潘劍輝 蘇子劍 林春城 潘群雄

(1福建省立金山醫(yī)院(福建省立醫(yī)院南院)普外科，福建 福州 350001；2福建醫(yī)科大學附屬泉州市第一醫(yī)院肝膽外科)

肝癌具有高侵襲性、易轉移的特點，病死率高、預后差〔1〕。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與、多途徑形成的復雜病理過程，涉及多基因與多通路。雖然目前對肝癌的診斷及治療有了很大的成效，但是對其發(fā)生發(fā)展的病理機制仍認識不足，因此探索新的肝癌相關生物學標志物對于肝癌的早期診斷及治療和預后至關重要〔2,3〕。研究表明，一些lncRNA在肝癌組織中表達失控，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移關系密切，有望成為肝癌新的預防、治療和預后的指標〔4〕。神經(jīng)母細胞瘤相關轉錄物(NBAT)1是新鑒定的功能性lncRNA，在多種癌癥中起腫瘤抑制劑作用；如NBAT1在胃癌組織中下調表達，其低表達與腫瘤分期和淋巴結轉移及預后不良有關；過表達NBAT1抑制了胃癌的增殖、遷移和侵襲〔5〕。NBAT1在神經(jīng)膠質瘤組織中也低表達，NBAT1過表達通過miR21/Y性別決定基因(SOX)7軸抑制神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔6〕。NBAT1通過miR-21-5p/細胞因子轉導信號抑制因子(SOCS)6軸抑制膀胱癌的惡性細胞表型〔7〕。然而NBAT1在肝癌中的作用及機制尚不清楚。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在細胞的生長發(fā)育過程中起重要作用，主要包括細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)途徑、c-Jun NH2-末端激酶(JNK)及p38MAPK途徑，MAPK信號通路通過一系列酶的激活與失活調節(jié)細胞內反應，影響腫瘤的生長和轉移；且研究發(fā)現(xiàn)MAPK通路與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關〔8,9〕。研究報道〔10〕，LINC00601上調通過激活MAPK信號通路促進肝癌的發(fā)展〔10〕。LINC00844通過靶向鋅結合A2-糖蛋白(AZGP)1抑制MAPK信號傳導，從而抑制肝細胞癌的進展〔11〕。然而lncRNA NBAT1是否通過MAPK信號通路影響肝癌進展尚不清楚，本研究旨在探討lncRNA NBAT1是否通過MAPK信號通路影響肝癌進展。

1 材料與方法

1.1材料 收集泉州市第一醫(yī)院收治的43例肝癌患者癌組織及癌旁組織，手術切除的組織標本立即用液氮保存，所有患者知情且同意。

1.2主要試劑 肝癌細胞株MHCC97H購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MAPK通路抑制劑SB203580購自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑購自南京森貝伽生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自美國Sciencell公司；Transwell小室、基質膠購自美國Corning公司；蛋白提取試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；p-ERK、p-p38和p-JNK抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3細胞處理與分組 肝癌細胞株MHCC97H用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將NBAT1過表達載體及陰性對照質粒轉染至MHCC97H細胞中，記為pcDNA-NBAT1組、pcDNA組；將10 μmol/L MAPK通路抑制劑SB203580處理MHCC97H細胞，記為SB203580組，正常培養(yǎng)的細胞記為Con組。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測lncRNA NBAT1的表達水平 各取5 g肝癌組織及癌旁組織，加入Trizol試劑提取其總RNA，同時用Trizol試劑提取細胞pcDNA組、pcDNA-NBAT1組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，按試劑盒說明進行PCR，反應條件為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；相對表達量用2-△△Ct法計算。lncRNA NBAT1上游引物：5′-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3′，下游：5′-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3′，下游：5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3′。

1.5MTT檢測細胞增殖 細胞培養(yǎng)48 h，加入20 μl的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩反應10 min，酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.6克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù) 取pcDNA組、pcDNA-NBAT1組、SB203580組、Con組對數(shù)生長期細胞，制成細胞懸液，接種于6孔板中，每組設3個復孔，培養(yǎng)2 w出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，然后用吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落。

1.7劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率 pcDNA組、pcDNA-NBAT1組、SB203580組、Con組細胞消化后接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在盤底用記號筆劃線做標記，過夜細胞鋪滿后用槍頭垂直橫線劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗劃下的細胞，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和48 h后拍照觀察，用Image-Pro Plus6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.8Transwell檢測侵襲細胞數(shù) 將pcDNA組、pcDNA-NBAT1組、SB203580組、Con組細胞在無血清的培養(yǎng)液中饑餓12 h，調整細胞濃度為5×105個/ml；

