王霞 李美 王冰 陳秋菊 李巖 劉振元 張文奇

(衡水市人民醫(yī)院(哈勵遜國際和平醫(yī)院)康復醫(yī)學科，河北 衡水 053000)

在血管風險高發(fā)、人口統(tǒng)計學巨變(老齡化、城市化)、生活方式欠佳(久坐、飲食)和經(jīng)濟快速發(fā)展的背景下，腦卒中的發(fā)病率、致殘率、死亡率呈升高趨勢，已成為威脅中老年人健康的一大公害〔1〕。急性缺血性腦卒中(AIS)作為一種危重的醫(yī)學急癥，其病因尚未確定，目前需要利用多種評估工具進行及時的評估，包括非對比頭顱電子計算機斷層掃描(CT)檢查、磁共振成像(MRI)評估量表，這些評估工具非常有效，但也有其局限性，比如對特定腦區(qū)的敏感性有限〔2〕。在AIS的治療方面，腦卒中后4.5 h內(nèi)靜脈注射重組組織纖溶酶原激活劑仍是臨床首選，而由于缺乏對院前腦卒中癥狀的快速識別，AIS患者的及時干預常常受到阻礙〔3〕。

微小RNA(miRNAs)被認為是重要的調(diào)節(jié)因子，可以作為人類疾病的診斷生物標志物或治療靶點，為研究潛在的新治療方法提供了機會。很多研究表明miRNAs可以通過調(diào)節(jié)血管生成參與AIS的形成〔4，5〕。miRNA-194-5p已經(jīng)在多種癌癥中得到了很好的研究，并且在順式細胞癌患者中也被證實是下調(diào)的〔6〕。也有研究表明在低溫氧葡萄糖剝奪處理的神經(jīng)元中，miRNA-194-5p的表達顯著下調(diào)，在miRNA-194-5p介導神經(jīng)元死亡的調(diào)控種，其下調(diào)對特定靶蛋白SUMO2缺血耐受至關(guān)重要，miRNA-194-5p在通過調(diào)節(jié)SUMO2調(diào)節(jié)深低溫循環(huán)停止反應中發(fā)揮獨特作用。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-194-5p可能是缺血性疾病干預治療的潛在靶點〔7，8〕。然而，miRNA-194在AIS中的作用尚未見報道。miRNA-194-5p對AIS 及其相關(guān)炎癥的作用和機制尚不清楚。本研究旨在探索miRNA-194-5p對AIS相關(guān)炎癥的作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年12月衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的AIS患者72例為腦卒中組，男38例，女34例，年齡58～68歲；同期72例無腦血管病健康志愿者為正常組，男37例，女35例，年齡61～67歲。納入標準：①臨床確診為AIS，入院前行頭部CT排除腦出血；②臨床資料完整；③首次發(fā)病且于3 d內(nèi)入院。排除標準：①發(fā)病前有顱腦或精神創(chuàng)傷者及合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病;②年齡<18歲;③顱內(nèi)出血或合并梗死后出血;④合并腫瘤及心肺功能不全；⑤合并自身免疫性疾病。取血樣，4℃離心10 min，得血清，-80℃保存。經(jīng)CT或MRI檢查證實為AIS。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得每位患者的書面知情同意。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，從血清和細胞中收集總RNA。運用RT試劑盒(TaKaRa Bio，Inc)合成cDNA。反應在20 μl體積內(nèi)進行，每個基因包含1 μl引物(10 μmol/L)、1 μl cDNA、10 μl SYBR Premix EX TaqTM(Takara Bio，Inc)和8 μl無核糖核酸酶水。RT-PCR使用LightCycle?96裝置(羅氏，中國上海)進行。用2-ΔΔCt法分析mRNA表達量。

