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        HA復(fù)合β-TCP在新西蘭兔上頜竇提升術(shù)中的成骨及成血管效果

        2023-02-11 02:10:14張艷波霍峰王雪峰韓尚志張興樂王鵬
        中國老年學(xué)雜志 2023年3期
        關(guān)鍵詞:上頜成骨動(dòng)物

        張艷波 霍峰 王雪峰 韓尚志 張興樂 王鵬

        (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,河北 承德 067000)

        由社會(huì)老齡化、面部創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天性畸形及炎癥等因素導(dǎo)致的上頜后區(qū)骨量不足以致牙槽骨骨缺失是口腔臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)之一。在上頜竇提升術(shù)中,有效的修復(fù)及重建骨缺損是使患者免于疾病困擾的慣用治療方案〔1〕。研究顯示〔2〕,自體骨移植修復(fù)材料能明顯促進(jìn)骨的再生和愈合,是修復(fù)缺失骨的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是該方法需要從患者身體其他部位獲取,患者要承受新的疼痛或者神經(jīng)創(chuàng)傷,誘發(fā)較為強(qiáng)烈的炎性應(yīng)激等并發(fā)癥,并且由于自體骨的增殖能力有限,難以滿足臨床上較大的骨需求量。大量的臨床數(shù)據(jù)顯示〔3〕置入式骨替代材料在硬組織修復(fù)中具有潛在的廣闊前景。研究顯示〔4〕羥基磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)等替代骨材料常被骨外科醫(yī)師用于骨增量手術(shù)中。有研究報(bào)道〔5〕,HA具有明顯的生物相容性優(yōu)勢,可為骨再生提供較為穩(wěn)定的支架作用,但是其被生物降解的過程緩慢,嚴(yán)重影響初期骨的形成。有研究報(bào)道稱〔6〕,β-TCP在骨組織修復(fù)中顯示了更好的生物降解速率,但其作為支架作用的缺點(diǎn)同樣較為明顯,無法在3~6個(gè)月的骨組織重建過程維系骨替代材料降解與成骨過程的平衡。Sakamoto等〔7〕研究表明將HA復(fù)合β-TCP應(yīng)用到骨重建術(shù)中,顯示了較為滿意的成骨效果。但是HA復(fù)合β-TCP材料用于上頜骨的修復(fù)的報(bào)道較少。本研究探討HA復(fù)合β-TCP對(duì)新西蘭大白兔上頜竇提升術(shù)中的成骨和成血管的影響。

        1 材料和方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器 動(dòng)物:雌性,SPF級(jí),3月齡,體重(2.5±0.5)kg,31只,健康新西蘭大白兔,采購自河北省望都縣彤輝養(yǎng)殖有限公司,動(dòng)物的許可證號(hào):SCXK(冀)2016-002,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(冀)2017-001。在承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)房中,恒溫恒濕條件下,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由飲水,單籠飼養(yǎng),至少進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究的實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求,已獲取承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。主要試劑:HA復(fù)合β-TCP(HA和β-TCP的比例為3∶7)購自國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)中心。β-TCP、麻醉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS,北京Solarbio公司),兔抗大鼠GAPDH(北京博奧森生物技術(shù)公司);蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(美國Amresco公司),免疫組化、Western印跡試劑盒(美國millipore公司),茜素紅、油紅O染色試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。主要儀器:掃描電鏡(日本HITACHI 公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠),F(xiàn)ACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀、凝膠電泳儀(美國BD公司)。

        1.2電鏡觀察HA復(fù)合β-TCP生物材料的特性 在實(shí)驗(yàn)前將無菌真空包裝的HA復(fù)合β-TCP材料切成直徑3 mm,高度為5 mm的形狀,電鏡下觀察復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。

