞COS5）。此外，本研究表明聚合度2～5的殼寡糖可以跨越血腦屏障這一障礙，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究中有著天然的優(yōu)勢(shì)和潛力。聚合度2～5的殼寡糖在腎臟中的分布量最高，且在1 h到達(dá)峰值以后，含量下降緩慢，有一定的蓄積趨勢(shì)；在肝臟的分布量隨著聚合度的增加而增加。本實(shí)驗(yàn)可為預(yù)防脂肪肝、肝癌、腎癌等肝臟和腎臟相關(guān)的疾病提供一定的理論參考。明確不同聚合度殼寡糖單體的體內(nèi)吸收分布的差異性，對(duì)于殼寡糖的構(gòu)效關(guān)系以及功能活性機(jī)制研究具有一定的指導(dǎo)意義，有助于促進(jìn)殼寡糖在食品功能性食品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。