錢洋偉，舒 幻，方宇鐿，沈奇英

(杭州師范大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311121)

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種全身性的自身免疫性疾病，具有病因不明、持續(xù)反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)[1-3]，嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)和生活質(zhì)量.RA高發(fā)于30～50歲，全球發(fā)病率為1%，我國(guó)發(fā)病率約3%～5%[4-5].目前臨床上治療RA以藥物治療為主，在降低全身及局部炎癥水平、緩解癥狀、延緩疾病進(jìn)展等方面取得了一定效果，但仍有患者無應(yīng)答，或因發(fā)生不良反應(yīng)而不能應(yīng)用[6].

枸櫞酸托法替尼(tofacitinib citrate，TOF)適用于中至重度的活動(dòng)性RA患者[7].目前TOF的上市劑型為片劑，缺乏病變部位的特異性靶向作用，導(dǎo)致用藥后往往出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、上呼吸道感染等不良反應(yīng)，因而有必要改變其劑型以彌補(bǔ)以上缺點(diǎn).脂質(zhì)體制備方法簡(jiǎn)單，生物相容性好.因此，我們將TOF制成脂質(zhì)體，一方面解決了TOF口服帶來的不良反應(yīng)，另一方面提高了TOF靶向RA病變部位的能力，有利于RA的藥物靶向治療.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枸櫞酸托法替尼(上海博氏醫(yī)藥科技有限公司)，磷脂(Lipoid GMBH)，膽固醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)液(杭州啟真湖生物科技有限公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，弗氏完全佐劑(Sigma)，噻唑藍(lán)溴化四唑(阿拉丁).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞容生化儀器廠)，Anton paar litesizer 500型Zeta電位粒徑分析儀(奧地利安東帕中國(guó)有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biotek Instruments，美國(guó)伯騰儀器有限公司北京代表處)，透射電子顯微鏡TEM (JEM2100,日本電子株式會(huì)社)，高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography，HPLC).

2 TOF脂質(zhì)體的工藝研究與評(píng)價(jià)

2.1 TOF脂質(zhì)體的工藝研究

HPLC色譜條件：色譜柱為Technologies, Diamonsil(鉆石) C18(200 mm × 4.6 mm,5μm)柱；流動(dòng)相為乙腈-水(體積比為30∶70)；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL.

選用pH梯度法制備載藥脂質(zhì)體.首先采用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體，在茄形瓶中放置一定比例的卵磷脂和膽固醇，加入適量無水乙醇溶解，經(jīng)旋蒸形成薄膜，加入pH3.5檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液水化，冰浴下探頭超聲20 min(600 W，工作3 s/間隔3 s)，得到空白脂質(zhì)體.然后用Na2CO3溶液調(diào)至一定pH后加入TOF溶液，于60 ℃水浴中孵育10 min，得到TOF脂質(zhì)體(TOFL).

在單因素的基礎(chǔ)下，探究藥脂比、膜材比、外水相pH對(duì)TOFL的包封率的影響，采用HPLC法測(cè)定藥物峰面積，從而篩選優(yōu)勢(shì)處方.包封率與載藥量計(jì)算公式如下：

其中A超濾前：超濾前超濾管內(nèi)管液體的峰面積；A超濾后：超濾后濾下的液體的峰面積.

2.2 TOF脂質(zhì)體的評(píng)價(jià)

2.2.1 粒徑分布及其電位、電鏡

按優(yōu)勢(shì)處方制備TOFL，使用電位粒徑分析儀測(cè)定其粒徑、多分散性指數(shù)和Zeta電位；取少量脂質(zhì)體滴于覆有碳膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干后，再用醋酸雙氧鈾負(fù)染30 s，自然晾干后于透射電鏡下觀察其形貌特征.

2.2.2 體外釋放

根據(jù)優(yōu)勢(shì)處方制備TOFL，采用透析袋法評(píng)價(jià)該脂質(zhì)體的體外釋藥性能.釋放條件：釋放介質(zhì)pH7.4 和pH5.5的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，溫度(37±0.5) ℃，速度100 r/min.在預(yù)定時(shí)間取樣，取樣量為1 mL，每次取樣后補(bǔ)充等量新鮮釋放介質(zhì)，樣品離心后取上清進(jìn)樣,采用HPLC法測(cè)定，并記錄峰面積(A)，計(jì)算實(shí)際濃度(C)，計(jì)算累計(jì)釋放百分率.

2.2.3 細(xì)胞活性評(píng)價(jià)

巨噬細(xì)胞(RAW264.7)培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含青霉素、鏈霉素質(zhì)量濃度各為0.1 mg/mL)，孵育條件為37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2.