        1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分

        1.3.1新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分離、鑒定與培養(yǎng) 取1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,靜脈注射30 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉后,剝離大白兔的股骨〔8〕,PBS沖洗3次,將沖洗出來的骨髓離心,棄上清,以濃度為15%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1 d更換一次培養(yǎng),并在顯微鏡下隨時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長變化當(dāng)細(xì)胞的生長密度超過90%時(shí),0.25%胰酶消化,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BMSCs的表面抗原鑒定通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行,胰酶消化細(xì)胞后,1 500 r/min離心3 min,PBS洗滌,以100 μl的PBS重懸細(xì)胞,加入一抗(CD29、CD34、CD44、CD45),室溫下孵育30 min,PBS沖洗3次,加入二抗,避光孵育2 h,F(xiàn)ACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀檢測〔9〕。

        1.3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs的生長活性的影響 胰酶消化細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,將細(xì)胞分為空白組(不進(jìn)行任何處理)、對(duì)照組(細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加1%的β-TCP后培養(yǎng))〔10〕、實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加1%的HA復(fù)合β-TCP材料),每組設(shè)18個(gè)復(fù)孔,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,接著每孔加入100 μl的CCK-8工作液,室溫孵育1 h,使用酶標(biāo)儀〔11〕在12、24、36、48、60、72 h時(shí)各取3個(gè)孔測量D450。

        1.3.3HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs的成骨分化的影響 胰酶消化細(xì)胞后,更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基同時(shí)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,分組同1.3.2,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1 d更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)14 d后,按茜素紅、堿性磷酸酶染色試劑盒〔12〕,染色,封片,顯微鏡下觀察BMSCs的成骨和成血管狀況。

        1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分

        1.4.1新西蘭大白兔的上頜竇提升術(shù) 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組,每組10只;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食禁水12 h后,耳靜脈注射戊巴比妥鈉將動(dòng)物麻醉后〔13〕,嚴(yán)格按手術(shù)要求在鼻部術(shù)區(qū)備皮,消毒,與動(dòng)物鼻后1.5 cm處行縱行切口,在無菌顯微剪的幫助下,分開兩側(cè)皮膚,暴露大白兔的鼻翼區(qū),使用環(huán)形去骨鉆在上頜竇頂壁制備以直徑為0.5 cm的骨窗,取下骨片,分開上頜竇黏膜,復(fù)制出5 cm×5 cm×5 cm的空間:空白組在該處填充醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿;對(duì)照組在該處填充1%β-TCP、醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿;實(shí)驗(yàn)組在該處填充1%的HA復(fù)合β-TCP材料、醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿,蓋上自體骨,縫合骨膜,肌注20萬U的青霉素防止感染。

        1.4.2HE染色檢側(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上頜竇組織的形態(tài)改變 所有大白兔在術(shù)后單籠,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)28 d后,處死動(dòng)物,無菌分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上頜竇組織。以多聚甲醛固定, 置于脫鈣液中3個(gè)月,每3 d更換脫鈣液,待醫(yī)用大頭針能輕易穿刺標(biāo)本后〔14〕,脫水,切片,HE染色,顯微鏡下觀察標(biāo)本中的成骨和成血管情況。

        1.4.3免疫組化檢側(cè)各組標(biāo)本中的微血管密度(MVD) 待各組標(biāo)本脫鈣后,常規(guī)脫水,切片,采用檸檬酸鹽緩沖液高溫修復(fù)抗原,5%山羊血清封閉,加入一抗CD31(1∶500)〔15〕,4℃孵育過夜,加入二抗,PBS潤洗3次,蘇木精復(fù)染, 二甲苯脫水,封片,上鏡檢測。

        1.4.4Western印跡檢測各組標(biāo)本中成骨相關(guān)蛋白成骨基因特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨橋蛋白(OPN)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)水平 待各組標(biāo)本脫鈣后,經(jīng)常規(guī)裂解、勻漿、離心后,測定蛋白濃度,電泳分離,轉(zhuǎn)模、封閉〔12〕,滴加一抗(均為1∶500),4℃孵育過夜,次日清洗后加入二抗(均為1∶1 000),顯色,凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值〔16〕,參照GAPDH的表達(dá)計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

