郝志龍，林宏政，徐邢燕，李鑫磊，俞曉敏，岳 川，孫 云，金心怡,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.浙江商業(yè)技師學(xué)院，浙江 寧波 315000；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福州 350013；4.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院，園藝植物生物學(xué)及代謝組學(xué)中心，福建 福州 350002）

烏龍茶獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)與其采后特有的加工工藝密切相關(guān)，茶梢采摘脫離茶樹母體后仍是有生命活力的個(gè)體，隨后的做青工藝伴隨有光照、失水、冷熱、力等各種非生物脅迫，誘導(dǎo)和促進(jìn)植物多酚、揮發(fā)性物質(zhì)等次生代謝物合成[1]。其中機(jī)械搖青是烏龍茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序之一，機(jī)械力脅迫作為植物主要的非生物脅迫因素之一，其生物學(xué)效應(yīng)主要有激素調(diào)節(jié)機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)作用機(jī)制等，進(jìn)而影響植物的光合作用、呼吸作用、活性氧代謝等一系列體內(nèi)生理生化變化[2]，為烏龍茶或花香紅茶、白茶等特殊品質(zhì)茶葉風(fēng)味的最終形成奠定基礎(chǔ)。實(shí)際生產(chǎn)中搖青時(shí)間主要通過做茶師傅的感官判斷，目前缺乏從青葉生理變化角度判斷的依據(jù)。因此，探明青葉響應(yīng)持續(xù)機(jī)械脅迫的水分含量、光系統(tǒng)II（photosystem II，PS II）參數(shù)、抗氧化酶活性和亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)等生理變化規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)烏龍茶搖青工藝品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。

植物對(duì)機(jī)械脅迫的生物學(xué)效應(yīng)研究已由宏觀水平逐漸深入到細(xì)胞和代謝水平，植物遭受機(jī)械脅迫的過程中除了宏觀組織器官破損，生理活動(dòng)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生較大變化。機(jī)械損傷會(huì)誘導(dǎo)植物受傷和鄰近部位細(xì)胞壁發(fā)生栓化，形成愈傷組織，誘導(dǎo)細(xì)胞壁非木質(zhì)化修飾，產(chǎn)生特殊的蛋白質(zhì)和胼胝質(zhì)來自我保護(hù)并適應(yīng)機(jī)械損傷[3-5]。機(jī)械損傷會(huì)使細(xì)胞發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化，膜完整性遭到破壞，細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而引起組成物質(zhì)滲出并降解，形成一些小分子信使物質(zhì)，能夠激活下游調(diào)控機(jī)制，抵御機(jī)械脅迫[6-8]。植物體在遭受機(jī)械脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧自由基動(dòng)態(tài)平衡受到影響，產(chǎn)生大量的活性氧，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，造成蛋白、膜脂和DNA等損傷，誘導(dǎo)氧化脅迫[9-10]。茶葉加工過程中抗氧化酶活性與品質(zhì)形成密切相關(guān)，茶鮮葉在攤放過程中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性先升高后迅速降低，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性保持升高的趨勢(shì)[11]。做青前期適當(dāng)曬青、搖青能夠提高SOD活性，搖青過度則會(huì)抑制SOD活性提高，搖青還會(huì)使PPO活性降低，整葉PPO活性在做青過程中呈降低-升高-降低的變化規(guī)律[12-15]。搖青力屬于生物力學(xué)范疇，搖青力做功能增加青葉內(nèi)能，適度破損葉細(xì)胞，提高青葉能量水平[15]。葉細(xì)胞破損可通過酶作用促進(jìn)內(nèi)含物轉(zhuǎn)化，青葉能量提高可為青葉內(nèi)含物運(yùn)輸提供動(dòng)能，促進(jìn)物質(zhì)運(yùn)輸，誘發(fā)化學(xué)反應(yīng)，有利于香氣形成[16]。金心怡等[15]研究發(fā)現(xiàn)，搖青作用力主要為機(jī)械運(yùn)動(dòng)力和摩擦力，不同作用力做青效果不同。機(jī)械運(yùn)動(dòng)力有利于青葉“走水”，機(jī)械摩擦力有利于茶多酚酶促氧化，誘發(fā)香氣，運(yùn)動(dòng)力和摩擦力協(xié)調(diào)配合才能形成烏龍茶所特有的香高味醇品質(zhì)。盡管采后果蔬振動(dòng)脅迫下的生理生化變化研究較多[17-19]，也有研究報(bào)道了不同振動(dòng)做青工藝（包含晾青）對(duì)茶葉生理生化品質(zhì)的影響[14,20-22]，但有關(guān)振動(dòng)力持續(xù)處理對(duì)青葉生理變化的影響尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，振動(dòng)力搖青具有青葉質(zhì)點(diǎn)受力均勻、上下跳動(dòng)高度一致、振動(dòng)頻率可精細(xì)控制等優(yōu)點(diǎn)，能夠克服滾筒搖青青葉下落高度不同而造成的受力不均勻問題，提高青葉受力均勻性，適用于小批量烏龍茶搖青試驗(yàn)[22]。本實(shí)驗(yàn)利用前期研發(fā)的振動(dòng)搖青試驗(yàn)臺(tái)為青葉提供更均勻的機(jī)械力脅迫，研究青葉對(duì)振動(dòng)力脅迫的生理響應(yīng)，以明確青葉響應(yīng)振動(dòng)力脅迫的水分含量、PS II參數(shù)、抗氧化酶活性和亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)等生理變化規(guī)律，為指導(dǎo)烏龍茶搖青工藝品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘鐵觀音’品種中開面三、四葉嫩梢采摘自福建省福清市南湖山茶業(yè)有限公司，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的同一片生態(tài)茶園，于2017年10月統(tǒng)一采摘。

