王瑜 梁超 王寶愛 徐玉婷

(?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院,海南 ?？?570216)

缺血性腦卒中的發(fā)病率和死亡率很高，危及人類健康，是全球性的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)美國心臟協(xié)會發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，每年在美國大約有795 000例患者被診斷出患有新發(fā)或復發(fā)性腦卒中。平均而言，每40 s就有1例患者被診斷為腦卒中，每4 min就有1例患者死于該病。腦卒中的死亡率為60%，而缺血性腦卒中約占所有腦卒中病例的87%〔1〕。在老年人群體中，腦缺血卒中給患者造成的影響是巨大的。越來越多的證據(jù)表明，腦卒中發(fā)作可以觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和全身免疫系統(tǒng)內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應，這是缺血性腦卒中病理進展的關鍵因素〔2〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路在細胞增殖、炎癥、分化和細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用〔 3〕。 減少腦缺血性腦卒中的細胞凋亡和炎癥反應對于缺血性腦卒中的改善和治療可能至關重要。有研究表明PI3K/Akt信號通路的激活與缺血/再灌注損傷的保護有關〔4〕。白藜蘆醇是一種在葡萄、漿果、花生和其他植物中發(fā)現(xiàn)的天然多酚，由于其在許多疾病中作為預防和治療劑的潛在用途而受到廣泛關注〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制神經(jīng)炎癥來調(diào)節(jié)血漿和腸黏膜細胞因子〔包括白細胞介素(IL)-10和IL-17A〕的水平對急性腦卒中發(fā)揮保護作用〔6〕。有研究表明，白藜蘆醇可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制骨關節(jié)炎相關炎癥的發(fā)展〔7〕。本研究探討白藜蘆醇激活PI3K/Akt信號通路抑制血清中炎癥因子IL-6和IL-1β的分子機制。

1 材料和方法

1.1實驗細胞株和主要試劑 21月齡雄性SD大鼠均購買于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(1%，BP-DL511，南京森貝伽生物科技有限公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1088，碧云天)；IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(ab178013)、IL-1β ELISA試劑盒(ab214025)、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體、二抗山羊抗兔IgG均購自Abcam公司。

1.2缺血性腦卒中大鼠模型構(gòu)建 36只大鼠飼養(yǎng)于無特殊病原體級層流架上，恒溫(24～26)℃，恒濕(45%～55%)，飼料、飲用水均經(jīng)高溫消毒后使用，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。分組：Control組(正常大鼠)、大腦中動脈閉塞(MCAO)組、白藜蘆醇〔25 mg/(kg·d)處理〕組各12只，線栓法建立MCAO模型：大鼠用2%戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉固定，自頸部行1 cm長切口，暴露左頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端；在頸總動脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)，將線栓從頸外動脈插入頸內(nèi)動脈進而到達大腦中動脈 (深度約12.0 mm)，血管阻塞1 h后拔出線栓，縫合皮膚。Control組只進行手術操作，不插入線栓，作為對照。整個手術過程平均15 min完成，術后保持大鼠體溫，自由飲水、進食。

1.3老年腦缺血卒中大鼠模型構(gòu)建的評價 TTC染色評價腦梗死體積。缺血24、48 h后，用2%戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉后處死動物?？焖偃〕瞿X組織，以1 mm的間隔進行冠狀切片，用2%的TTC染色。梗死體積的計算方法是將所有截面的梗死面積相加，再乘以總厚度。每組取6只大鼠進行評估計算后取平均值。一般神經(jīng)系統(tǒng)行為學評分。灌注后24、48 h，根據(jù)一般神經(jīng)系統(tǒng)評分評估神經(jīng)系統(tǒng)評分。在一般評分中，評估以下6項一般神經(jīng)功能：頭發(fā)狀況(0～2分)，耳朵位置(0～2分)，眼睛狀況(0～4分)，自發(fā)活動(0～4分)，姿勢(0～4分)，癲癇行為(0～12分)，每組取6只大鼠進行評估計算后取平均值。統(tǒng)計以雙盲方式進行，統(tǒng)計人員未參加建模，不知曉分組信息。

1.4ELISA 術后10 d冰上提取Control組大鼠腦組織和MCAO組大鼠梗死周圍區(qū)的皮層腦組織，按1∶10比例加入預冷的勻漿緩沖液，冰上研磨為組織勻漿后離心取上清液。采用IL-6和IL-1β ELISA試劑盒對各組大鼠腦組織培養(yǎng)上清炎癥因子進行檢測，試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司，按照說明書進行操作，用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。酶標儀 (BioTek，USA) 測定450 nm波長下測定吸光光度度值，并計算炎癥因子濃度。重復3次平行實驗。

1.5TUNEL染色實驗 取大鼠腦組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，3% H2O2溶液中室溫浸泡10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，加入50 μl 20 μg/ml的蛋白酶K (Sigma，USA)，室溫20 min去除組織蛋白。PBS洗3次，5 min/次。加入檸檬酸鹽，抗原修復30 min，PBS洗2次，5 min/次。加50 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)酶反應液，37°C避光1 h，以不含TdT酶的反應液為陰性對照，PBS洗3次，5 min/次。滴加50 μl過氧化物酶標記的抗地高辛(anti-digoxigenin)，37℃避光反應30 min，PBS洗3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB,ZSGB-BIO，China)顯色10 min，PBS漂洗3次后，蘇木素復染后在顯微鏡 (Nikon，Japan) 下觀察并拍照。