        1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析,t檢驗(yàn),作圖工具采用Graphpad5.01。

        2 結(jié) 果

        2.1電鏡下觀察復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu) 掃描電鏡觀察顯示,HA復(fù)合β-TCP材料內(nèi)部的微孔(直徑300~500 μm)和超微孔(直徑1 μm)數(shù)量豐富,孔徑率在85%左右,視野中的微孔均在內(nèi)部鏈接緊密,為新血管以及骨骼的形成提供足夠的空間和營養(yǎng),見圖1。

        2.2BMSCs的培養(yǎng)與鑒定 光學(xué)顯微鏡下,BMSCs多為長梭形、橢圓形或多邊形,貼壁生長呈現(xiàn)旋渦狀、魚群狀排列;BMSCs表面陽性標(biāo)記物CD29(62.78±2.94)%,CD44(93.73±9.18)%,呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài),而CD34,CD45均為陰性表達(dá),這些結(jié)果說明所提取的細(xì)胞為BMSCs,見圖2。

        2.3HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs的生長活性的影響 3組細(xì)胞的OD值無明顯差異(P>0.05),說明3組細(xì)胞的生長的增殖活性趨于一致,進(jìn)而顯示HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs無毒性,見表1。

        圖1 電鏡掃描生物材料的微觀結(jié)構(gòu)

        圖2 BMSCs的培養(yǎng)與鑒定

        表1 各組細(xì)胞的OD值

        2.4HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs的成骨分化的影響 空白組細(xì)胞中未見明顯的礦化結(jié)節(jié),對(duì)照組細(xì)胞中可見少量的礦化結(jié)節(jié),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可見較多的礦化結(jié)節(jié),3組細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量的差異具有統(tǒng)計(jì)意義(均P<0.05),見圖3,表2。

        圖3 各組BMSCs茜素紅染色(×400)

        2.5HA復(fù)合β-TCP材料對(duì)BMSCs的成骨中血管生成的影響 空白組細(xì)胞中未見明顯的咖啡色顆粒,對(duì)照組細(xì)胞中可見少量的咖啡色顆粒,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可見較多的咖啡色顆粒,與空白組相比,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高(均P<0.05),見表2,圖4。

        表2 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、堿性磷酸酶的陽性比例比較

        圖4 各組BMSCs堿性磷酸酶染色(×400)

        2.6HE染色檢側(cè)各組上頜竇組織的形態(tài)改變 空白組動(dòng)物的標(biāo)本中結(jié)締組織大量生成,視野中出現(xiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤,雖有少量骨質(zhì)新生,但未見明顯的骨小梁;對(duì)照組動(dòng)物的上頜竇組織標(biāo)本中新生骨質(zhì)量明顯增多,新生骨質(zhì)見可見少量的血管生成和骨小梁;實(shí)驗(yàn)組中新生骨質(zhì)量較對(duì)照組明顯增多,新生血管數(shù)量明顯增多,炎性浸潤的細(xì)胞明顯減少,視野中的骨小梁的數(shù)量明顯增多,見圖5。

        2.7免疫組化檢側(cè)各組標(biāo)本中的MVD 與空白組相比,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組上頜竇組織中的MVD明顯增多;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組上頜竇組織中的MVD明顯增多(均P<0.05),見圖6,表3。

        2.8Western印跡檢測各組標(biāo)本中Runx2、OPN、VEGF蛋白表達(dá) 與空白組相比,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達(dá)明顯升高;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達(dá)明顯升高(均P<0.05),見表3,圖7。

        圖5 各組上頜竇組織形態(tài)(HE染色,×200)

        圖6 各組上頜竇組織MVD(HE染色,×200)

        表3 各組上頜竇組織中MVD、Runx2、OPN、VEGF相對(duì)表達(dá)比較

        圖7 Western印跡檢測各組相關(guān)蛋白表達(dá)

