張麗 董巧云 宋榮 侯麗 陶菊花

(1巴彥淖爾市醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2巴彥淖爾市臨河區(qū)人民醫(yī)院；3巴彥淖爾市醫(yī)院腫瘤中心)

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，放射治療是局部晚期直腸癌治療的方式之一，聯(lián)合手術(shù)治療可降低局部復(fù)發(fā)率，提高患者總生存率〔1,2〕；然而放射抵抗性的出現(xiàn)降低了放療效果，提高癌細(xì)胞的放射敏感性是提高其治療效果的重要途徑和方法。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過調(diào)節(jié)各種機(jī)制影響放射敏感性，有望在將來成為放射治療的潛在治療靶標(biāo)〔3〕。序列相似性201家族成員(FAM201)A是一種新型的lncRNA，研究報(bào)道抑制FAM201A可在體外抑制肺鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)〔4〕。FAM201A在放射抵抗的非小細(xì)胞肺癌患者組織中顯著上調(diào)，與患者放射抵抗和生存期降低密切相關(guān)；沉默F(xiàn)AM201A在體外和體內(nèi)均可在X射線照射下抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。抑制lncRNA FAM201A通過靶向miR-488-3p可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并增加其放射敏感性〔6〕。然而FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響尚不清楚。

miR-146a-5p是miR-146a家族中主要成員之一，研究報(bào)道m(xù)iR-146a-5p在結(jié)直腸癌中失調(diào)表達(dá)，可作為檢測(cè)結(jié)直腸癌的非侵入性生物標(biāo)志物〔7〕。miR-146a-5p可通過影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程而發(fā)揮抑癌作用〔8〕。miR-146a-5p可以通過激活DNA修復(fù)途徑和抑制復(fù)制蛋白(RP)A3來抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)放射敏感性和凋亡〔9〕。表明miR-146a-5p可抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展，還可影響腫瘤放射敏感性。本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p和人GATA結(jié)合蛋白(GATA)6有結(jié)合位點(diǎn)；GATA6基因位于染色體18q11.1～q11.2上，在多種腫瘤中作為促癌基因〔10〕。GATA6蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)量增加，與患者預(yù)后有關(guān)〔11〕。miR-455過表達(dá)通過靶向GATA6抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔12〕。抑制GATA6顯著增加了輻射誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT55和HT29凋亡〔13〕。然而miR-146a-5p是否通過調(diào)控GATA6影響直腸癌進(jìn)展及放射敏感性尚不清楚，且FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響是否與miR-146a-5p和GATA6有關(guān)也不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與miR-146a-5p和GATA6有關(guān)。

1 材料與方法

1.1臨床組織來源 選取內(nèi)蒙古巴彥淖貝爾市醫(yī)院外科手術(shù)切除的23例直腸癌患者癌組織及癌旁正常黏膜組織，男13例、女10例，年齡40～61歲，平均(47.63±3.47)歲;病程1～3年，平均(1.02±0.54)年，分期1期8例，2期10例，3期5例。所有患者手術(shù)前未進(jìn)行過放化療，患者均知情且同意。

1.2材料 直腸癌細(xì)胞SW837購自美國(guó)ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購自美國(guó)invitrogen公司；熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Biovision公司；蛋白提取試劑盒購自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)AAT Bioquest公司。

1.3細(xì)胞處理與分組 直腸癌細(xì)胞SW837用RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將si-NC、si-FAM201A、miR-NC、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染至SW837細(xì)胞中，記為si-NC組、si-FAM201A組、miR-NC組、miR-146a-5p組；將si-FAM201A分別與anti-miR-NC、anti-miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染至SW837細(xì)胞中，記為si-FAM201A+anti-miR-NC組、si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)FAM201A、miR-146a-5p和GATA6 mRNA的表達(dá)水平 提取直腸癌組織、癌旁組織及細(xì)胞的總RNA，合成cDNA后按熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。FAM201A上游引物：5′-CCAGGCTCTTTGATCACCAT-3′，下游：5′-GAGTTTCCTGGGATGTGGAA-3′；miR-146a-5p上游引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游：5′-CCCA TGGAATTCAGTTCTCATT-3′；GATA6上游引物：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-TCA CCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′；U6上游引物：5′-CAAGGATGACACGCAAA-3′，下游：5′-TCAACTGGTGTCGTG-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 將1.3中各組細(xì)胞以適宜密度接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合達(dá)至80 %左右，分別給予0、2、4、6、8 Gy的射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)約2 w，用吉姆薩染色30min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落?？寺⌒纬陕?PE)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)(SF2)=照射劑量組的集落數(shù)/(該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用GraghPad Prism5軟件，按單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)閾劑量(代表存活的寬肩度)，N為外推值。放射增敏比(SER)=單純照射組D0/聯(lián)合照射組D0。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡1.3中各組細(xì)胞接種于6孔板中。分別給予0、4 Gy的射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 按試劑盒說明操作，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣40 μl蛋白樣品，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后加入一抗孵育，然后加入二抗室溫孵育，加入化學(xué)發(fā)光液顯影，然后定影、成像；用Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建FAM201A及GATA6的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-146a-5p及miR-NC共轉(zhuǎn)染至直腸癌細(xì)胞SW837中，按試劑盒說明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FAM201A、miR-146a-5p和GATA6在直腸癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織相比，直腸癌組織中FAM201A和GATA6 mRNA表達(dá)水平顯著升高，miR-146a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞放射敏感性及凋亡的影響 與si-NC組相比，si-FAM201A組0 Gy、4 Gy直腸癌細(xì)胞集落形成數(shù)及2、4、6、8 Gy細(xì)胞存活率顯著減少，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、表3、圖1。單擊多靶模型擬合計(jì)算得出(表4)，si-FAM201A組SER為1.885。