所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

振動(dòng)脅迫試驗(yàn)臺(tái)參數(shù)：臺(tái)面尺寸為1100 mmh 1200 mm，固定振幅為25 mm，功率2.2 kW，振動(dòng)頻率0～330 r/min，最大加速度20 g，最大負(fù)荷100 kg，可定時(shí)控制（0～60 min），最大電流5 A，電源220 V。

FE38-Meter電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Imaging-Pam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng) 德國(guó)WALZ公司；5430R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；LKB Nova超薄切片機(jī) 瑞典Bromma公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛科技有限公司；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉的振動(dòng)力脅迫處理

采摘鮮葉經(jīng)適度萎凋（自然萎凋45 min）后分為兩組，一組用于持續(xù)振動(dòng)力處理（V組），另一組均勻攤放在相同環(huán)境條件下，不做任何處理作為對(duì)照（C組），環(huán)境溫度（22.0f 0.4）℃、相對(duì)濕度（83.8f 2.0）%。以振動(dòng)力脅迫時(shí)間為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)方案如表1所示，基于前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定振動(dòng)頻率300 r/min使茶葉均勻振動(dòng)。不同處理樣品取樣編號(hào)規(guī)則：萎凋葉記為C0；自然攤放5 min青葉記為C5，自然攤放10 min青葉記為C10，以此類推；持續(xù)振動(dòng)力脅迫5 min青葉記為V5，持續(xù)振動(dòng)力脅迫10 min青葉記為V10，以此類推。分析振動(dòng)力脅迫處理150 min內(nèi)（0、15、30、60、90、120、150 min）青葉第二葉水分含量變化規(guī)律，以及處理30 min內(nèi)青葉氣味（0、5、15、30 min）、第二葉PS II參數(shù)（0、5、10、15、30 min）、活性氧代謝酶活力（0、5、10、15、30 min）及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（0、5、15、30 min）變化規(guī)律。

1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 青葉水分含量測(cè)定及青葉氣味評(píng)價(jià)