1.6Western印跡檢測 組織加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，用二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒進行定量，定量之后加入10 μl上樣緩沖液95℃煮10 min后即可上樣跑膠，于100 V泳道進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；封閉液〔5%牛血清白蛋白(BSA)/TBST〕封閉60 min，加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體，4℃過夜。一抗孵育完畢后，用1×TBST溶液室溫下?lián)u床搖動洗膜，5 min×3次，加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG H&L(辣根過氧化酶)，室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行發(fā)光反應，觀察Western印跡，并進行圖像分析，實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇降低腦缺血卒中腦梗死面積 TTC染色檢測24 h和28 h腦組織結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組腦梗死面積顯著增多，和MCAO組相比，白藜蘆醇處理組腦梗死面積降低，說明白藜蘆醇降低腦缺血腦卒中腦梗死面積。見圖1。

2.2神經(jīng)行為學評分檢測 神經(jīng)行為學評分結(jié)果顯示，與Control組〔(1.33±0.52)分〕相比，MCAO組神經(jīng)行為學評分〔(19.34±1.96)分〕明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組神經(jīng)行為學評分〔(14.33±1.02)分〕明顯降低(P<0.05)，說明白藜蘆醇降低腦缺血卒中神經(jīng)病理機制。

2.3白藜蘆醇降低老年缺血性腦卒中大鼠血清IL-6和IL-1β的表達水平 ELISA結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組血清IL-6和IL-1β表達水平明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組血清IL-6和IL-1β表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

1～3：Control組、MCAO組、白藜蘆醇組；圖3同

表1 各組血清IL-6和IL-1β表達水平及PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平比較

2.4白藜蘆醇降低老年缺血性腦卒中腦組織凋亡水平 與Control組相比，MCAO組腦組織凋亡水平明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組腦組織凋亡水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組腦組織凋亡水平(TUNEL染色，×400)

2.5白藜蘆醇激活PI3K/Akt信號通路 Western印跡結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt表達水平明顯降低(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表達水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達

3 討 論

腦卒中是全球第二大死亡原因，其特征是高發(fā)病率致殘疾和死亡率。發(fā)生在大腦某些區(qū)域的腦血流量不足時，導致神經(jīng)功能障礙，已被列為世界范圍內(nèi)最常見的死亡和死亡原因之一〔8〕。缺血性腦卒中嚴重威脅著人類的生命和健康，并給家庭造成了沉重的負擔〔9〕。腦缺血后，活化的免疫細胞和相關的細胞因子不僅可以加重缺血性腦損傷，還可以促進組織修復。鑒于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身修復的能力有限，繼發(fā)免疫反應的調(diào)節(jié)可有效改善缺血性腦卒中。Wytrykowska等〔10〕研究表明，與對照組相比，缺血性腦卒中患者血清中有較高的IL-1β和IL-6水平。

白藜蘆醇被歸類為植物雌激素，其結(jié)構(gòu)類似于雌二醇，并且通過與雌激素受體a和b結(jié)合而發(fā)揮作用〔11〕。白藜蘆醇已被證明可以減少腦卒中前和(或)后的腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔12〕，這些神經(jīng)保護作用與該藥的抗氧化、抗感染和抗凋亡特性有關。此外，白藜蘆醇與雌激素受體的結(jié)合已經(jīng)與其對缺血性腦的保護作用聯(lián)系在一起。Lara等〔13〕研究表明，白藜蘆醇和丙戊酸的結(jié)合可以顯著減少了梗死體積及神經(jīng)功能缺損。Yu等〔14〕研究表明，白藜蘆醇預處理可顯著改善腦卒中后體內(nèi)和體外的神經(jīng)功能，減少梗死體積，增強活力并減少神經(jīng)元的凋亡。Koronowski等〔15〕研究表明，白藜蘆醇可以通過神經(jīng)元調(diào)節(jié)腦糖酵解功能中的新作用，構(gòu)成缺血耐受的強大神經(jīng)保護機制及Ⅲ類去乙?；?SIRT)1在腦中介導的代謝適應。

PI3K/Akt信號傳導途徑是重要的存活和抗凋亡信號傳導途徑，在細胞凋亡、存活、增殖、細胞骨架變化及其他活動中起著重要的生物學功能〔16〕。Peng等〔17〕研究表明，在缺血性腦卒中，miR-221在患者中被下調(diào)，并通過調(diào)節(jié)磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)/PI3K/Akt途徑促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的功能，木犀草素可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和激活PI3K/Akt信號通路具有治療缺血性腦卒中的潛力〔18〕。Fan等〔19〕發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中是世界上嚴重殘疾的主要原因，與感覺運動和認知功能障礙的高發(fā)有關，S-奧拉西坦(ORC)可以減少TUNEL陽性細胞，增加細胞活力，降低血清乳酸脫氫酶(LDH)活性，通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制細胞凋亡率。二氫辣椒素(DHC)通過PI3K/Akt調(diào)節(jié)大鼠缺血性腦卒中后增強亞低溫誘導的神經(jīng)保護作用〔20〕。趨化因子蛋白(CXCL)8的功能性抑制通過調(diào)節(jié)缺血性腦卒中小鼠的PI3K/Akt/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號傳導途徑來促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化并抑制神經(jīng)炎癥〔21〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能使腦梗死面積降低，神經(jīng)行為學評分降低，大鼠血清IL-6和IL-1β降低，腦組織凋亡水平降低及腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表達水平升高。白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt信號通路調(diào)控老年缺血性腦卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量的分子機制，為老年缺血性腦卒中的治療提供了新的研究思路。