莊志江 張麗紅 蘭瑞

(1河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病二區(qū)，河南 鄭州 450099；2鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；3河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病五區(qū))

腦梗死即為缺血性腦卒中，在全部腦卒中類型中占比高達85%左右，是臨床最為常見的腦血管疾病〔1,2〕。據(jù)相關(guān)流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中老年人群為腦梗死的高發(fā)群體，近年來我國人口老齡化現(xiàn)象不斷加重，每年新增腦梗死病例數(shù)呈現(xiàn)連年上升趨勢，引起廣大專家學者的關(guān)注〔3,4〕。腦梗死具有發(fā)病急、嚴重程度高、致殘、致死率高、預后差的特點，因此尋找一種安全有效的治療手段對腦梗死治療、預后改善具有重要意義〔5,6〕。有研究表示，西醫(yī)手段治療腦梗死，臨床療效并不十分理想，因此越來越多的專家學者致力于中醫(yī)藥治療腦梗死的研究〔7〕。本研究設計實驗，建立腦梗死大鼠模型，使用清熱熄風活血湯進行干預，探究清熱熄風活血湯干預效果及相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只SD健康雄性大鼠(鄭州大學動物研究院，使用許可證號：SYXK(豫)2018-0004)，8～10周齡，平均(9.0±0.8)周齡；體重225～247 g，平均(235.9±8.8)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.1±2.4)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。主要試劑：兔抗大鼠γ-干擾素(IFN-γ)抗體(Hyclone公司)；大鼠抗小鼠白細胞介素(IL)-2、IL-4抗體(Selleck公司)；兔抗小鼠大鼠總抗氧化能力(TAOC)、一氧化氮(NO)抗體(Gibco公司)；大鼠抗小鼠IL-22、IL-3抗體(BD公司)；小鼠抗兔磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)抗體(Dako公司)。

1.2建模及分組干預 選取10只大鼠作為正常組，其余20只建立腦梗死模型：將建模大鼠在實驗臺固定后麻醉干預，頸部消毒處理后剪開正中位置皮膚，顯微鏡下操作，分離頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，近心端結(jié)扎近端ECA，微動脈夾夾住ICA，結(jié)扎固定CCA，大鼠腦組織中動脈阻斷后去除微動脈夾，根部固定ICA，消毒縫創(chuàng)。建模過程中死亡2只，將其余18只腦梗死大鼠隨機分為腦梗死組、清熱熄風活血湯組各9只。清熱熄風活血湯組使用清熱熄風活血湯進行干預：石決明20 g，茯神、夜交藤各15 g，天麻、鉤藤各12 g，川牛膝、山梔、桑寄生、黃芩、益母草、杜仲各10 g，清水浸泡藥材0.5 h，加水煎1.5 h，取藥汁，對大鼠進行灌胃處理。正常組、腦梗死組均使用同劑量生理鹽水灌胃處理。

1.3指標檢測

1.3.1學習記憶能力、神經(jīng)功能評分 在直徑1.5 m、高0.5 m的圓形水池加半池27℃水，池壁頂端作4個標記點，池水中央放置0.3 m高平臺，分別于各標記點使大鼠入水，記錄所有大鼠入水后到達平臺所用時長，若大鼠2 min后未達到預置平臺，則人工引至平臺，此時潛伏期記為120 s。所有大鼠在預置平臺上停留0.5 min，將其于其他標記點再次置入水中，連測5 d。使用大鼠神經(jīng)功能缺損(mNSS)評分表對大鼠神經(jīng)功能進行評價，評價項目包括運動、感覺、反射、平衡狀況等，最高分18分，評分越低表示大鼠神經(jīng)功能損傷越輕。

1.3.2腦梗死面積、含水量檢測 各組大鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，取出腦組織冷藏，30 min后2 mm厚度切片，添加2%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液進行染色，30 min后使用4%甲醛固定，6 h后拍照、計算梗死面積。含水量：吸取腦組織表面水分后稱重并記錄，使用烤箱將腦組織烤至恒重，稱量腦組織干質(zhì)量，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色 將腦組織固定后浸泡于4%甲醛中1 d，取出后進行石蠟包埋、連續(xù)切片。切片烤干后脫蠟，依次使用不同濃度酒精進行復水處理。蘇木素染色15 min，取出清洗3次，鹽酸酒精分化處理30 s后進行充分清洗，1%伊紅染色，酒精脫水，脫蠟后封片，顯微鏡觀察。

