趙涓涓 劉敏 江忍 張軍 張弘

(1鄂州市中心醫(yī)院病理科，湖北 鄂州 436000；2鄂州市中心血站)

結(jié)腸癌為消化系統(tǒng)惡性腫瘤常見(jiàn)類型，其發(fā)病大多認(rèn)為與原癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)〔1〕。微小核糖核酸(miRNA)為內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與信使RNA結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)〔2〕。有研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞中存在miRNA異常表達(dá)〔3〕。miR-223-3p廣泛存在于血小板、血漿及內(nèi)皮細(xì)胞中，具有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的作用〔4〕。miR-223-3p已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)〔5〕。但目前對(duì)結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miR-223-3p表達(dá)情況及其生物學(xué)功能作用機(jī)制研究尚少。本研究旨在探討miR-223-3p在老年結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年8月至2021年8月鄂州市中心醫(yī)院收治的108例初診為老年結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌者；②接受手術(shù)切除治療者；③病案資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受過(guò)相關(guān)抗癌治療者；②有放化療史者；③合并其他惡性腫瘤疾病者。將經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本作為研究標(biāo)本，癌旁組織標(biāo)本(距結(jié)腸癌組織邊緣至少5 cm)作為對(duì)照標(biāo)本。研究對(duì)象中男53例，女55例，年齡64～85歲，平均(70.34±11.42)歲?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)，本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞來(lái)源 人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)：購(gòu)于上海一研生物科技有限公司，貨號(hào)EY-X0739，來(lái)源于結(jié)直腸腺癌原發(fā)病灶。人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620)：購(gòu)于上海一研生物科技有限公司，貨號(hào)EY-X1067，來(lái)源于結(jié)直腸腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 取SW480及SW620細(xì)胞置于10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基(廣州沛瑜生物制品有限公司，貨號(hào)AAPR123)中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%及以上時(shí)加入0.25%胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液；吸取單細(xì)胞懸液移至離心管中，置于離心儀上800 r/min離心5 min；棄去上清液，加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 按照總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，貨號(hào)DP419)說(shuō)明書(shū)提取結(jié)腸癌組織、癌旁組織和生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SW480、SW620細(xì)胞總RNA。取100 ng RNA按照cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，貨號(hào)KR104)說(shuō)明書(shū)以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的cDNA第一鏈。以miR-223-3p(目的基因)和U6(內(nèi)參基因)為模板，設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行RT-PCR①反應(yīng)體系：12.5 μl 2倍UltraSYBR Mixture、0.5 μl下游引物、0.5 μl上游引物、2 μl cDNA模板、9.5 μl雙蒸水；②反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；③結(jié)果分析：利用RT-PCR儀(美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，型號(hào)7000)測(cè)定目的基因與內(nèi)參基因Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)含量。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取SW480細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板內(nèi)，每孔含2 ml細(xì)胞懸液；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%；以滅菌無(wú)RNA酶水溶解miR-223-3p mimics干粉制成20 μmol/L溶液，將250 μl不含血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)31985062)與100 pmol miR-223-3p mimics溶液混合，取細(xì)胞置于混合培養(yǎng)基中孵育5 min；加入500 μl lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)11668-027)室溫孵育15 min，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，6 h后更換新培養(yǎng)基(10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基)，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取SW620細(xì)胞同樣方法將anti-miR-223-3p轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-223-3p表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×104個(gè)/ml，接種于96孔板內(nèi)，每孔含2 ml細(xì)胞懸液；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞匯合度達(dá)到90%及以上；加入20 μl MTT溶液(0.5%，北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)M1025)，孵育4 h；棄去上清液每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩10 min后利用酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司生產(chǎn)，型號(hào)Multiskan FC)測(cè)定其在570 nm處的光密度(OD)值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

1.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板底部用Marker筆均勻劃?rùn)M線并橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò)5條線；取轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板內(nèi)，每孔含2 ml細(xì)胞懸液；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞匯合度達(dá)到90%及以上；第2天使用槍頭垂直于板底部橫線劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次去除劃下細(xì)胞；加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于0 h和24 h利用倒置顯微鏡拍照記錄細(xì)胞劃痕距離，計(jì)算遷移率。

1.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell) 冰箱中取出基質(zhì)膠(Matrigel)置于Transwell小室底部膜上室；取轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml，將細(xì)胞接種于上室，下室中加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h；取出小室用棉簽除去上層細(xì)胞，PBS溶液沖洗3次；加入甲醇室溫固定30 min，吸去液體室溫風(fēng)干；將小室置于24孔板中，每孔加入1 ml 0.5%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min，PBS溶液沖洗3次后室溫風(fēng)干；將細(xì)胞移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡200倍下隨機(jī)選取4個(gè)視野觀察并記錄穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

