王玲 楊馥宇 黃超

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 1呼吸科，河北 唐山 063000；2眼科)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)主要是間歇性缺氧，可導(dǎo)致多系統(tǒng)損害，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)，備受人們的關(guān)注〔1〕。體外動(dòng)物試驗(yàn)顯示間歇低氧可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，是神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要機(jī)制之一〔2〕。同時(shí)間歇低氧可引起神經(jīng)細(xì)胞自噬的出現(xiàn)〔3〕。既往對(duì)間歇低氧早期導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡及自噬已有相關(guān)報(bào)道，但罕有應(yīng)用臨床藥物干預(yù)來(lái)探討早期間歇低氧損傷后自噬在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用臨床上氧自由基清除劑依達(dá)拉奉干預(yù)，探討依達(dá)拉奉對(duì)早期間歇低氧大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑 自噬效應(yīng)蛋白(beclin)-1及微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ兔抗鼠多克隆抗體、免疫球蛋白(Ig)G羊抗兔單克隆抗體、PV6001試劑盒均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，TUNEL試劑盒由瑞士Roche公司提供，H-7650透射電鏡由日本日立公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 96只雄性Wistar大鼠，采用隨機(jī)表法分為對(duì)照組、5%間歇低氧(IH)組及依達(dá)拉奉(ED)組，每組又分為1 d、3 d、7 d、14 d 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。

1.3動(dòng)物模型的制備 5%IH組大鼠實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)首先注入流速為10 L/min的氮?dú)?0 s，使試驗(yàn)箱內(nèi)的氧濃度降至5%，半分鐘后注入流速為10 L/min的空氣40 s，使氧濃度至21%，再注入50 s的空氣，流速改變?yōu)? L/min，使氧濃度維持21%。按上述操作，每2 min為1個(gè)周期循環(huán)。ED組大鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉(3 mg/kg)，30 min后置于低氧箱內(nèi)，與IH組大鼠實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)持續(xù)注入流速為3 L/min的空氣，氧濃度保持在21%。以上3組實(shí)驗(yàn)均每日進(jìn)行8 h，持續(xù)進(jìn)行1 d、3 d、7 d、14 d。

1.4透射電鏡標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉及灌注固定術(shù)后，于冰上取出海馬組織，修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，分別進(jìn)行預(yù)固定(2.5%戊二醛，時(shí)間為4 h)、固定(1%鋨酸緩沖液，時(shí)間為2 h)。固定結(jié)束后，進(jìn)行脫水、包埋、超薄切片、染色等步驟，最后于電鏡下攝片。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 腦組織經(jīng)脫水、透明、包埋等步驟后進(jìn)行切片，供組織化學(xué)法應(yīng)用。按PV法進(jìn)行組織化學(xué)法操作步驟，將切好的完整切片脫蠟、脫水、高壓修復(fù)后，分別滴加一抗(beclin-1兔抗大鼠抗體、LC3-Ⅱ兔抗大鼠抗體)，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，滴加二抗等，按二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒操作步驟進(jìn)行顯色后，進(jìn)行脫水、透明、封片。

1.6Tunel法計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況 海馬組織切片進(jìn)行脫蠟、脫水后經(jīng)3%濃度的過(guò)氧化氫(H2O2)室溫浸泡、TBS溶液漂洗、加入蛋白酶K工作液、TBS溶液漂洗、加入TUNEL工作液、TBS溶液漂洗、加入山羊血清工作液進(jìn)行封閉、加入POD-轉(zhuǎn)化液等，按試劑盒操作步驟進(jìn)行顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，最后進(jìn)行攝片。應(yīng)用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行分析，神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻，線粒體、高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組比較，5%IH組從間歇低氧損傷3 d開(kāi)始逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元變形腫脹，核膜模糊，染色質(zhì)密度欠均勻，線粒體空泡化、嵴出現(xiàn)斷裂，激活溶酶體，出現(xiàn)自噬小體，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷越重；與5%IH組比較，ED組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，自噬小體數(shù)目增多。見(jiàn)圖1。

圖1 透射電鏡下觀察各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×15 000)

2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá) 對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較少，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，5%IH組及ED組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)量顯著增多(P<0.05)；與5%IH組比較，ED組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1、LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量顯著增多(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2、圖3。

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)比較

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察3組不同時(shí)間點(diǎn)beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)(免疫組織化學(xué)法，×400)

2.3TUNEL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況 對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡較少，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，5%IH組及ED組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞AI顯著增加(P>0.05)；與5%IH組比較，ED組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞AI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 TUNEL法檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞AI的比較

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況(TUNEL染色,×400)

3 討 論

OSAHS主要是指睡眠過(guò)程中反復(fù)出現(xiàn)上氣道阻塞，引起睡眠暫停及低通氣，進(jìn)而導(dǎo)致一系列臨床癥狀及并發(fā)癥〔4〕。研究證實(shí)間歇低氧可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害，且機(jī)制復(fù)雜多樣。其中間歇低氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)受損的重要機(jī)制之一〔5〕。細(xì)胞凋亡受多種因素的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞的程序性死亡，凋亡與自噬密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡受自噬活性的調(diào)節(jié)〔6〕。在腦缺血、腦創(chuàng)傷等神經(jīng)損傷中自噬均被激活，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。beclin-1及 LC3-Ⅱ均是特異的自噬診斷指標(biāo)，分別是酵母中作為自噬密切相關(guān)基因Atg6及Atg8在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的同源物〔7〕。在對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，間歇性缺氧誘導(dǎo)了自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，進(jìn)而激活自噬〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，間歇低氧早期促進(jìn)了大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3-II的表達(dá)，誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

依達(dá)拉奉是臨床常用的一種抗氧化劑及氧自由基清除劑，廣泛應(yīng)用于腦梗死等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔9〕。通過(guò)模擬OSAHS發(fā)病機(jī)制制備間歇低氧模型，發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)間歇低氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用〔10〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，依達(dá)拉奉能明顯減少間歇低氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，但依達(dá)拉奉對(duì)間歇低氧自噬的影響研究尚少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：依達(dá)拉奉可提高早期間歇低氧大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這與既往對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血中依達(dá)拉奉對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元自噬及凋亡影響研究結(jié)果一致〔11〕。

綜上所述，間歇低氧早期可導(dǎo)致神經(jīng)元自噬及凋亡的出現(xiàn)，應(yīng)用依達(dá)拉奉治療后，可提高大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床早期治療OSAHS提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。