參照GB/T 8304-2013《茶水分測(cè)定》[23]，采用120 ℃快速烘干法測(cè)定青葉水分含量，3 次重復(fù)，取平均值。水分含量以干基水分含量表示，按式（1）計(jì)算。

式中：m1為試樣烘前質(zhì)量/g；m2為試樣烘后質(zhì)量/g。

青葉氣味評(píng)價(jià)由3 位評(píng)茶經(jīng)驗(yàn)豐富的評(píng)茶師參照茶葉感官審評(píng)的香氣描述方法進(jìn)行判斷，并記錄評(píng)語。

1.3.2.2 青葉PS II參數(shù)測(cè)定

選取5 個(gè)處理茶梢放置在暗適應(yīng)箱中20 min后，將茶梢第二葉放置在Imaging-Pam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)葉片支架上，測(cè)定參數(shù)包含PS II實(shí)際光合效率Y（II）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y（NO）、光化學(xué)猝滅系數(shù)qP、電子傳遞速率（electron transfer rate，ETR），每個(gè)處理重復(fù)5 次。

1.3.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定

取備用樣第二葉用自來水洗凈后用蒸餾水沖洗3 次，用濾紙吸干表面水，將葉片剪成1 cmh 2 cm的長(zhǎng)條備用，然后快速稱取鮮樣0.1 g，分別置于裝有10 mL去離子水的試管中，蓋上玻璃塞在室溫下浸泡處理12 h，用電導(dǎo)儀測(cè)定浸提液電導(dǎo)率R1/（S/m），然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測(cè)定浸提液電導(dǎo)率R2/（S/m），按式（2）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

1.3.2.4 抗氧化酶活力測(cè)定

取備用樣第二葉，用打孔器避開主脈取0.05 g左右置于預(yù)冷研缽中，加提取液（含50 mmol/L KH2PO4-KOH（pH 7.5）、5 g/100 mL不溶性交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5 g/100 mL曲拉通X-100）2 mL和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，冷凍離心機(jī)15000hg離心10 min，上清液用于酶活力的測(cè)定?？箟难徇^氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、CAT、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力參照林鄭和等[24]的方法測(cè)定。

1.3.2.5 青葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

參照Du等[25]方法，選取各處理茶梢第二葉，避開主脈，用手術(shù)刀快速切成0.5 mmh 1.0 cm條狀，置于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定液（以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制）中，于4 ℃固定過夜，進(jìn)行脫水和包埋處理后，采用LKB Nova超薄切片機(jī)切片（厚度約為70～90 nm），并將切片分別置于醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液中染色15 min和漂洗。在JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡下選擇多個(gè)視野進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013以及SPSS 21.0軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和單因素方差、Duncan’s test顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 振動(dòng)力脅迫過程青葉水分含量變化

離體后的茶鮮葉在自然攤放狀態(tài)下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水分不斷蒸發(fā)，水分含量不斷降低。本研究中青葉水分含量變化如圖1所示，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，水分含量逐漸降低，振動(dòng)力脅迫處理青葉水分含量降低較快，但30 min內(nèi)與自然攤放處理葉和萎凋葉間差異均不顯著，60 min后顯著低于自然攤放葉和萎凋葉（P＜0.05）。由此可見，振動(dòng)力持續(xù)脅迫60 min及以上能顯著降低青葉的水分含量，說明振動(dòng)脅迫能加速水分的散失，一定處理時(shí)間（60 min）后水分脅迫效果開始凸顯，這可能是振動(dòng)脅迫使青葉處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，葉表面的葉面邊界層容易遭受破壞，更有利于水分的蒸發(fā)所致。因此，若要研究單純振動(dòng)力脅迫效應(yīng)，則應(yīng)排除因水分脅迫差異引起的效應(yīng)，故后續(xù)其他生理指標(biāo)分析時(shí)間點(diǎn)選取30 min以內(nèi)。