1.3細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自美國Ambion公司。HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中生長，細胞在37℃和5%CO2下孵育。使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，miRNA-194-5p、simiRNA-194-5p、siTRAF6和對照質(zhì)粒(上?；蛑扑幱邢薰?轉(zhuǎn)染HUVECs。①細胞分為正常組和脂多糖(LPS)模型組，培養(yǎng)48 h后，將100 ng/ml LPS加入LPS誘導組HUVECs中，孵育48 h，建立LPS誘導的HUVECs模型，并檢測6、12、24、48 h的miRNA-194-5p表達。②將LPS誘導培養(yǎng)48 h的HUVECs分為空白組、miRNA-194-5p組、simiRNA-194-5p組，分別轉(zhuǎn)染相應的質(zhì)粒，培養(yǎng)12 h后，檢測miRNA-194-5p 、炎癥因子、TRAF6 mRNA、TRAF6蛋白表達情況。③將LPS誘導培養(yǎng)48 h的HUVECs分為空白組，simiRNA-194-5p組，simiRNA-194-5pa+siTRAF6組，分別轉(zhuǎn)染相應的質(zhì)粒，培養(yǎng)12 h后，檢測TRAF6、炎癥因子表達。

1.4雙熒光素酶報告分析 使用了miRNA靶點預測軟件分析miRNA-194-5p的作用靶點。確定TRAF6的3′-UTR與miRNA-194-5p的結(jié)合位點。使用Lipofectamine2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)誘導HUVECs轉(zhuǎn)染TRAF6-miRNA-194-5p 和TRAF6-negative 。轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶分析系統(tǒng)進行報告分析。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ELISA試劑盒用于細胞上清中炎癥因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平檢測。使用FLUOstar-Omega微孔板閱讀器(BMG-Labtech股份有限公司)在450 nm波長處檢測吸光度。

1.6Western印跡分析 使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。然后在10%的凝膠上用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)(50 μg/ml)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，用(TRAF)6和GAPDH抗體在4℃孵育12 h。然后用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔IgG二級抗體孵育膜2 h。使用增強化學發(fā)光試劑盒(EMD Millipore)對蛋白質(zhì)條帶進行可視化，并使用密度測定法(Quantity One 4.5.0軟件；Bio-Rad Laboratories，Inc)對蛋白進行定量。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，方差分析和Tukey檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-194-5p在腦卒中患者血清的表達 腦卒中組miRNA-194-5p表達(0.39±0.15)顯著低于正常組(1.00±0.08，P<0.05)。

2.2LPS誘導的HUVECs中miRNA-194-5p的表達 與正常組相比，LPS模型組各時間點miRNA-194-5p表達水平顯著下降(均P<0.001)。見表1。

表1 LPS誘導HUVECs中miRNA-194-5p表達

2.3miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 與空白組比較，miRNA-194-5p組在miRNA-194-5p質(zhì)粒作用下顯著激活HUVECs miRNA-194-5p表達量(P<0.001)。與空白組比較，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表2。

表2 激活miRNA-194-5p對HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.4下調(diào)miRNA-194-5p 促進神經(jīng)炎癥發(fā)展 與空白組比較，simiRNA-194-5p組在simiRNA-194-5p作用下顯著抑制HUVECs miRNA-194-5p表達量(P<0.001)。與空白組比較，下調(diào)miRNA-194-5p表達，可明顯激活HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表3。

表3 下調(diào)miRNA-194-5p 對HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.5miRNA-194-5p通過TRAF6靶點抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 miRNA-194-5p與TRAF6的結(jié)合位點，見圖1。與空白組與TRAF6組比較，miRNA-194-5p與TRAF6的熒光素酶表達量顯著偏低(P<0.05)?？瞻捉M，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 mRNA及蛋白表達，下調(diào)miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 mRNA及蛋白表達(P<0.05)。見圖2、圖3、表4。

圖1 miRNA-194-5p與TRAF6的結(jié)合位點

圖2 激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達量

圖3 下調(diào)miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 蛋白表達量

表4 miRNA-194-5p通過TRAF6靶點抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展

2.6調(diào)控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 用siTRAF6顯著抑制下調(diào)miRNA-194-5p對TRAF6蛋白表達量，與simiRNA-194-5p組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與simiRNA-194-5p組比較，下調(diào)TRAF6可顯著減少下調(diào)miRNA-194-5p對HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 調(diào)控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展

