楊婷婷，楊 婧，袁子又，趙 瓊，楊 昆，黃艾祥

（云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

近年來，食品安全問題引起人們的廣泛關注，其中微生物污染可能會導致食源性疾病，威脅人體健康，因此預防和控制食品微生物污染尤為重要。乳品營養(yǎng)價值豐富，是人們的生活必需品，其中常見的致病菌有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[1]。乳扇是云南地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品，深受人們的喜愛，但目前乳扇主要以小型作坊和手工藝生產(chǎn)為主，易發(fā)生微生物污染，帶來食品安全問題。同時乳扇是高脂肪、高蛋白食品，貯存期短且容易因氧化變質出現(xiàn)發(fā)酸、哈喇味及表面霉變。目前市售乳扇多以真空包裝為主，此方法對乳扇保鮮具有一定效果，如肖夢林等[2]采用真空包裝、巴氏殺菌、涂抹保鮮劑處理乳扇，其中真空包裝的保鮮效果較好；肖蓉等[3]在制作乳扇的鮮乳中加入山梨酸鉀，并將乳扇成品真空包裝，此工藝可使乳扇保鮮期達到1 年。真空包裝雖然保鮮效果較好，但成本較高，因此，具有對人體無害、抗菌、綠色環(huán)保及延長食品貨架期等優(yōu)點的可食性抑菌膜成為了當今國內外研究的熱點[4]。目前，應用最多的天然高分子材料通常是蛋白質類、多糖類及復合類[5]。

與普通保鮮膜相比，天然保鮮膜具有可食、安全等優(yōu)點，具有很高的應用價值。殼聚糖是僅次于纖維素的第二大可再生多糖，屬于天然可再生資源[6-7]，具有抗菌性、生物相容性和無毒性等優(yōu)點，可用于研制食品包裝材料[8-9]，是研究和應用最廣泛的可食膜材料之一。此外殼聚糖常與海藻酸鈉、月桂酰精氨酸乙酯復配后用于食品（如番茄[10]、車厘子[11]等）保鮮。酪蛋白具有耐熱、可乳化、可食用等特點，因此其可用于制備食品包裝薄膜[12-13]。但由于酪蛋白自身的親水性及不具備抗菌性，其成膜后的性能有待提高。有研究表明，殼聚糖、酪蛋白復配使用可提高酪蛋白的溶解性及成膜性[14]?？咕氖歉叩日婧松镏邢忍烀庖呦到y(tǒng)的重要組成部分，一般含有100 個以下氨基酸殘基或有廣譜抑菌活性的小分子多肽，其有抗病毒、抗菌甚至抗癌細胞等多種活性功能[15-16]。在前期研究中，Zhao Qiong等[17]從檳榔江水牛奶酪蛋白中分離了新型抗菌肽BCp12，該肽序列為YLGYLEQLLRLK，分子質量為1508.82 Da，具有低毒性且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增多性李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌4 種食源性致病菌的生長均有抑制作用。此外，李鈺芳[18]、楊昆[19]等研究也發(fā)現(xiàn)BCp12能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。目前，將抗菌肽、殼聚糖與酪蛋白復配保鮮膜應用于乳扇保鮮的研究鮮有報道?；诖?，本實驗優(yōu)化BCp12/殼聚糖/酪蛋白復合膜制備工藝，研究其機械性能和抑菌效果，同時通過微觀結構、分子對接考察復合膜的相容性及活性位點，并將其應用于乳扇保鮮，為BCp12/殼聚糖/酪蛋白復合膜在食品保鮮方面的應用提供理論依據(jù)，同時促進抗菌肽在食品保鮮方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及病原菌

抗菌肽BCp12（純度＞95%） 安徽國平藥業(yè)有限公司合成。

金黃色葡萄球菌CICC 10384、大腸桿菌CICC 10003中國工業(yè)菌種保藏中心；乳扇 云南省大理州陶記乳扇；酪蛋白酸鈉 北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖（食品級） 河南雙騰實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

CR-400/410色彩色差儀 深圳大略電子儀器有限公司；HD-3A水分活度測定儀 廈門市弗布斯檢測設備有限公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國賽默飛世爾科技公司；FlexSEM 1000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立高新公司；Haloes Calipe抑菌圈測量儀 西班牙IUL公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜的制備

