彭會巧 郝曉曉 吳亞靚 繆鋆鋆

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是引起終末期腎病的原因之一,其也是糖尿病中最嚴重的微血管并發(fā)癥。此外,大約50%DN 患者會發(fā)展成終末期腎病［1］。糖尿病患者中,DN 的發(fā)生率30%～40%［2］。除此以外,大約70%的有慢性腎臟病(CKD)臨床表現(xiàn)的1、2 型糖尿病患者都將進展為DN［3］。DN 的病理特征是腎小球系膜增寬、分裂,出現(xiàn)K-W 結節(jié)［4］。DN 臨床表現(xiàn)的早期特點主要是微量白蛋白尿(30～300 mg/L)直至大量蛋白尿(>300 mg/L)。其過程包括以下5 個步驟：初始高腎小球濾過率和腎肥大,運動后出現(xiàn)的微量白蛋白尿,持續(xù)性蛋白尿,腎功能減退,腎功能衰竭。DN 的發(fā)病是很難發(fā)現(xiàn)的,臨床中一旦出現(xiàn)持續(xù)的顯性蛋白尿,將不可逆轉DN 病程的進展,其終末期腎病的進展率是其他腎臟疾病的14 倍左右。

在過去的幾年中,糖尿病的患病率迅速增加,糖尿病引起的CKD 已經(jīng)超過了腎小球腎炎引起的,成為中國城市患者CKD 的主要原因［5］。我國DN 患者數(shù)量眾多,DN 引起的社會經(jīng)濟負擔逐年加重。但由于DN 的發(fā)病機理相對其他疾病來說較為復雜,因此,臨床及科研中將探索DN 的發(fā)病機理,以期能找到更有效的防治DN 的措施作為研究的重點。近年來,人們對DN 的發(fā)病機制有了新的發(fā)現(xiàn)。結合新的發(fā)展要求,從非遺傳因素方面系統(tǒng)地回顧了DN 的發(fā)病機制,如免疫炎癥、上皮間質轉化、凋亡和線粒體損傷、表觀遺傳學、細胞-內皮通信等。本文就表觀遺傳學機制在DN 發(fā)生發(fā)展中的作用進行綜述。

1 表觀遺傳的主要分子機制

1.1DNA 的甲基化 由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體,DNA 甲基化轉移酶進一步作用在SAM 上,甲胞嘧啶最終轉化成為5-甲基胞嘧啶,從而進行遺傳基因的修飾卻未改變DNA 的序列。許多動物、植物、真菌基因組都被DNA 胞嘧啶的甲基化所標記。通過掌握其位于基因組中的位置可以得知這個表觀遺傳標記的生物學作用。目前新技術使得大規(guī)模繪制 DNA 甲基化模式變得更加容易,不僅啟動子甲基化在發(fā)育過程中經(jīng)常是高度動態(tài)的,且許多生物體似乎也將DNA 甲基化特異性地靶向活性基因體［6］。DNA 甲基化的分子機制見圖1。

圖1 DNA 甲基化的分子機制

1.2組蛋白修飾 組蛋白修飾是在相關酶的作用下,完成組蛋白甲基化、組蛋白的乙?；约靶纬扇ヒ阴；M蛋白過程。組蛋白是參與DNA 包裝和形成染色體的核心蛋白,染色體的基本結構是核小體,組成核小體的組蛋白八聚體的組蛋白H3和H4是蛋白酶修飾的主要位點,組蛋白尾部可被某些介質通過抑制組蛋白乙酰化來達到調節(jié)染色質重塑、染色質結構及基因表達的表觀遺傳機制失調［7,8］,這些修飾作用大多是可逆的。組蛋白的代碼見圖2。

圖2 組蛋白的代碼

1.3非編碼RNA 的調控 非編碼RNA 的調控主要包括雙鏈的小干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)這兩種常見的短鏈RNA,siRNA 是可以通過體外合成后轉染進入細胞中,是RNA 干涉的中間產(chǎn)物,通過與信使RNA(mRNA)同源配對。miRNA 在植入前胚胎發(fā)育過程中是非必需的,它們的功能在卵母細胞減數(shù)分裂過程中受到抑制,糖尿病、腫瘤、代謝異常疾病也深受miRNA 的影響［9］。

2 表觀遺傳學——同樣的基因,不同的結局

表觀遺傳修飾指的是通過專門的酶在基因以及周圍敲入或敲出其他基因的動態(tài)變化,這些酶不改變DNA 核苷酸序列本身,而是改變DNA 被轉錄的過程。DNA 在真核細胞內并不是裸露的,而是被動態(tài)地包裝成稱為染色質的DNA-蛋白質復合物,這有助于將非常長的DNA 壓縮包裝在細胞核的緊密范圍內。當需要基因產(chǎn)物時,染色質被選擇性地解開并且被打開以允許獲得轉錄因子(稱為常染色質)。這潛在說明比DNA序列本身更重要的是,染色質的結構和可及性的變化顯著影響基因表達的調節(jié),無論是在不同的細胞之間,還是在單個細胞的一生中。這些變化部分取決于表觀遺傳學。這意味著相同的基因在不改變DNA 序列的情況下可以產(chǎn)生不同的表型。例如,身體中的每個細胞都是遺傳上相同的,并且具有相同的胰島素基因,但是只有胰腺β 細胞具有允許的表觀遺傳變化,允許打開的色素和胰島素基因轉錄。除此之外,胰島素表達被沉默地表觀遺傳變化導致染色質濃縮(稱為異色素)。同樣,即使基因相似性從未改變,通過累積表觀遺傳變化,遺傳上相同的雙胞胎也會逐漸變得更加不同。