1～3：空白組、simiRNA-194-SP組、simiRNA-194-5p+siTRAF6組

3 討 論

AIS是世界上神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率的重要原因之一〔9〕。免疫系統(tǒng)在腦缺血損傷后的病理生理變化中起著復雜的作用，腦卒中通過激活自主神經(jīng)系統(tǒng)和應激軸誘導免疫反應的抑制，顯著促進腦卒中相關(guān)炎癥的發(fā)展。免疫應激的生物標志物被認為是預測腦卒中相關(guān)感染的可靠指標〔10〕。開發(fā)生物標志物來指導腦卒中預后和相關(guān)性炎癥，將有助于對腦卒中高?；颊叩谋O(jiān)測和預防性抗感染治療。到目前為止，還沒有一種生物標志物或生物標志物模式能夠充分預測感染或具有足夠的陰性和陽性預測值為臨床提供可靠的靶點〔1，10〕。miRNA-194-5p/NXPH1軸在神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)將為生物醫(yī)學和神經(jīng)科學研究開辟新的途徑〔11〕。本研究結(jié)果說明miRNA-194-5p可能參與腦卒中相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

miRNAs可能針對數(shù)百種不同的mRNAs，調(diào)節(jié)基因表達，在細胞形成、分化、增殖和凋亡中具有重要作用，很多mRNAs并被認為是參與神經(jīng)元保護基因表達的關(guān)鍵調(diào)控因子〔12〕。研究表明，缺血性腦卒中改變了小鼠和人類多個miRNA的表達，并具有改變細胞應激反應的能力。此外，腦卒中誘導的神經(jīng)炎癥事件，特別是小膠質(zhì)細胞反應在miRNAs水平上受到調(diào)節(jié)〔13〕。研究表明NF-κB激活可下調(diào)LPS誘導的急性肺損傷(ALI)中miRNA-194的表達。miRNA-194的過度表達減輕了LPS誘導的ALI，并通過靶向CXCR4降低了炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。在LPS誘導的ALI中，NF-κB通過抑制miRNA-194的表達介導CXCR4的表達，從而促進肺組織的炎癥損傷〔14,15〕。有人認為在LPS誘導后，miRNA-194在新生兒臍血粒細胞中的表達下調(diào)，表明miRNA-194在LPS刺激的TLR信號通路中的作用〔16〕。另一項研究報道m(xù)iR-194可以通過靶向TRAF6調(diào)節(jié)棕櫚酸誘導的人THP-1細胞TLR4炎癥反應〔17〕。此外，miRNA-194還可以通過介導TLR4的表達來調(diào)節(jié)LPS誘導的NF-κB信號〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的HUVECs模型中 miRNA-194-5p的表達被顯著抑制，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。Chen等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-194-5p表達，HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平被激活。這些表明miRNA-194-5p可以抑制神經(jīng)炎癥，但機制尚不清楚。

TRAFs家族是一種多功能的細胞內(nèi)因子，最初發(fā)現(xiàn)它與細胞中的不同TNF直接結(jié)合，并存在于多種生物細胞中〔20〕。TRAF6與典型TRAF蛋白結(jié)構(gòu)同源性最小，TRAF-C結(jié)構(gòu)域差異最大〔21〕。越來越多的證據(jù)表明，TRAF6除了作為適應性蛋白外，還可以作為E3泛素連接酶調(diào)節(jié)下游信號通路。TRAF6可以介導炎癥因子信號的表達，在大腦中動脈閉塞模型中發(fā)現(xiàn)TRAF6的表達水平明顯升高，腦水腫明顯，但應用TRAF6抑制劑后，腦梗死面積減小，腦水腫程度減輕，免疫組化和Western印跡檢測顯示TRAF6的表達也明顯減少〔22〕。同樣，一些臨床試驗表明，在AIS患者外周血中，TRAF6作為TLR4信號通路激活后的下游分子，在腦缺血中發(fā)揮著最重要的作用，對缺血性腦損傷的預后有重要影響〔23〕。本研究發(fā)現(xiàn)，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達量。抑制TRAF6表達減少下調(diào)miRNA-194-5p對神經(jīng)炎癥發(fā)展的作用。 Kong等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-194調(diào)控TRAF6表達，抑制LPS誘導的椎間盤髓核細胞炎癥反應。提示，miRNA-194-5p可能通過調(diào)控TRAF6，減少神經(jīng)炎癥阻止腦卒中風險。

綜上，腦卒中患者血清中miRNA-194-5p表達顯著降低，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中炎癥因子。同時miRNA-194-5p通過調(diào)控TRAF6靶點，抑制腦卒中相關(guān)神經(jīng)炎癥。提示，miRNA-194-5p可能作為臨床治療腦卒中相關(guān)神經(jīng)炎癥重要指標，但其作用機制還有待進一步探討。