參考文獻[20]的方法，取3.0 g殼聚糖溶于1 mL質量分數(shù)1%冰乙酸溶液中，并加入質量分數(shù)1.5%甘油，磁力攪拌30 min后制成殼聚糖溶液。接著，配制質量分數(shù)2%酪蛋白酸鈉溶液磁力攪拌30 min使其溶解，然后加入殼聚糖溶液混勻并攪拌6 h得到酪蛋白/殼聚糖膜液，隨后加入質量分數(shù)1%的BCp12溶液，于40 ℃水浴加熱攪拌6 h，然后超聲脫氣30 min，即得到BCp12/殼聚糖/酪蛋白復合膜液，最后將膜液流延成膜，放入烘箱烘干備用。

1.3.2 單因素試驗

參照1.3.1節(jié)方法制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜，以酪蛋白/殼聚糖比例（質量比，下同）、甘油質量分數(shù)、干燥溫度為單因素，考察每個單因素對復合膜機械性能（復合膜拉伸強度和斷裂伸長率）的影響。分別按照1.3.1節(jié)方法配制20 mg/mL酪蛋白溶液和20 mg/mL殼聚糖溶液，研究不同的酪蛋白/殼聚糖比例（2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2）、甘油質量分數(shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）、干燥溫度（45、50、55、60 ℃和65 ℃）復合膜機械性能。測定每個單因素時，其他因素固定為酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5，甘油質量分數(shù)為1.5%，干燥溫度為55 ℃。

1.3.3 正交試驗設計

采用3因素3水平正交試驗確定酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜的最佳工藝，酪蛋白/殼聚糖比例為A因素、甘油質量分數(shù)為B因素、干燥溫度為C因素，按照正交試驗設計（表1）和1.3.1節(jié)方法制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜，并考察復合膜的機械性能。

1.3.4 復合膜機械性能測定

參照文獻[21]和GB/T 1040.3-2006《塑料 拉伸性能的測定 第3部分：薄塑和薄片的試驗條件》，利用質構儀測定復合膜機械性能。采用厚度測量儀在復合膜上取9 個點進行厚度測量，取平均值?？估瓘姸劝词剑?）計算，斷裂伸長率按式（2）的計算。

式中：F為復合膜斷裂時的最大張力/N；b為復合膜寬度/mm；d為復合膜厚度/mm。

式中：L1為復合膜斷裂時的伸長長度/mm；L0為復合膜的初始長度/mm。

1.3.5 不同質量濃度BCp12復合膜厚度的測定

根據(jù)1.3.3節(jié)優(yōu)化后的工藝采用不同質量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12制備酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜，復合膜厚度使用螺旋測微器測量，每個樣品任意選取5 個點，結果取平均值。選取1.0 mg/mL BCp12復合膜觀察微觀形態(tài)和FT-IR分析。

1.3.6 復合膜的微觀形態(tài)觀察

將殼聚糖膜、殼聚糖/BCp12及酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜膜液的凍干粉在金屬樣品臺上干燥，真空條件下噴金30 s后，將處理好的待測樣品于掃描電子顯微鏡下觀察，加速電壓7.00 kV。

1.3.7 復合膜的傅里葉變換紅外光譜分析

取BCp12、殼聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合物凍干后進行FT-IR分析，分辨率4 cm－1，掃描范圍400～4000 cm－1。

1.3.8 分子對接

使用AutoDock vina 1.1.2軟件通過分子對接法分析殼聚糖、酪蛋白和BCp12的結合方式[22]。從蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載酪蛋白、BCp12的晶體結構，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載殼聚糖的3D結構（SDF格式），用ChemBio3D Ultra 14.0軟件繪制殼聚糖、酪蛋白和BCp12的結構進行加氫處理。從蛋白質結構數(shù)據(jù)庫中得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白4 種蛋白的X射線晶體結構，保存為pdbqt格式。然后將酪蛋白、殼聚糖的小分子導入AutodockTools-1.5.6軟件包進行加氫處理并計算晶體結構和最低能量，其將設置成對接的相互作用位點，利用AutoDockTools 1.5.6軟件包生成對接輸入文件。挑選出結合能最低的復合物為最有利的結合方式，并采用Pymol 2.3.0軟件將對接結果可視化。