3 表觀遺傳學機制在DN 發(fā)生發(fā)展中作用

3.1DNA 甲基化在DN 發(fā)生發(fā)展的作用 有幾項研究將高血糖和DN 與表觀遺傳學聯(lián)系起來。適當刺激人腎小球系膜細胞(HMC)或近端腎小管上皮細胞(PTC),結果表明HMC 和PTC 中存在特定的DNA 甲基化特征［10］。例如許多基因如胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP-1)的表達水平與改變的DNA 甲基化水平相關［11］。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) 中基因C677T 的 TT 基因型以及T 等位基因可能是預測糖尿病發(fā)展成DN 風險的重要遺傳分子標記［12］。

有一項研究使用無限大的人類甲基化DNA 甲基化陣列來研究原自帶或不帶有腎臟疾病的1 型糖尿病患者的外周血DNA 中全基因組啟動子區(qū)內CpG 的甲基化情況［13］。該研究發(fā)現(xiàn)UNC13B 基因5'端高度甲基化,而該基因的基因變異被認為與糖尿病腎病的發(fā)生有關［14］。然而在高糖條件下,培養(yǎng)的鼠腦膜細胞的UNC13B 基因的表達并沒有受到抑制,而是表達上調［15］。另一項研究用上述同樣的方法,在從帶或不帶有晚期腎病的2 型糖尿病患者的唾液提取出的DNA 中發(fā)現(xiàn)了187 個具有不同特異性甲基化位點的基因［16］。最大規(guī)模的表觀基因組關聯(lián)研究在255 例CKD 患者(113 例由1 型糖尿病所致)和152 個對照個體(113 例有1 型糖尿病而無腎病)的血細胞中進一步發(fā)現(xiàn)了近50 萬個特異性甲基化位點。在實驗組和對照組中,23 個基因的DNA 甲基化有顯著差異,其中6 個發(fā)現(xiàn)的候選基因已被認為與腎病有關,包括CUX1、ELMO1、FKBP5、INHBA-AS1、PTPRN2、PRKAG2。在這6 個基因中,帶有CKD 的患者和對照者的外周血細胞中ELMO1 和PRKAG2 的mRNA 水平有輕微差異。另有研究通過總結腎小管上皮細胞中的DNA 甲基化情況,發(fā)現(xiàn)治療組糖尿病腎病患者中共有1061 個基因的甲基化狀態(tài)與對照組有明顯差異。不同的甲基化位點主要位于增強子區(qū)和轉錄因子結合位點。在所有具有不同甲基化的基因中,大約40%是有調控相關性的。在上述研究中,DNA 甲基化不同的基因很少重疊,這表明在疾病條件下的異常DNA 甲基化情況比正常組織中觀察到的更具有組織特異性。

腎臟疾病動物模型研究也揭示了DNA 甲基化的改變。據(jù)報道,在RASAL1 的啟動子中觀察到的DNA 高度甲基化,導致從纖維化和非纖維化腎臟分離的原發(fā)性成纖維細胞的RASAL1 轉錄水平下降［17］。RASAL1的表達減少增強了Ras 活性,導致腎纖維化。然而,RASAL1 并不是從人類樣本中發(fā)現(xiàn)的異常甲基化基因。

DNA 甲基化已經(jīng)顯示出影響miRNA let-7a 下調泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白1(UHRF1),這是DNA 甲基轉移酶1(Dnmt1)的重要相互作用蛋白［18］。高血糖導致嚙齒類動物腎臟中沒有類似肝臟中基因組DNA 低甲基化的現(xiàn)象［19］。DNA 去甲基化通過轉化生長因子(TGF)-β1參與DN 系膜纖維化過程有助于DN 的進展。DNA 去甲基化和 mRNA 同時上調見于糖尿病小鼠腎臟的原代系膜細胞中［20］。此外,在7 年內轉歸為2 型糖尿病的糖尿病前期患者中已鑒別出差異甲基化的CpG［21］。這些基因參與碳水化合物和脂質代謝以及炎癥反應包括SLC22A12、TRPM6、AQP9、HP、AGXT 和HYAL2等基因。DNA 甲基化與DN 的發(fā)病機制有關,其可調節(jié)基因表達影響疾病進展。