1.9細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞加入10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為(2～5)×105個(gè)/ml，置于離心儀2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入500 μl PBS溶液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC溶液和碘化丙啶(PI)溶液，室溫避光孵育5 min；利用流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)，型號(hào)CytoFLEX)觀察細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

1.10Western印跡試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后加入0.3%胰酶消化細(xì)胞；PBS溶液沖洗2次，5 min/次；按照鼠抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)、鼠抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體試劑盒(上海研生生化試劑有限公司)和鼠抗人β-actin抗體試劑盒(上海研生生化試劑有限公司)說(shuō)明書(shū)操作，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miR-223-3p表達(dá)水平比較 結(jié)腸癌組織中miR-223-3p表達(dá)水平(6.25±1.80)顯著高于癌旁組織(1.04±0.05；t=30.068，P<0.001)。

2.2SW480及SW620細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平比較 SW620細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平(1.52±0.33)顯著高于SW480細(xì)胞(1.06±0.04；t=14.381，P<0.001)。

2.3轉(zhuǎn)染后SW480及SW620細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平比較 SW480細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染組miR-223-3p表達(dá)水平(1.82±0.32)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(1.05±0.25；t=19.706，P<0.001)；SW620細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染組miR-223-3p表達(dá)水平(0.75±0.07)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(1.08±0.11；t=26.303，P<0.001)。

2.4miR-223-3p對(duì)細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染24、48、72 h后SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染組細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著多于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h和72 h后SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染組細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著少于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.5miR-223-3p對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響 轉(zhuǎn)染24 h后SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染組遷移率顯著高于未轉(zhuǎn)染組，SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染組顯著低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見(jiàn)圖2，圖3。

圖1 miR-223-3p對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖2 SW480細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×200)

圖3 SW620細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×200)

2.6miR-223-3p對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染組穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量顯著多于未轉(zhuǎn)染組，SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染組顯著少于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.7miR-223-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于未轉(zhuǎn)染組，SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染組顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 SW480、SW620細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)及凋亡實(shí)驗(yàn)

2.8miR-223-3p對(duì)細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)水平(2.12±0.33)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(1.75±0.27)，Bax蛋白表達(dá)水平(1.63±0.25)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(2.07±0.31；t=9.018、11.482，均P<0.001)；SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)水平(1.53±0.40)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(2.02±0.43)，Bax蛋白表達(dá)水平(1.84±0.36)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(1.42±0.33；t=8.671、8.938，均P<0.001)。見(jiàn)圖5。

圖5 miR-223-3p對(duì)SW480、SW620細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)影響

3 討 論

隨著人們飲食習(xí)慣改變，結(jié)腸癌發(fā)病率已位居惡性腫瘤疾病第二位并呈逐年上升趨勢(shì)〔6〕。結(jié)腸癌治療一般以根治性手術(shù)為主，化療及免疫等治療為輔，但對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者，化療及免疫等治療為其主要治療方式〔7〕。靶向治療是繼手術(shù)、放療及化療后新興的腫瘤治療手段，具有高度針對(duì)性和分子特異性〔8〕。目前常見(jiàn)的結(jié)腸癌靶向藥物包括抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，隨著研究深入靶向治療已從分子水平逐漸走向基因治療〔9〕。miRNA為近年腫瘤治療研究熱點(diǎn)，程鈞〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與結(jié)腸癌進(jìn)展密切相關(guān)。miR-223-3p為造血系統(tǒng)調(diào)控因子，已證實(shí)可調(diào)控胃癌細(xì)胞周期和凋亡〔11〕。本研究結(jié)果提示，miR-223-3p可能參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮原癌基因作用。本研究結(jié)果提示miR-223-3p可能參與結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，增加結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力，并可抑制細(xì)胞凋亡。Bax蛋白具有BH1-3結(jié)構(gòu)區(qū)域，為細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子。Bcl-2蛋白具有BH1-4保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，為細(xì)胞凋亡抑制因子。有研究表明，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中Bax蛋白呈低表達(dá)，Bcl-2蛋白呈高表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果提示，miR-223-3p可通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)miR-223-3p抑制劑可通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-223-3p有可能成為治療結(jié)腸癌的新靶點(diǎn)。

綜上，miR-223-3p參與老年結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，可通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力發(fā)揮原癌基因作用。