圖1 振動(dòng)力脅迫對(duì)青葉水分含量的影響Fig.1 Effect of vibration stress on water contents in tea leaves

2.2 振動(dòng)力脅迫青葉氣味變化

隨著振動(dòng)力脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，青葉氣味變化如表2所示。隨著振動(dòng)力脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，青葉青臭氣明顯增強(qiáng)，萎凋階段產(chǎn)生的清香減弱，而自然攤放保持萎凋的清香，青氣逐漸變?nèi)酢?/p>

表2 振動(dòng)力脅迫過程青葉氣味變化Table 2 Changes in smell of tea leaves under vibration stress

2.3 振動(dòng)力脅迫青葉PS II參數(shù)變化

植物葉片PS II參數(shù)是反映脅迫程度的重要指標(biāo)，通過分析青葉PS II參數(shù)在振動(dòng)力脅迫響應(yīng)過程中的變化，能夠明確青葉的脅迫程度及電子傳遞情況。葉片Y（II）為PS II反應(yīng)中心實(shí)際光合效率，表示線性電子傳遞的量子效率，是PS II反應(yīng)中心在部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率。由圖2A可知，隨著振動(dòng)力脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Y（II）總體逐漸降低。V5、V10的Y（II）顯著低于自然攤放葉，V10達(dá)到最低值（0.0838），表明振動(dòng)力脅迫使青葉光能捕獲效率降低。Y（NO）為PS II反應(yīng)中心非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額，反映光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換、自我保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制和耗散過多光能的強(qiáng)弱。由圖2B可知，隨著振動(dòng)力脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Y（NO）逐漸升高，自然攤放葉相對(duì)較穩(wěn)定，其中V30最大（0.1946），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05）。葉片qP為PS II反應(yīng)中心的光化學(xué)猝滅系數(shù)，反映PS II反應(yīng)中心的開放程度及天線色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞的份額。由圖2C可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片PS II qP總體逐漸降低。振動(dòng)力脅迫青葉qP下降幅度較大，V10、V15顯著低于對(duì)照處理（P＜0.05），V15最低，為0.2788。葉片PS II ETR為光合電子傳遞速率，由圖2D可知，振動(dòng)力脅迫青葉ETR呈先降后升的趨勢(shì)，自然攤放青葉呈下降趨勢(shì)，振動(dòng)力作用5 min后青葉ETR顯著低于自然攤放葉（P＜0.05），V10的ETR從萎凋葉22.72降低到最低（15.88）。說明短時(shí)間（5～10 min）振動(dòng)力脅迫使ETR顯著降低，光合電子傳遞受阻，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，青葉逐漸適應(yīng)這種脅迫，ETR又逐漸恢復(fù)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

圖2 振動(dòng)力脅迫對(duì)青葉PSII參數(shù)的影響Fig.2 Effect of vibration stress on PS II parameters in tea leaves

振動(dòng)力脅迫青葉PS II參數(shù)Y（II）和qP呈下降趨勢(shì)，ETR呈先降后升的趨勢(shì)，5 min和10 min時(shí)Y（II）和ETR顯著低于自然攤放葉，Y（NO）呈上升趨勢(shì)，30 min時(shí)與自然攤放組相比達(dá)到顯著差異水平。說明青葉通過降低PS II反應(yīng)中心的開放比例以及線性電子傳遞的量子效率，使Y（II）降低以減少光合碳同化提供的能量；隨著振動(dòng)力作用時(shí)間延長(zhǎng)，Y（NO）升高，PS II反應(yīng)中心光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換和自我保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制逐漸減弱，無法耗散過多的能量，青葉受到傷害加重；振動(dòng)力脅迫能夠降低青葉PS II反應(yīng)中心的開放程度，天線色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞的份額減少，qP降低，脅迫加劇，光合電子傳遞受阻，傳遞速率ETR顯著降低，這與郭春芳[26]、柯玉琴[27]等研究茶樹受水分和聚乙二醇重度脅迫時(shí)葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的趨勢(shì)一致，說明振動(dòng)力處理能在較短時(shí)間（5～15 min）對(duì)采后青葉產(chǎn)生明顯脅迫效應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間（30 min）處理產(chǎn)生重度脅迫效應(yīng)。