3.2組蛋白修飾對DN 發(fā)生發(fā)展中的影響 組蛋白尾部的修飾也是重要的表觀遺傳學現(xiàn)象,它可影響某些基因的轉錄和相應疾病的進展。高血糖的內環(huán)境導致內皮細胞中H3K4me1 水平升高,表明組蛋白甲基轉移酶SET7 與DN 表觀遺傳學改變有關,這在其他條件下也得到驗證［22］。鋅依賴性組蛋白脫乙酰酶中,組蛋白去乙?；?HDAC)2/4/5 在鏈脲佐菌素誘導的DN 大鼠、糖尿病db/db 小鼠和糖尿病患者腎臟活組織檢查中上調,HDAC4 被證明有助于足細胞損傷,作用模式為足細胞損傷與體外通過 HDAC4-STAT1 信號傳導抑制自噬和加劇炎癥［23］。發(fā)現(xiàn)DN 發(fā)病機制腎小球硬化和肥大的關鍵是TGF-β1誘導的纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)和p21 在腎小球系膜細胞(MCs)中的表達起主要作用［24］,表明核因子E2 相關因子2(NRF2) 在丁酸鈉(NaB)對 DN 的保護中起關鍵作用。其他研究結果表明,NaB 可能在轉錄水平激活 NRF2,可能是通過抑制 HDAC 活性［25］。此外,作為Polycomb 阻遏復合物2 的一部分zeste 同源物2(EZH2)的組蛋白甲基轉移酶增強劑已經(jīng)被證實在糖尿病條件下對足細胞和腎臟具有保護作用,通過減少TXNIP 和PAX6 表達抑制足細胞損傷和氧化應激［26］。

HDACs 在DN 中促纖維化基因的表達中也發(fā)揮作用,實驗顯示出姜黃素可以通過其抑制p300 和核因子-κB 來防止腎臟的氧化應激、系膜擴張和增加腎臟損傷［27］。

3.3miRNA 在DN 發(fā)生發(fā)展中的作用 除了DNA 甲基化和組蛋白修飾之外,非編碼RNA,特別是miRNA,已經(jīng)顯示在DN 的發(fā)展中起主要調節(jié)作用。據(jù)報道,在DN(miR-192)背景下發(fā)現(xiàn)的第一個miRNA 是膠原形成的關鍵調節(jié)因子［28］。在來自糖尿病腎病患者的人腎活檢中,TGF-β 介導的近端小管細胞中miR-192 的上調與纖維化和估計的腎小球濾過率降低有關［29］。腎臟miR-192 的抑制與糖尿病腎病小鼠模型中的腎纖維化減少和降低的尿蛋白有關［30］。研究表明TGF-β1導致E26 轉錄因子-1(Ets1)的乙?；蛷膍iR192 啟動子解離。

有研究證實了miR-21 上調與人類DN 纖維化的嚴重程度以及腎功能下降的速度呈正相關［31］。盡管金絲桃苷是miR-21 的潛在拮抗劑,但血清miR-21也可能是DN 的生物標志物。由TGF-β 誘導的另一種miRNA 是miR-200b/c,其導致腎小球系膜肥大。而miR-200a 似乎參與TGF-β 的負反饋調節(jié)?？寡鬃饔靡脖粴w因于miR-146a,其在足細胞中的缺乏導致糖尿病性腎小球病的加速發(fā)展。類似地,miR-29a 可以預防小鼠中的DN 并降低高血糖條件下的足細胞功能障礙。相反,miR-29c 促進db/ db 小鼠腎小球纖維化和足細胞凋亡。miR-34c 上調可防止在高血糖條件下的足細胞凋亡,而miR-26a 的過表達阻止膠原蛋白的定位。兩種miRNA 在DN 模型中均下調。此外,miR-126 的表達與患者中的DN 和白蛋白尿呈負相關,并且代表了DN 的潛在生物標志物。miR-130b 也顯示出相同的結果。

然而,更多的miRNA 已經(jīng)促進纖維化和凋亡,包括miR-195、miR-1207-5P、miR-135a、miR-218 和miR-34a。在健康人和DN 患者中miRNA 的檢測和表征已經(jīng)開啟了鑒定miRNA(諸如miR-145 和miR-192)的尿生物標志物作為該標本中潛在標志物的潛力。為了找到DN 患者微量白蛋白尿的早期標志物,也對尿miRNA 進行了分析。因此,幾種miRNA 在糖尿病狀態(tài)下參與了腎纖維化和疾病進展的發(fā)展,并代表了治療干預或疾病尿生物標志物的新型潛在靶標。

4 討論

近些年來,經(jīng)過大量的臨床及實驗研究,表觀遺傳學在各類臨床疾病中的研究相繼展開。結論是表觀遺傳學不僅揭示了許多疾病的病因和機理,而且也可以協(xié)助新型藥物的研發(fā)、先進治療方案制定等。單純從理論分析考慮,運用表觀遺傳所研發(fā)的藥物比傳統(tǒng)治療藥物具有更高的療效和更低的不良反應發(fā)生率。研究DN 的表觀遺傳調控將有助于DN 早期明確的診斷、更詳細地詮釋DN 的發(fā)病機制以及確定DN 未來的治療方向。然而,盡管表觀遺傳調控有著其他研究沒有的獨特優(yōu)勢,鑒于醫(yī)療臨床研究及疾病相應的治療需要,只著重研究某些有價值的位點,有可能會忽視一部分重要的因素,表觀遺傳調控研究的片面性有待改進和解決。