用基質膠包被Transwell小室底部膜的上室，取100 μl細胞懸液加入Transwell小室，培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)液后用PBS洗2遍，甲醇固定，結晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，PBS洗3遍，用顯微鏡隨機選取5個視野觀察計數(shù)細胞。

1.9Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量后取50 μl蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h，然后加入一抗4℃過夜，洗膜后再加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，洗膜后加入化學發(fā)光試劑顯影，成像后用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度水平，計算蛋白表達水平。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1lncRNA NBAT1在肝癌組織中表達 肝癌組織中l(wèi)ncRNA NBAT1表達水平(0.35±0.04)顯著低于癌旁組織(1.00±0.09；t=43.277,P=0.000)。

2.2過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞增殖的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-NBAT1組肝癌MHCC97H細胞中l(wèi)ncRNA NBAT1表達水平明顯升高，肝癌細胞活性明顯降低，肝癌細胞克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞克隆形成的影響(結晶紫染色)

表1 過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞增殖及轉移影響

2.3過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞轉移的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-NBAT1組肝癌MHCC97H細胞的劃痕愈合率明顯降低，侵襲肝癌細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞遷移及侵襲(結晶紫染色，×200)的影響

2.4過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞MAPK通路的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-NBAT1組肝癌MHCC97H細胞中p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖3、表2。

1～2:pcDNA組,pcDNA-NBAT1組

2.5MAPK通路抑制劑(SB203580)對肝癌MHCC97H細胞增殖和轉移的影響 與Con組比較，SB203580組肝癌MHCC97H細胞中p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白表達水平明顯降低，肝癌細胞活性明顯降低，肝癌細胞克隆形成數(shù)明顯減少，細胞劃痕愈合率明顯降低，侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。見圖4、圖5、表3、圖6。

表2 過表達lncRNA NBAT1對肝癌MHCC97H細胞MAPK通路的影響

圖4 兩組信號通路相關蛋白表達

圖5 MAPK通路抑制劑對肝癌MHCC97H細胞克隆形成的影響(結晶紫染色)

表3 MAPK通路抑制劑對肝癌MHCC97H細胞MAPK信號通路及對細胞增殖、遷移的影響

圖6 MAPK通路抑制劑對肝癌MHCC97H細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)的影響

3 討 論

隨著醫(yī)學水平的進步，腫瘤治療手段增加，靶向治療正成為新的治療手段，其在肝癌中已有所應用，但仍需開發(fā)新的分子靶點〔12，13〕。lncRNA作為一種非編碼RNA，其影響多種腫瘤進展，可作為分子靶點及生物標志物〔14〕。研究報道膠質母細胞瘤組織中NBAT1的表達低于正常腦組織，與惡性程度呈負相關；NBAT1上調通過調節(jié)蛋白激酶(Akt)抑制T98和U87細胞增殖〔15〕。lncRNA NBAT1通過miR-346/糖原合成酶激酶(GSK)-3β軸抑制腎癌細胞增殖和遷移〔16〕。lncRNA NBAT-1過表達可抑制A549細胞增殖和細胞周期，促進A549細胞凋亡〔17〕。本研究結果顯示，lncRNA NBAT1表達水平低于癌旁組織，過表達lncRNA NBAT1可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，NBAT1在肝癌中也起抑癌基因作用。

lncRNA可通過調節(jié)細胞間信號轉導參與肝癌的生物學過程，如LINC00978通過激活MAPK/ERK途徑來促進肝癌細胞增殖、細胞周期進程和存活〔18〕。沉默lncRNA同源框基因口簇反義核糖核酸(HOXD-AS)1可通過MEK/ERK途徑抑制肝癌細胞的增殖，細胞周期進程，遷移和侵襲〔19〕。lncRNA鋅指結構反義轉錄本(ZFAS)1通過microRNA-624/肝素結合細胞因子(MDK)/ERK/JNK/p38信號通路增強肝細胞癌的發(fā)展〔20〕。以上均表明lncRNA可通過調控MAPK通路影響肝癌進展。本研究表明抑制MAPK通路激活可抑制肝癌進展。有研究報道，NBAT-1可能通過靶向ERK1/2和Akt信號傳導途徑抑制卵巢癌的發(fā)生〔21〕。為研究NBAT1是否在肝癌中影響MAPK通路，本研究結果表明，過表達NBAT1抑制了MAPK通路。

綜上，過表達lncRNA NBAT1可能通過抑制MAPK通路抑制肝癌增殖和轉移。