1.3.9 BCp12復合膜液及復合膜的抑菌實驗

參考文獻[23]的方法，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無菌生理鹽水稀釋至106個/mL備用。取0.15 mL菌液涂布在LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，然后用打孔器在每個平板的打5 個孔并編號1～5，每孔加入25 μL不同溶液或膜液：在1號孔（左上角）加入20 mg/mL酪蛋白溶液，在2號孔（右上角）加入酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質量分數(shù)1.5%的復合膜液，在3號孔（左下角）加入1.0 mg/mL BCp12/酪蛋白/殼聚糖膜液，在4號孔（右下角）加入20 mg/mL殼聚糖溶液，在5號孔（中心）加入無菌去離子水，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察不同膜液或溶液的抑菌效果并拍照。類似地，在打孔后的LB瓊脂板中每孔加入25 μL含不同質量濃度（0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的BCp12/殼聚糖/酪蛋白膜液；將1.3.5節(jié)制備的含不同質量濃度（0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的復合膜裁成直徑1 cm的圓形，貼在打孔后的LB瓊脂板上。將其置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，以不含BCp12的膜液和復合膜作為空白組，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，實驗設置3 個平行。觀察并統(tǒng)計抑菌圈的直徑，評價抗菌效果。

1.3.10 復合膜對乳扇的保鮮作用

1.3.10.1 乳扇的處理

將乳扇樣品在無菌條件下剪成6 cmh 1.5 cm的長方形（質量為1 g），覆蓋復合膜（邊長8 cm正方形）后分為對照組、1組（殼聚糖/酪蛋白復合膜）、2組（殼聚糖/酪蛋白復合膜＋1 mg/mL Nisin）、3組（殼聚糖/酪蛋白復合膜＋1 mg/mL BCp12）4 個組，對照組不做任何處理。將普通薄膜剪成邊長5 cm的正方形，將已覆有復合膜的乳扇用普通膜覆蓋避免污染，置于4 ℃冰箱貯藏60 d。

1.3.10.2 感官評定

挑選10位評價人員組成評定小組按照表2對不同貯藏時間（0、10、20、30、40、50、60 d）的乳扇色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)進行評分，最終結果取3 個項目的平均分。

表2 感官評定標準Table 2 Criteria for sensory assessment of milk fan

1.3.10.3 過氧化值的測定

參考GB 5009.227-2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》測定不同貯藏時間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的過氧化值。

1.3.10.4 色澤的測定

采用色彩色差儀測定各不同貯藏時間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的L*值（亮度）、b*值（黃度），每組隨機采點測定3 次，結果取平均值。

1.3.10.5 菌落總數(shù)的測定

參考GB 4789.21016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》測定不同貯藏時間（7、21、35、49、63 d）乳扇的菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Design-Expert 10軟件進行正交試驗結果分析，采用SPSS Statistics 26軟件進行Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜機械性能的單因素試驗結果

2.1.1 酪蛋白/殼聚糖比例對復合膜機械性能的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖含量的增加，復合膜的拉伸強度先增大后減小，當酪蛋白與殼聚糖的比例為1∶1時，拉伸強度達到最大值。殼聚糖上的游離氨基和羥基與酪蛋白分子之間存在氫鍵作用，當用磁力攪拌器充分混合時，二者可在分子水平上產(chǎn)生物理交聯(lián)，所以復合膜的強度較好[24-25]。酪蛋白與殼聚糖的比例為1∶1.5時斷裂伸長率最大，但隨殼聚糖比例的增加而降低。這可能是殼聚糖濃度過大，二者相容性變差，導致復合膜的拉伸強度和斷裂伸長率均下降。殼聚糖本身是親水分子會與其他成膜分子形成氫鍵作用力，親水效應增強。因此，后續(xù)實驗制備復合膜選擇酪蛋白/殼聚糖比例為1∶1.5。

圖1 酪蛋白/殼聚糖比例對復合膜拉伸強度（A）和斷裂伸長率（A）的影響Fig.1 Effect of casein/chitosan ratio on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.2 甘油質量分數(shù)對復合膜機械性能的影響

甘油可以作為增加復合膜相容性和可塑性的增塑劑，對提高其力學性能有重要影響[26]。如圖2所示，隨著甘油質量分數(shù)增大，拉伸強度呈下降趨勢，而斷裂伸長率呈上升趨勢。拉伸強度下降是由于甘油過多進入膜分子內部，破壞了原來的分子結構，增大了分子鏈的間隙，導致膜分子致密性下降。而甘油可使酪蛋白和殼聚糖分子之間產(chǎn)生氫鍵作用并軟化高聚物的剛性結構，使得高聚物鏈段的流動性增加，斷裂伸長率增加。這與張一妹[27]和曾麗萍等[28]的研究結果一致。此外，甘油分子在基材中不易揮發(fā)，甘油過多會使復合膜表面的甘油溢出，影響感官品質。甘油本身為親水物質，易進入分子內部與成膜分子間形成新的氫鍵結構，進一步使膜的流動性和保水性增加[29]。因此，后續(xù)實驗制備復合膜選擇甘油質量分數(shù)為1.5%。