采用四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性[8].將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以5 000每孔的密度接種于96孔板上，孵育過夜貼壁，不同濃度空白脂質(zhì)體處理48 h后，于各孔內(nèi)加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT 33 μL并放置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后倒出孔內(nèi)液體，每孔內(nèi)分別加入200 μL 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，采用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量各孔吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率.

2.2.4 RA部位初步靶向性考察

為了較直觀地觀察脂質(zhì)體在RA小鼠關(guān)節(jié)部位的分布情況，選用整體器官熒光成像方法進(jìn)行評(píng)價(jià).以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將0.1 mL弗氏完全佐劑皮下注射至小鼠右后爪中，構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型[9].以近紅外熒光染料吲哚菁綠(Indocyanine green, ICG)替代TOF制備脂質(zhì)體，設(shè)立游離ICG和ICG脂質(zhì)體組，經(jīng)尾靜脈注射6 h后處死(ICG劑量為1 mg/kg)，收集其關(guān)節(jié)，比較不同制劑給藥后關(guān)節(jié)處的熒光強(qiáng)度.

2.2.5 小鼠體內(nèi)初步藥效學(xué)評(píng)價(jià)

將15只RA小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，設(shè)立PBS組、游離TOF組、TOFL組，經(jīng)小鼠尾靜脈注射給藥(TOF劑量為1.8mg/kg)，每2天給藥1次，連續(xù)給藥7次，并以正常組為對(duì)照.治療結(jié)束后，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組后爪足掌的厚度，評(píng)估其腫脹程度，以初步評(píng)價(jià)治療效果.

3 結(jié)果

3.1 膜材比對(duì)包封率的影響

圖1 膜材比對(duì)包封率的影響Fig.1 The effect of membrane material ratio on EE

膜材比(卵磷脂∶膽固醇)對(duì)包封率影響如圖1所示，由圖可知，當(dāng)膜材比為1∶1和2∶1時(shí)包封率相對(duì)較高，達(dá)到50%以上，膜材比為2∶1時(shí)的載藥量比1∶1時(shí)高，且膜材比1∶1時(shí)旋蒸成膜后極難振蕩脫落，細(xì)胞粉碎機(jī)超聲脂質(zhì)體幾乎沒有乳光，且外觀形態(tài)較差，所以選擇卵磷脂∶膽固醇比為2∶1作為最優(yōu)膜材比.

3.2 外水相pH對(duì)包封率的影響

外水相對(duì)包封率的影響結(jié)果見圖2，由圖可看出，在外水相pH為8時(shí)有較高包封率達(dá)到75.78%.所以選擇外水相pH為8作為最優(yōu)外水相pH.

圖2 外水相pH對(duì)托法替尼脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 The effect of exterior pH on EE of TOFL

圖3 藥脂比對(duì)包封率的影響Fig.3 The effect of drug to lipid ratio on EE

3.3 藥脂比對(duì)包封率的影響

藥脂比對(duì)包封率影響結(jié)果如圖3所示，可見在TOF∶SPC比例為4∶100時(shí)有較高包封率達(dá)到88.40%，所以選擇藥脂比為4∶100作為最優(yōu)藥脂比.

綜上所述，我們得出的最優(yōu)條件為：脂質(zhì)體的內(nèi)水相為檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液(pH3.5)時(shí),藥物與磷脂的質(zhì)量比為4∶100，膽固醇與磷脂質(zhì)量比為1∶2，外水相用Na2CO3最終調(diào)至pH8.0.

3.4 粒徑分布電位、電鏡

脂質(zhì)體粒徑分布圖及透射電子顯微鏡下的結(jié)果見圖4.由粒徑分布圖(圖4A)可知，TOF脂質(zhì)體的平均粒徑56 nm，多分散指數(shù)20.1%，說明脂質(zhì)體粒徑分布均勻.由透射電鏡圖4B可見TOF脂質(zhì)體粒徑50 nm左右，外觀接近球形，分布較為均勻，與粒徑分布結(jié)果相吻合.

圖4 托法替尼脂質(zhì)體的粒徑分布圖(A)及電鏡圖(B)Fig.4 (A) The size distribution and (B) TEM of TOFL

3.5 體外釋放

TOF的累積釋放百分率如圖5所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，托法替尼在pH5.5PBS中釋放速度較快，可見TOF脂質(zhì)體更傾向于在較低pH值下釋藥.TOF脂質(zhì)體在生理?xiàng)l件下顯示出一定的緩釋效果，有利于其在體循環(huán)中保持相對(duì)穩(wěn)定，靶向至弱酸性的RA部位再釋藥.