表1 FAM201A、miR-146a-5p 和GATA6 在直腸癌中的表達(dá)

表2 干擾 FAM201A 對(duì)直腸癌細(xì)胞存活率的影響

表3 干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞集落形成、凋亡及FAM201A、miR-146a-5p、GATA6表達(dá)的影響

A：干擾FAM201A抑制直腸癌細(xì)胞集落形成(吉姆薩染色，×40)；B：干擾FAM201A誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡

表4 si-NC組與si-FAM201A組SER

2.3干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞miR-146a-5p、GATA6表達(dá)的影響 與si-NC組相比，si-FAM201A組FAM201A表達(dá)水平顯著降低，miR-146a-5p表達(dá)水平顯著升高，GATA6 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.4miR-146a-5p對(duì)直腸癌細(xì)胞放射敏感性及凋亡影響 與miR-NC組相比，miR-146a-5p組miR-146a-5p表達(dá)水平升高，GATA6 蛋白表達(dá)水平降低，直腸癌細(xì)胞集落形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，2、4、6、8 Gy細(xì)胞存活率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3～5、表5、表6。單擊多靶模型擬合計(jì)算得出(表7)，miR-146a-5p組的SER為2.109。

圖2 GATA6蛋白表達(dá)

圖3 Western印跡檢測(cè)GATA6蛋白表達(dá)

圖4 miR-146a-5p抑制直腸癌細(xì)胞集落形成(吉姆薩染色，×40)

圖5 miR-146a-5p誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡

表5 miR-46a-5p對(duì)直腸癌細(xì)胞存活率的影響

表6 miR-146a-5p對(duì)直腸癌細(xì)胞集落形成及凋亡的影響

表7 單機(jī)多靶參數(shù)

2.5抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞放射敏感性及凋亡影響 與si-FAM201A+anti-miR-NC組相比，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組miR-146a-5p表達(dá)水平降低，GATA6 蛋白表達(dá)水平升高，直腸癌細(xì)胞集落形成數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率及2、4、6、8 Gy細(xì)胞存活率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6～8、表8、表9。單擊多靶模型擬合計(jì)算得出(表10)，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組的SER為0.542。

2.6FAM201A、miR-146a-5p和GATA6的靶向關(guān)系 Starbase軟件預(yù)測(cè)顯示FAM201A與miR-146a-5p具有結(jié)合位點(diǎn)，targetscan軟件預(yù)測(cè)顯示miR-146a-5p與GATA6具有結(jié)合位點(diǎn)(圖9)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-FAM201A或WT-GATA6與miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-FAM201A或MUT-GATA6與miR-146a-5p共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變。見表11。

1，2：si-FAM201A+anti-miR-NC組，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p組，圖7，8同

圖7 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞集落形成的抑制作用(吉姆薩染色，×40)

圖8 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡

表8 抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾FAM201A對(duì)直腸癌細(xì)胞集落形成及凋亡的影響

表9 miR-46a-5p對(duì)直腸癌細(xì)胞存活率的影響

表10 單機(jī)多靶參數(shù)

圖9 FAM201A、miR-146a-5p和miR-146a-5p、GATA6的互補(bǔ)序列

表11 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討 論

放射治療是腫瘤的重要治療手段之一，但目前面臨著腫瘤放療抵抗的難題，如何增強(qiáng)腫瘤的放射敏感性，提高放射治療效果是亟需解決的問題〔14〕。研究腫瘤放射敏感性的分子機(jī)制，尋找潛在的增敏靶點(diǎn)進(jìn)而提高放射敏感性是重要方法〔15〕。研究報(bào)道FAM201A在耐輻射食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)增加與食管鱗癌的抗輻射性和低存活率密切相關(guān)，F(xiàn)AM201A通過miR-101調(diào)節(jié)ATM和mTOR表達(dá)介導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的放射敏感性〔16〕。FAM201A通過miR-186-5p/TNKS1BP1軸增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并加速細(xì)胞凋亡〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明干擾FAM201A可抑制直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，干擾FAM201A可提高直腸癌細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。

研究報(bào)道m(xù)iR146a-5p通過羧肽酶(CP)M/src-局部黏著斑激酶(FAK)途徑促進(jìn)人結(jié)直腸癌中的細(xì)胞遷移和侵襲〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)miR-146a-5p可抑制直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究報(bào)道m(xù)iR-146a-5p過表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞OVCAR3、SKOV3對(duì)順鉑的敏感性〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)miR-146a-5p可增強(qiáng)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性。研究報(bào)道m(xù)iR-944過表達(dá)通過靶向GATA6抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-146a-5p可能通過靶向調(diào)控GATA6影響直腸癌進(jìn)展。

研究報(bào)道lncRNA電壓門控鉀通道亞家族Q1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT1)通過miR-146a-5p/堿性神經(jīng)酰胺酶(ACER)3軸抑制放射敏感性并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生〔21〕。lncRNA可通過調(diào)控miR-146a-5p影響腫瘤進(jìn)展及放射敏感性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM201A可靶向調(diào)控miR-146a-5p；而抑制miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)干擾對(duì)直腸癌細(xì)胞集落形成，凋亡及放射敏感性的影響，提示，F(xiàn)AM201A可能通過調(diào)控miR-146a-5p影響直腸癌進(jìn)展。

綜上所述，干擾FAM201A可通過調(diào)控miR-146a-5p/GATA6抑制直腸癌細(xì)胞集落形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其放射敏感性。