圖2 甘油質量分數(shù)對復合膜拉伸強度（A）和斷裂伸長率（B）的影響Fig.2 Effect of glycerol concentration on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.3 干燥溫度對復合膜機械性能的影響

從圖3可以看出，拉伸強度和斷裂伸長率隨著干燥溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，拉伸強度受溫度影響較明顯，斷裂伸長率在55 ℃以下變化緩慢，干燥溫度高于55 ℃時迅速下降。當干燥溫度上升時，溶劑蒸發(fā)留下的孔穴過多，造成復合膜的結構缺陷和裂縫，故其拉伸強度和斷裂伸長率差，而低溫條件下形成的復合膜結構更致密、性能較好，該結果與方健[30]的研究結果相似。在此溫度下，水分蒸發(fā)速率較適中，殼聚糖分子在膜基質形成過程中可以有序排列，致密性較高，持水性也較好[25]。因此，后續(xù)實驗制備復合膜選擇55 ℃為最佳干燥溫度。

圖3 干燥溫度對復合膜拉伸強度（A）和斷裂伸長率（B）的影響Fig.3 Effect of drying temperature on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.2 酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜機械性能的正交試驗優(yōu)化結果

如表3所示，通過極差分析可知，以拉伸強度為考察指標，影響復合膜機械性能的主次順序為C＞A＞B，即干燥溫度對復合膜的拉伸強度影響最大，甘油質量分數(shù)影響最小。以斷裂伸長率為考察指標，影響復合膜機械性能的主次順序為A＞C＞B，即酪蛋白/殼聚糖比例對復合膜的斷裂伸長率影響最大，甘油質量分數(shù)影響最小。9 個正交試驗條件中的最佳工藝組合為A2B1C2，由極差分析得到的最佳工藝組合為A2B3C2和A1B1C2。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

由R值可知，拉伸強度中C干燥溫度的影響更為顯著，因此選擇拉伸強度中C因素的較優(yōu)水平為55 ℃；斷裂伸長率指標中A的影響最顯著，因此選擇斷裂伸長率中A因素的較優(yōu)水平為1∶1.5。正交試驗方差分析結果如表4、5所示，通過F值可知，各因素對復合膜機械性能的影響順序為酪蛋白/殼聚糖比例＞干燥溫度＞甘油質量分數(shù)，即酪蛋白/殼聚糖比例對復合膜機械性能的影響最大，甘油質量分數(shù)影響最小。綜合考慮得出最優(yōu)成膜工藝為A2B2C2，即酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質量分數(shù)1.5%、干燥溫度55 ℃，以此條件制備的復合膜拉伸強度為（14.86f 0.35）MPa、斷裂伸長率為（142.25f 0.11）%，以此工藝進行后續(xù)實驗中復合膜的制備。

表4 拉伸強度方差分析結果Table 4 Analysis of variance for tensile strength

表5 斷裂伸長率方差分析結果Table 5 Analysis of variance for elongation at break

2.3 不同質量濃度BCp12復合膜的厚度

由圖4可知，酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜厚度隨BCp12質量濃度的增加而增加，其范圍為12～54 μm。這可能是由于提高抗菌肽質量濃度加強了分子間的緊密連接。BCp12質量濃度越高，膜液中固形物含量越多，復合膜的結構越緊密，成膜厚度逐漸增加。因此，復合膜的機械性能隨BCp12質量濃度增大而逐漸增大。后續(xù)實驗制備復合膜選擇抗菌肽質量濃度為1.0 mg/mL。

圖4 抗菌肽BCp12質量濃度對復合膜厚度的影響Fig.4 Effect of antimicrobial peptide BCp12 concentration on thickness of casein-chitosan composite films