2.4 振動(dòng)力脅迫青葉電導(dǎo)率及活性氧代謝酶活力變化

相對(duì)電導(dǎo)率是評(píng)估植物葉片細(xì)胞膜透性的基本指標(biāo)，其高低相應(yīng)代表細(xì)胞膜透性大小。如圖3A所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，青葉相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，振動(dòng)力脅迫青葉相對(duì)電導(dǎo)率升高較快，處理10 min后均顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），由萎凋葉的0.3097增加到0.3843，V30達(dá)最大值，為0.5242，而C30僅上升至0.3891，與V10相當(dāng)。這與黃毅彪[14]、劉波[20]等研究所得振動(dòng)強(qiáng)度越大，葉片相對(duì)電導(dǎo)率越高、細(xì)胞滲透率越大的結(jié)果一致。說明振動(dòng)力脅迫能夠加劇青葉細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，提高其透性，促進(jìn)膜內(nèi)可溶物滲出，為形成茶葉品質(zhì)的生化反應(yīng)提供條件。

APX、CAT、DHAR、GR和MDAR是植物抗壞血酸-谷胱甘肽（ascorbic acid-glutathione，ASA-GSH）氧化還原途徑的重要酶，對(duì)還原型ASA和GSH再生具有重要作用，而ASA和GSH是重要的非酶促抗氧化物質(zhì)[28]。如圖3B～F所示，除CAT和MDAR外，其他抗氧化酶活力隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，總體呈上升或先升后降趨勢(shì)。振動(dòng)力脅迫青葉MDAR活力呈波浪式變化（圖3D），V5最高，為0.1664 μmol/（gg s），顯著高于自然攤放葉，V10最低，為0.0739 μmol/（gg s），之后略有升高，但均顯著低于自然攤放葉；APX（圖3B）、DHAR（圖3C）、GR（圖3F）隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，活力呈先升后降趨勢(shì)，APX、GR活力在處理10 min時(shí)達(dá)到峰值，分別為0.8259、0.0051 μmol/（gg s），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），之后顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）；DHAR活力在處理15 min時(shí)達(dá)到最高值（0.0144 μmol/（gg s）），顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），但處理30 min時(shí)顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）；振動(dòng)力脅迫青葉CAT活力呈降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，V10達(dá)到另一峰值（0.0600 μmol/（gg s）），V10、V15顯著高于自然攤放葉（P＜0.05），V30顯著低于自然攤放葉（P＜0.05）（圖3E）。說明萎凋后青葉在持續(xù)受到振動(dòng)力脅迫時(shí)，短時(shí)間（5～15 min）內(nèi)會(huì)通過提高抗氧化酶活性來抵御這種機(jī)械脅迫，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，青葉對(duì)這種脅迫逐漸適應(yīng)，相關(guān)酶活力又逐漸恢復(fù)到較低的水平。

圖3 振動(dòng)力脅迫對(duì)青葉電導(dǎo)率與抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of vibration stress on relative conductivity and antioxidant enzyme activities in tea leaves

