舒蕤 趙立芳 彭井印 張如意

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，山東 濱州 256603)

腦缺血再灌注損傷是臨床常見的一種病理過程，海馬神經(jīng)元細胞增殖、凋亡異常是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要原因之一，因而如何減輕腦缺血再灌注損傷成為研究重點〔1～3〕。咪達唑侖屬于γ氨基丁酸受體激動劑，其具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮等作用，咪達唑侖通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑而抑制氧化應激誘導的神經(jīng)元細胞凋亡從而減輕細胞損傷〔4〕。但咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞損傷的影響及其可能作用機制尚未闡明。miR-214-3p在阿爾茨海默病中表達水平降低，并可通過抑制自噬而減輕認知障礙〔5〕。miR-214可調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路而參與口腔癌的發(fā)生過程，已有研究表明MAPK/ERK-環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(CREB)通路被激活后可促進海馬神經(jīng)元細胞凋亡而造成細胞損傷〔6，7〕。但咪達唑侖是否可通過調(diào)控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而減輕腦缺血再灌注損傷尚未可知。本研究采用缺氧復氧誘導大鼠海馬神經(jīng)元細胞建立細胞損傷模型，探討咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞增殖、凋亡的影響及其對miR-214/MAPK/ERK-CREB通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 咪達唑侖購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；大鼠海馬神經(jīng)元細胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、凋亡檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司；MAPK/ERK-CREB通路抑制劑PD98059(母液20 mg/ml)購自碧云天生物技術(shù)研究所；anti-miR-con、anti-miR-214購自廣州銳博生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)試劑購自廣州勞斯生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗鼠MAPK、p-ERK、p-CREB抗體與IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2實驗分組 大鼠海馬神經(jīng)元細胞置于密閉缺氧的培養(yǎng)箱內(nèi)(95% N2、5%CO2)缺氧處理4 h，將其轉(zhuǎn)移至37℃、體積分數(shù)5%CO2正常培養(yǎng)箱復氧處理24 h〔8〕，記為缺氧復氧組。同時將正常培養(yǎng)的細胞記為NC組。大鼠海馬神經(jīng)元細胞加入含有不同濃度(3、6、12 μmol/ml)咪達唑侖的培養(yǎng)基處理24 h后進行缺氧復氧處理〔9〕，分別記為3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組。anti-miR-con、anti-miR-214分別轉(zhuǎn)染入大鼠海馬神經(jīng)元細胞后加入12 μmol/ml咪達唑侖處理24 h后進行缺氧復氧處理，分別記為12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組。anti-miR-214轉(zhuǎn)染入大鼠海馬神經(jīng)元細胞后加入12 μmol/ml 咪達唑侖與50 μmol/L抑制劑PD98059處理24 h后進行缺氧復氧處理〔10〕，記為PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組。

1.3MTT檢測細胞增殖 收集各組海馬神經(jīng)元細胞接種于96孔板(150 μl/孔)，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min后應用酶標儀檢測各孔吸光度值(A值)。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組海馬神經(jīng)元細胞加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，將500 μl結(jié)合緩沖液加入細胞沉淀后分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，振蕩搖晃孵育10 min后應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測細胞中miR-214的表達水平 收集各組海馬神經(jīng)元細胞后采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-214相對表達量。

1.6Western印跡檢測MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax、Bcl-2蛋白表達 提取各組海馬神經(jīng)元細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育一抗稀釋液(1∶1 000)過夜，TBST洗滌，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，滴加電化學發(fā)光(ECL)顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞活性的影響 與NC組比較，缺氧復氧組細胞活力明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組細胞活力明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響 與NC組比較，缺氧復氧組細胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組細胞凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

2.3不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞中miR-214表達水平的影響 與NC組比較，缺氧復氧組miR-214的表達水平明顯降低(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，3、6、12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧組miR-214表達水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞活性、凋亡和細胞中miR-214表達水平的影響

1～5：對照組、缺氧復氧組、3 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、6 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組；圖2同

圖2 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達

2.4下調(diào)miR-214表達抑制咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞的影響 與12 μmol/ml咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組細胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖3、表2。

2.5缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞中MAPK/ERK-CRE通路相關(guān)蛋白表達 與NC組比較，缺氧復氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與缺氧復氧組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組比較，12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表3、圖4。

1，2：12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

表2 下調(diào)miR-214表達抑制咪達唑侖對缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞的影響

表3 缺氧復氧處理的大鼠海馬神經(jīng)元細胞中MAPK/ERK-CRE通路相關(guān)蛋白表達

1～5：對照組、缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-con組、12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

2.6抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)miR-214下調(diào)表達對咪達唑侖處理的缺氧復氧大鼠海馬神經(jīng)元細胞的影響 與12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組比較，PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組細胞活力升高，凋亡率降低，MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5、表4。

1，2：12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組、PD98059+12 μmol/ml 咪達唑侖+缺氧復氧+anti-miR-214組

表4 抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)miR-214下調(diào)表達對咪達唑侖處理的缺氧復氧大鼠海馬神經(jīng)元細胞的影響

3 討 論

咪達唑侖可減輕脂多糖誘導的肝損傷而對肝臟組織發(fā)揮保護作用〔11〕。咪達唑侖可通過調(diào)控JNK-ERK途徑而抑制氧化應激誘導的神經(jīng)細胞凋亡從而減輕細胞損傷〔12〕。本研究結(jié)果提示,咪達唑侖可促進缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞增殖。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道結(jié)果相似〔13〕，咪達唑侖可抑制缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡。

本研究結(jié)果提示，咪達唑侖可能通過上調(diào)miR-214的表達而減輕缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞損傷。研究表明，miR-214在脂多糖誘導的膿毒癥、急性腎損傷等疾病中表達異常，還可減輕神經(jīng)細胞損傷〔14～16〕。本研究結(jié)果提示，抑制miR-214表達可拮抗咪達唑侖對缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞增殖及凋亡的作用。MAPK家族成員的作用為將細胞外信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)部，其與ERK1/2在海馬區(qū)可發(fā)揮重要調(diào)控作用，ERK通路激活后可促進CREB發(fā)生磷酸化而調(diào)控神經(jīng)元增殖及凋亡等過程〔17，18〕。本研究結(jié)果提示，咪達唑侖可能通過調(diào)控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而發(fā)揮作用。同時，本研究為進一步證實上述猜測，將MAPK/ERK-CREB通路抑制劑與miR-214抑制劑添加至缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞中，結(jié)果提示咪達唑侖可通過促進miR-214的表達而抑制MAPK/ERK-CREB通路從而發(fā)揮作用。

綜上，缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞中miR-214的表達水平降低，咪達唑侖可促進miR-214的表達而促進缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經(jīng)元細胞增殖及抑制細胞凋亡，其作用機制與抑制MAPK/ERK-CREB通路的活化有關(guān)。