2.4 SEM觀察結果

復合膜的抗拉強度、斷裂伸長率和水蒸氣透過系數(shù)是由組成膜的大分子決定的。這些大分子成膜時是否均勻或完全溶解將直接影響可食膜的性質。由圖5A可知，殼聚糖膜表面光滑致密平整，表明膜內部結構均勻，這與曾少甫等[31]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜表面質地光滑和結構緊湊的結果一致。加入抗菌肽BCp12后，殼聚糖膜表面開始出現(xiàn)孔隙（圖5B），這可能是由于BCp12進入殼聚糖內部，冷凍干燥成膜粉后生成的小孔。由圖5C可見蛋白質顆粒且表面較粗糙，膜中出現(xiàn)孔隙和區(qū)塊的現(xiàn)象，說明BCp12可能負載在復合膜上[32]。結合抗拉強度和斷裂伸長率分析結果可知，添加抗菌肽可能會使復合膜內部出現(xiàn)孔隙[33]，導致復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率下降。本實驗結果與Mohajer等[34]的研究結果類似，說明BCp12可與酪蛋白、殼聚糖混合使用，3 種物質具有良好的相容性。主要是由于分子鏈間形成氫鍵相互作用，一定程度上增加了水分子的透過性并形成了致密的網(wǎng)絡結構[35]。

2.5 FT-IR分析結果

由圖6A、B可知，BCp12在1656.86 cm－1處特征吸收峰對應酰胺I帶C＝O伸縮振動，1440.60 cm－1處特征吸收對應酰胺II帶，1314.96 cm－1處特征吸收峰對應酰胺III帶，1182.63 cm－1處特征吸收峰對應C-O伸縮振動；而殼聚糖/BCp12在1630.05 cm－1處的吸收峰對應酰胺I帶C＝O的伸縮振動，1455.10 cm－1處特征吸收峰對應酰胺II帶，1320.93 cm－1處特征吸收峰對應酰胺III帶，1157.75 cm－1處特征吸收峰對應C-O伸縮振動[36]。根據(jù)沈亞麗[37]的研究，殼聚糖在1436 cm－1處特征吸收峰對應O-H和N-H的伸縮振動，1642 cm－1處特征吸收峰對應酰胺I帶C＝O的伸縮振動。而殼聚糖/BCp12的FT-IR圖中缺少了1602 cm－1附近的特征吸收峰，使其峰面積變寬并向低波數(shù)移動，說明殼聚糖/BCp12內存在氫鍵作用。

由圖6C、D可知，酪蛋白/BCp12在1642.15 cm－1處吸收峰對應的是酰胺I帶C＝O的伸縮振動，1446.56 cm－1處吸收峰對應酰胺II帶，1314.63 cm－1處吸收峰對應酰胺III帶，1172.06 cm－1處吸收峰對應C-O伸縮振動。根據(jù)沈亞麗[37]的研究，殼聚糖在N-H彎曲振動吸收峰為1602 cm－1，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復合膜的吸收峰為1545.67 cm－1，由于膜內的氨基發(fā)生質子化，形成了NH，說明添加BCp12使該吸收峰向低波數(shù)方向移動。酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合物中C-O伸縮振動峰向低波數(shù)方向移動且峰強度提升，這是由于基團間形成了氫鍵，使伸縮振動向低波數(shù)移動。Huang Guoqing等[38]利用FT-IR研究大豆分離蛋白和殼聚糖復合使用也得到類似的結論。

圖6 BCp12、殼聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/殼聚糖/BCp12復合膜的FT-IRFig.6 FT-IR spectra of BCp12,BCp12/chitosan,BCp12/casein and BCp12/chitosan/casein composite films

與BCp12/酪蛋白膜相比，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復合膜的特征峰幾乎均向低波數(shù)偏移，但未超過BCp12/殼聚糖的特征峰波數(shù)。研究表明，若兩種水性高分子相容性較好，分子間氫鍵相互作用會加強，表現(xiàn)為羧基振動峰向低波數(shù)方向偏移[39]，形成分子內氫鍵會使吸收強度增加并變寬。因此，可得到BCp12/酪蛋白/殼聚糖復合膜內部存在較強的氫鍵作用，膜成分中會引入更多親水性基團，使之具有良好的相容性且保水性和吸水性增強，這與張立挺等[40]的研究結果類似。