本研究中APX、DHAR、GR活性隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，APX活性直接影響ASA的含量，其活性提高標(biāo)志著青葉清除活性氧能力增強(qiáng)，本研究結(jié)果與周子維等[29]研究搖青機(jī)械力使APX活性升高的結(jié)果一致。GR主要在NADPH作用下催化氧化型谷胱甘肽還原為GSH，GR活性提高能維持機(jī)械脅迫青葉中較高水平的GSH，有利于細(xì)胞保持氧化還原勢(shì)，有研究認(rèn)為GR活性提高與脅迫環(huán)境下植物茉莉酸的積累有關(guān)[30]。MDAR和DHAR是調(diào)控植物體內(nèi)ASA氧化還原態(tài)的關(guān)鍵酶，其活性提高有利于植物體內(nèi)ASA代謝清除過剩的活性氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷[31-32]。振動(dòng)力脅迫短時(shí)間（5 min）內(nèi)青葉CAT活性變化趨勢(shì)與西瓜遭受硼脅迫后CAT活性降低的趨勢(shì)相似[30]，因CAT對(duì)脅迫的響應(yīng)更加敏感，較長(zhǎng)時(shí)間（10～30 min）脅迫使其活性升高后再降低。振動(dòng)力脅迫短時(shí)間（5～15 min）內(nèi)青葉中ASA-GSH氧化還原途徑的重要酶活性總體高于自然攤放葉，表明青葉清除活性氧能力增強(qiáng)，振動(dòng)力脅迫短時(shí)間內(nèi)青葉通過提高M(jìn)DAR（5 min）和DHAR（5～15 min）活性以維持ASA再生，協(xié)同提高APX和CAT活性從而抵御機(jī)械脅迫產(chǎn)生的活性氧對(duì)葉細(xì)胞的損傷，這與前人研究發(fā)現(xiàn)烏龍茶機(jī)械搖青后，青葉抗氧化酶活性升高的結(jié)果[33]一致。

2.5 青葉亞顯微結(jié)構(gòu)變化

對(duì)30 min內(nèi)振動(dòng)力脅迫青葉進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果如圖4所示，各處理葉片細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)無明顯變化。能觀察到C0葉綠體、類囊體片層結(jié)構(gòu)，葉綠體緊貼細(xì)胞壁（圖4A），細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和液泡完整。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞間隙增大，尤其是V30細(xì)胞間隙明顯變大，且細(xì)胞排列發(fā)生紊亂。如圖4C所示，通過放大倍數(shù)觀察葉綠體變化，可以發(fā)現(xiàn)C0和C5的葉綠體片層結(jié)構(gòu)排列緊密而清晰，淀粉粒大而多，能觀察到嗜鋨顆粒（也稱脂質(zhì)球）。V5的葉綠體和淀粉粒移向細(xì)胞中央，淀粉粒數(shù)量明顯增加，葉綠體、類囊體緊密而清晰的片層結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)松散（圖4A）；之后淀粉粒數(shù)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，粒徑逐漸變小，葉綠體、類囊體逐漸收縮，緊密而清晰的層狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到破壞，開始松散、變形；V15的葉綠體外膜模糊不清，部分片層結(jié)構(gòu)模糊（圖4B），V30的葉綠體、類囊體嚴(yán)重收縮，部分片層結(jié)構(gòu)已經(jīng)瓦解，排列紊亂（圖4C）；V5、V15中嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增加，V15甚至出現(xiàn)聚集現(xiàn)象（圖4C），但V30的嗜鋨顆粒數(shù)量明顯減少，有的幾乎消失（圖4C）。

圖4 振動(dòng)力脅迫對(duì)青葉亞顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of vibrating stress on subcellular structure in tea leaves