圖5 托法替尼脂質(zhì)體在pH7.4和pH5.5磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率Fig.5 Cumulative percentage of TOFL released in PBS pH7.4 and pH5.5

圖6 不同濃度空白脂質(zhì)體對(duì)RAW264.7細(xì)胞作用48 h后的細(xì)胞活性Fig.6 Cell activity of RAW264.7 treated with different concentrations of blank liposomes for 48 h

3.6 細(xì)胞活性評(píng)價(jià)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，由結(jié)果可知，空白脂質(zhì)體在質(zhì)量濃度不超過500 μg/mL條件下，細(xì)胞活性接近90%，說明空白脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞活性基本無影響，毒性小，有利于利用其來載藥.

3.7 RA部位初步靶向性考察

圖7 RA小鼠分別注射游離吲哚菁綠、吲哚菁綠脂質(zhì)體6 h離體關(guān)節(jié)熒光分布圖片F(xiàn)ig.7 Fluorescence distribution of isolated joints of RA mice 6 h after injection of ICG or ICGL

采用整體器官熒光成像方法初步考察游離ICG(Free ICG)和ICG脂質(zhì)體(ICGL)在RA部位的靶向分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，在給藥6 h時(shí)，與Free ICG比較，ICGL組小鼠RA關(guān)節(jié)部位的熒光信號(hào)更強(qiáng)，說明經(jīng)脂質(zhì)體載藥后可以增加藥物在RA部位的富集，有利于RA的藥物靶向治療.

3.8 小鼠體內(nèi)初步藥效學(xué)評(píng)價(jià)

治療結(jié)束后，各組小鼠足掌厚度情況如圖8所示.由圖8可知，與正常組相比，PBS模型組的足掌厚度顯著增加；與PBS模型組相比，經(jīng)Free TOF和TOFL治療后小鼠的足掌厚度有不同程度減少，尤其是TOFL組的減少程度更明顯.這可能是TOFL被動(dòng)靶向至RA部位后，在炎性關(guān)節(jié)部位釋放TOF實(shí)現(xiàn)其靶向治療，因此顯示出比Free TOF更好的緩解足掌腫脹的效果.

圖8 治療結(jié)束后各組小鼠的足掌厚度(**P<0.01,*P<0.05)Fig.8 Paw thickness of mice in each group after treatment

4 討論

RA引起關(guān)節(jié)腫脹、多關(guān)節(jié)受累、關(guān)節(jié)畸形以及關(guān)節(jié)周圍和全身的骨質(zhì)疏松等病狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)能力.RA發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，世界衛(wèi)生組織將RA列為疑難癥之一.目前臨床上RA治療的藥物有改變病情藥、糖皮質(zhì)激素和非甾體抗炎藥，主要用于控制RA的進(jìn)展[10].與傳統(tǒng)抗RA藥物相比，TOF不僅能夠緩解癥狀，還能緩解或直接停止RA的損害.但是，口服TOF治療RA的患者大多出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)，易引起上呼吸道感染等不良反應(yīng)，因而有必要改變其劑型以彌補(bǔ)以上缺點(diǎn).基于納米技術(shù)和醫(yī)學(xué)交叉研究的納米醫(yī)學(xué)近年來迅猛發(fā)展，為重大疾病的診療提供了新的機(jī)遇[11].研究表明，納米微粒在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷、預(yù)防及治療等方面具有一定優(yōu)勢(shì)[12].類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生部位具有類似腫瘤血管的EPR效應(yīng)，且血管新生伴隨著RA的整個(gè)病程[12-13].這些病理特征為納米微粒系統(tǒng)被動(dòng)靶向RA病變部位提供了可能性.用于藥物遞送的納米載體種類繁多，其中脂質(zhì)體是納米制劑中一種常用載體，自萊門等人[14]在1971年開始將脂質(zhì)體用作藥物載體以來，該載體系統(tǒng)得到了廣泛的研究與應(yīng)用.

實(shí)驗(yàn)采用pH梯度法制備TOF脂質(zhì)體，并采用單因素法篩選出TOF脂質(zhì)體的優(yōu)勢(shì)處方.體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，TOF脂質(zhì)體在pH7.4 PBS釋放介質(zhì)中具有一定的緩釋作用，有利于將藥物遞送至RA部位再釋放藥物.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)可看出，空白脂質(zhì)體在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性幾乎沒有影響，有利于作為載體進(jìn)行給藥.由整體器官熒光成像結(jié)果可知，ICG脂質(zhì)體組小鼠RA部位的熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于游離ICG組，說明脂質(zhì)體可以增加藥物在RA部位的富集.初步藥效研究表明，與Free TOF相比，TOFL減少足掌厚度的能力更強(qiáng)，可能是TOFL具有靶向治療RA的作用，因此顯示出更好的抗RA效果.綜上所述，優(yōu)勢(shì)處方制得的TOFL能較好減輕RA小鼠的足掌腫脹程度.