2.6 分子對接結果

分子對接在結構分子生物學研究中有著廣泛的應用，通過計算機模擬等方法可以預測主要蛋白與活性物質間的結合位點及作用方式[41]。由圖7可知，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白均能較好地對接于BCp12的活性中心位點，其中，CSN1S1酪蛋白的殘基Q112、Y109、K118與BCp12的殘基Y1、Y4、Q7、K12之間通過—NH2、—C＝O、—OH形成5 個氫鍵，最低結合能為－26.4 kJ/mol。與CSN1S1酪蛋白相比，CSN1S2酪蛋白的殘基E66、A62與BCp12的殘基L2、G3、Y4之間存在3 個氫鍵且長度為3.0 ?。并且CSN2酪蛋白的殘基Q138、K128與BCp12殘基的L8、L9之間存在2 個氫鍵且結合能為－127.6 kJ/mol。而CSN3酪蛋白殘基的G20、P115與BCp12殘基的Y1、Y4之間存在2 個氫鍵且結合能為－94.5 kJ/mol。表明4 種酪蛋白殘基均能與BCp12殘基形成氫鍵相互作用，在分子的吸引中起重要作用，并且容易引起成膜分子間的聚集，使膜中引入更多親水性氨基酸殘基，膜的吸水性增強[42]。有研究表明抗菌肽HHRRFSLY可殺死大腸桿菌、破壞細胞膜和蛋白構象，這可能與細胞的外膜選擇性滲透有關[43]。因此，可以推測BCp12的殘基Y4和酪蛋白之間通過—NH2形成氫鍵作用引起復合膜成分的聚集，使其具有低結合能、結構穩(wěn)定性、保水性和抗菌性。

圖7 CSN1S1酪蛋白-殼聚糖（A）、CSN1S2酪蛋白-殼聚糖（B）、CSN2酪蛋白-殼聚糖（C）和CSN3-酪蛋白-殼聚糖（D）的分子對接結果Fig.7 Molecular docking diagrams of CSN1S1 casein-chitosan (A),CSN1S2 casein-chitosan (B),CSN2-casein-chitosan (C) and CSN3-casein-chitosan (D)

2.7 不同質量濃度BCp12復合膜液及復合膜的抑菌效果

不同質量濃度的BCp12復合膜液及復合膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果如圖8和表6、7所示。由表6和表7可知，BCp12質量濃度對金黃色葡萄球菌抑菌性影響較大，對大腸桿菌影響較小。隨著BCp12質量濃度的增加，復合膜液及復合膜的抑菌圈逐漸增大。BCp12質量濃度為1.0 mg/mL的復合膜液及復合膜對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，且對2 種菌的抑菌性差異顯著（P＜0.05）。當BCp12質量濃度為1.0 mg/mL時，復合膜液和復合膜對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（8.10f 0.06）mm和（7.21f 0.03）mm，且抑菌效果最好（P＜0.05），而大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（7.05f 0.01）mm和（6.04f 0.06）mm。這與趙瓊等[44]用MIC法研究BCp12對2 種致病菌的抑制效果基本一致。董晶等[45]研究抗菌肽-殼聚糖復合抗菌膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌，與本實驗結果一致。同一條件下，BCp12復合膜液和復合膜對2 種菌的抑菌效果不一致，結果表明復合膜液的抑菌效果更佳，可能是由于膜液中BCp12與酪蛋白、殼聚糖大分子之間具有較好的相容性。實際生產(chǎn)中乳扇的食源性致病菌中金黃色葡萄球菌較多，故選取1.0 mg/mL BCp12復合膜分析其對乳扇的保鮮作用。

表6 不同質量濃度的BCp12復合膜液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果Table 6 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

表7 不同質量濃度的BCp12復合膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果Table 7 Antimicrobial effect of composite films with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

圖8 各組復合膜液對金黃色葡萄球菌（A）和大腸桿菌（B）的抑菌效果Fig.8 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions on Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

2.8 復合膜對乳扇的保鮮效果

2.8.1 感官評價

各組乳扇的感官得分在貯藏期內都有所下降，其中對照組的感官得分下降較快（圖9）。這可能是4 ℃下不能完全抑制微生物生長，且微生物分解的速率足以使乳扇品質下降。1組、2組和3組貯藏60 d的感官得分差異較小，較貯藏初期明顯下降，這是由于乳扇自身的乳酸菌生長代謝、蛋白和脂肪降解使乳扇的酸味、腐敗味及酒味加重。根據(jù)Pinho等[46]對干酪風味的研究結果，干酪的風味強度隨貯藏時間延長而增加。根據(jù)對Gouda干酪貯藏研究結果[47]推測蛋白質和脂肪的降解使乳扇微觀結構中的孔隙增大和持水性下降，將導致乳扇質地變硬。同時，1、2、3組的保鮮效果更好，其可能是殼聚糖、酪蛋白、Nisin和BCp12復合膜可以抑制微生物的生長及蛋白和脂肪的分解，從而延長乳扇的貨架期。