植物葉片亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化與受脅迫程度關(guān)系密切，振動(dòng)力脅迫青葉細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)無明顯變化，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞間隙增大，在30 min時(shí)明顯變大，細(xì)胞排列發(fā)生紊亂。振動(dòng)力脅迫使淀粉粒數(shù)量先增后減，粒徑逐漸減小，嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增加，V15出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，V30中嗜鋨顆粒數(shù)量又明顯減少；葉綠體、類囊體緊密而清晰的片層結(jié)構(gòu)逐漸松散、變形、收縮、紊亂、瓦解。淀粉粒是植物中最普遍的碳水化合物貯藏物質(zhì)，有研究表明高鹽脅迫使植物細(xì)胞通過葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)量和體積的變化，從而緩解能量短缺，保證細(xì)胞正常的生命活動(dòng)[34]。綜上，短時(shí)間（5 min）振動(dòng)力脅迫使葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)量增加，以此緩解機(jī)械脅迫后的細(xì)胞能量短缺，提高葉片抗性，維持正常的生命活動(dòng)。嚴(yán)學(xué)成等[35]研究發(fā)現(xiàn)葉綠體結(jié)構(gòu)中含有較多嗜鋨顆粒的品種所制茶葉香氣更高，嗜鋨顆粒中含有大量類脂物質(zhì)，這是植物受到較重脅迫時(shí)類囊體降解以及脂質(zhì)聚集所致，其通常在衰老的葉綠體中大量產(chǎn)生。適度的振動(dòng)力脅迫（5～15 min）能夠促使青葉類囊體降解、葉綠體衰老以及降解產(chǎn)物脂質(zhì)聚集，從而導(dǎo)致綠體內(nèi)嗜鋨顆粒數(shù)量和體積明顯增加，這些結(jié)構(gòu)變化表明青葉細(xì)胞衰老加速，淀粉和嗜鋨顆粒的聚集為烏龍茶加工過程中以淀粉水解和脂類物質(zhì)降解為主的品質(zhì)形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。較長(zhǎng)時(shí)間（30 min）振動(dòng)力脅迫使葉綠體片層結(jié)構(gòu)紊亂，接近瓦解，這與武傳蘭[36]、吳凱[37]等研究鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果相似。結(jié)合葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化說明振動(dòng)力脅迫對(duì)采后青葉脅迫明顯，能夠加速青葉葉綠體結(jié)構(gòu)的瓦解和葉細(xì)胞衰老。

3 結(jié)論

振動(dòng)力脅迫30 min內(nèi)青葉水分含量與自然攤放葉和萎凋葉無顯著差異，60 min時(shí)顯著低于自然攤放葉和萎凋葉。隨著振動(dòng)力作用時(shí)間延長(zhǎng)，青臭氣變濃，清香減退。振動(dòng)力脅迫10 min后青葉相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于自然攤放葉，5 min和10 min時(shí)PS II Y（II）和ETR顯著低于自然攤放葉。隨著振動(dòng)力脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠體和類囊體緊密而清晰的片層結(jié)構(gòu)逐漸松散、變形、收縮、紊亂、瓦解，5 min時(shí)淀粉粒數(shù)量明顯增加，15 min時(shí)嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增多，并出現(xiàn)聚集。青葉抗氧化酶APX、DHAR、GR和MDAR活性在處理5～10 min總體高于自然攤放葉。振動(dòng)力脅迫作為烏龍茶加工過程中的一種搖青力形式，一定時(shí)間（30 min以內(nèi)）對(duì)青葉水分含量影響不顯著，但會(huì)造成青氣變濃，加劇青葉細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，使其透性提高，促進(jìn)膜內(nèi)可溶物滲出，使相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高，類囊體降解，葉綠體嚴(yán)重受損，青葉PS II系統(tǒng)被破壞，提高活性氧代謝酶活性從而抵御機(jī)械脅迫對(duì)葉細(xì)胞的損傷，為烏龍茶品質(zhì)形成的生化反應(yīng)提供條件。綜上，一定時(shí)間的振動(dòng)力脅迫（5～15 min）能夠?qū)觚埐璁a(chǎn)生較強(qiáng)的脅迫效應(yīng)，并啟動(dòng)抗氧化酶系以抵御振動(dòng)力脅迫帶來的傷害，加速青葉葉綠體結(jié)構(gòu)的瓦解和葉細(xì)胞衰老，為烏龍茶搖青工藝后的物質(zhì)代謝提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)可為生產(chǎn)上烏龍茶搖青時(shí)間的調(diào)控提供參考依據(jù)。