        3 討 論

        臨床上常采用骨移植、牽張成骨刺激、牽拉成骨促進(jìn)骨再生等手段中的一種或者多種方法聯(lián)合應(yīng)用以治療各種原因造成的骨缺損,由于當(dāng)今醫(yī)療技術(shù)的限制及患者所能承擔(dān)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)限制,這些干預(yù)手段但現(xiàn)在尚未達(dá)到令人欣慰的效果。但是在一些涉及因癌癥切除、外科創(chuàng)傷、先天性畸形而造成的頜面骨缺失的患者中,骨組織的修復(fù)及重建是提高患者身心健康及生命質(zhì)量的重要途徑。研究顯示〔17〕,自體骨移植、同種異體骨移植及填充骨替代材料是治療頜面骨缺損的主要手段,但是由于自體骨移植、同種異體骨移植固有局限性和技術(shù)要求的嚴(yán)格性,臨床醫(yī)師對(duì)這些手段的實(shí)用性和療效保留較大的爭議。得益于當(dāng)代生物材料、檢測技術(shù)及有限元建模等技術(shù)的突破性進(jìn)展,填充骨替代材料成為解決臨床醫(yī)師困擾的最具前景的手段。

        目前骨移植替代材料領(lǐng)域的發(fā)展迅速,如膠原、陶瓷、磷酸鈣水泥、β-TCP等。研究顯示〔18〕β-TCP因與骨骼具有相比的成分,在臨床的骨組織修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。Goodarzi等〔19〕通過X射線對(duì)β-TCP納米級(jí)復(fù)合材料進(jìn)行表征,結(jié)果顯示β-TCP納米材料的微孔及孔徑均極大提高了大鼠BMSCs的體外相容性,增強(qiáng)細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性。Hojo等〔20〕研究報(bào)道將β-TCP/膠原蛋白復(fù)合材料用于犬無骨膜壓槽骨缺損模型中,在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)β-TCP能明顯增加成骨的面積,顯示了強(qiáng)勁的促進(jìn)骨再生和牙槽吸收的效用。Costa等〔21〕研究顯示作為生物活性材料,替代骨材料β-TCP在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生成過程中,一方面能明顯降低機(jī)體的免疫原性和排斥反應(yīng),另一方面其特有的超微孔結(jié)構(gòu)能明顯促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖,募集和分化。但是Go等〔22〕研究指出由于單一材料理化性質(zhì)難以匹及復(fù)雜的機(jī)體生理變化,需要將β-TCP與其他生物活性相復(fù)合,以彌補(bǔ)其作為支架功能不足的掠食,以發(fā)揮其最大的成骨效用。許多材料如骨傳導(dǎo)性能較好的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、殼聚糖、聚己內(nèi)酯、α-半水硫酸鈣(CSH)、納米HA等復(fù)合材料均已應(yīng)用到這一領(lǐng)域〔23〕。而HA因其具有與人類骨骼組織礦物質(zhì)相類似的成分,優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性能,降低疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)及方便易于結(jié)合性能等優(yōu)勢而被眾多學(xué)者廣泛研究。Nascimento等〔24〕通過對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損的研究指出HA復(fù)合β-TCP材料的應(yīng)用能明顯增強(qiáng)填充物的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,并且保留了原始的移植形狀,促進(jìn)顱骨缺損的修復(fù)。但是有關(guān)HA復(fù)合β-TCP材料在頜面骨缺損修復(fù)的報(bào)道較少。本研究結(jié)果說明生物復(fù)合材料的應(yīng)用能明顯增強(qiáng)BMSCs體外成骨的分化及成血管效用。HA復(fù)合β-TCP材料的應(yīng)用能明顯緩解實(shí)驗(yàn)動(dòng)作缺損灶點(diǎn)的病理損傷,增加血管生成的數(shù)量,增強(qiáng)成骨和成血管相關(guān)蛋白R(shí)unx2、OPN、VEGF的表達(dá)。

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