圖9 乳扇貯藏期間的感官評價雷達圖Fig.9 Sensory evaluation radar chart of milk fan during storage

2.8.2 過氧化值的變化

從圖10 可知，對照組在第20 天時過氧化值為1.61 mmol/kg，BCp12組在第40天時過氧化值為1.68 mmol/kg，上升趨勢比較緩慢。BCp12組在60 d內過氧化值變化不明顯，說明BCp12起到較好的抗氧化作用。隨著貯藏時間延長，乳扇中過氧化值逐漸增加，產(chǎn)生令人不悅的氣味，其中對照組的過氧化值均高于實驗組。這與蘇科巧等[48]研究結果類似，與對照組相比，實驗組乳扇氧化程度較慢，表明不同復合膜具有一定的抗氧化作用。

圖10 乳扇貯藏期間過氧化值的變化Fig.10 Variation in peroxide value during storage of milk fan

2.8.3 色澤的變化

由圖11可知，4 個處理組的L*值均隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，這是由于脂肪被分解產(chǎn)生游離脂肪酸，蛋白質在酶和微生物的作用下產(chǎn)生氨基酸和小分子肽，與高鵬飛[49]的研究結果一致，由于這些油脂蛋白成分的變化會影響光的反射，從而使L*值不斷降低。貯藏期間b*值逐漸升高，可能是由于蛋白質變得松軟和坍塌，從而使松散的蛋白骨架無法包埋游離脂肪導致脂肪析出，這與田洋等[50]的研究結果一致，乳扇中的蛋白質和脂肪在微生物和內源酶的作用下發(fā)生降解，b*值增加。由此可知，BCp12能抑制乳扇中微生物生長并降低蛋白質水解及油脂析出，使乳扇保持一定的亮度和黃度。

圖11 乳扇貯藏期間色差L*和b*值的變化Fig.11 Changes in color parameters during storage of milk fan

2.8.4 菌落總數(shù)的變化

如表8所示，對照組在前49 d內菌落總數(shù)上升，而后呈下降趨勢，可能是乳扇中酵母菌或乳酸菌大量產(chǎn)酸使pH值下降，不耐酸的細菌大量死亡而造成的。1組、2組和3組都含有殼聚糖且具有抑菌活性，能通過阻止營養(yǎng)物質進入細菌體內或穿過細菌表面進入細胞內部，使細胞正常的代謝活動紊亂，從而抑制細菌生長。2組和3組乳扇貯藏期間菌落總數(shù)較1組和對照組少（P＜0.05），說明添加BCp12和Nisin能有效抑制微生物繁殖，從而達到較好的抑菌效果。

表8 乳扇貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Table 8 Changes in total bacterial count in milk fan during storage

3 結論

本實驗通過正交試驗確定了復合膜的最佳工藝：酪蛋白/殼聚糖比例1∶1.5、甘油質量分數(shù)1.5%、干燥溫度55 ℃；抑菌性方面，添加BCp12可顯著提高其抑菌效果，當抗菌肽質量濃度為1.0 mg/mL時，復合膜液和復合膜的金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（8.10f 0.06）、（7.05f 0.01）mm，大腸桿菌抑菌圈直徑分別為（7.21f 0.03）、（6.04f 0.06）mm，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳；微觀結構上，SEM和FT-IR結果表明復合膜有較好的相容性且未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，分子對接結果表明BCp12的殘基Y4與酪蛋白、殼聚糖之間存在較強的氫鍵作用，酪蛋白、殼聚糖、BCp12之間會引入更多親水基團，使膜的保水性和持水性增加；將復合膜應用于乳扇保鮮，結果表明BCp12復合膜保鮮乳扇相較于對照組過氧化值變化較慢，說明BCp12膜的抗氧化效果較好，經(jīng)4 ℃貯藏后保質期可達60 d，且復合膜對乳扇貯藏期間微生物的生長繁殖具有抑制作用。綜上，將BCp12復合膜用于乳扇保鮮能延長乳扇保質期，這一研究結果可為復合膜用于乳扇保鮮技術的研究提供理論依據(jù)。