1.3.4輔助性T細胞(Th)1/Th2趨化因子、氧化應激、炎癥反應指標水平檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測：取各組大鼠腹部靜脈血3 ml,2 000 r/min離心15 min后-40℃保存。稀釋標準品、標記酶標板，設置空白孔、標準孔、待測標本孔，并分別加入終止液和顯色劑、標準品、血清標本和抗體，封膜并搖晃均勻，使用37℃保溫箱保存1 h后取出，去膜后清洗，將水分吸干后于各孔中添加顯色劑搖晃均勻，待顯色后加入終止液，以空白孔為基準，使用酶標儀測450 nm處吸光值，計算IFN-γ、IL-2、IL-4、TAOC、活性氧(ROS)、細胞間黏附分子(ICAM)-1、IL-3水平。

1.3.5Western印跡檢測JNK/p38 MAPK通路蛋白相對表達量 提取50 μg蛋白，煮沸至蛋白變性、凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)蛋白分子切開凝膠轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Western封閉液室內(nèi)封閉待測、內(nèi)參蛋白1.5 h，1∶1 000添加待測蛋白抗體，1∶2 000添加內(nèi)參抗體孵育1 d，取出后使用Western洗滌液清洗5次，1∶5 000加入山羊抗兔，Western洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理學觀察 如圖1所示，正常組腦組織細胞細胞核清晰，排列規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)病理改變狀況；腦梗死組腦組織細胞細胞核破裂，排列雜亂，出現(xiàn)間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤情況；清熱熄風活血湯組腦組織細胞腫脹、細胞核破裂、炎性細胞浸潤狀況相對較輕。

圖1 各組腦組織病理學觀察(HE染色，×400)

2.2各組學習記憶能力、神經(jīng)功能評分情況 如表1所示，腦梗死組、清熱熄風活血湯組各時間點逃避潛伏期長于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清熱熄風活血湯組各時間點逃避潛伏期短于腦梗死組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清熱熄風活血湯組mNSS評分低于腦梗死組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.3各組腦梗死面積、腦組織含水量情況 如表1所示，腦梗死組、清熱熄風活血湯組腦組織含水量高于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清熱熄風活血湯組腦組織梗死面積、腦組織含水量均低于腦梗死組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 各組學習記憶能力、神經(jīng)功能評分及腦梗死面積、腦組織含水量比較

2.4各組Th1/Th2趨化因子水平比較 如表2所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風活血湯組IFN-γ水平較低，IL-2、IL-4水平較高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風活血湯組IFN-γ水平較高，IL-2、IL-4水平較低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.5各組氧化應激、炎癥反應嚴重程度對比 如表3所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風活血湯組TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平較高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風活血湯組TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平較低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表2 各組Th1/Th2趨化因子水平比較

2.6各組JNK/p38 MAPK通路蛋白相對表達量對比 如表3、圖2所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風活血湯組p-JNK、p-p38 MAPK表達較高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風活血湯組p-JNK、p-p38 MAPK表達較低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表3 各組氧化應激、炎癥反應嚴重程度及JNK/p38 MAPK通路蛋白相對表達量對比

1～3:正常組，腦梗死組，清熱熄風活血湯組

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者主要臨床表現(xiàn)為頭暈頭痛、偏癱、步態(tài)失常、惡心嘔吐、大小便失禁等，嚴重影響患者身體健康、生命安全〔8,9〕。據(jù)世衛(wèi)組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，腦梗死癥狀具有較高發(fā)病率、復發(fā)率，絕大多數(shù)復發(fā)腦梗死患者會出現(xiàn)終身殘疾，因此對腦梗死進行及時有效的治療，降低腦梗死復發(fā)率對患者預后改善具有重要意義〔10,11〕。介入、溶栓、手術(shù)治療等均為常用的治療腦梗死的手段，但臨床療效并不十分理想。我國傳統(tǒng)中醫(yī)認為腦梗死的主要病機為年老體弱、肝虧腎虛、經(jīng)脈痹阻等，清熱熄風活血湯具有清熱、平肝陽、滋肝補腎的作用。

研究表明，腦梗死患者神經(jīng)功能、認知功能受到明顯損傷，改善患者神經(jīng)功能、認知功能是臨床治療腦梗死、改善患者預后的關(guān)鍵〔12,13〕。本研究說明腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展導致一定程度的認知功能、神經(jīng)功能損傷，使用清熱熄風活血湯進行干預能夠減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷程度，提升大鼠學習記憶能力，具有一定神經(jīng)損傷保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用清熱熄風活血湯進行干預的腦梗死大鼠腦組織梗死面積、含水量明顯下降，進一步體現(xiàn)出清熱熄風活血湯的腦保護作用。

研究表明，Th1/Th2平衡失調(diào)參與腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展〔14〕，IFN-γ、IL-2、IL-4均為Th1/Th2趨化因子，本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠出現(xiàn)Th1/Th2平衡失調(diào)狀況，使用清熱熄風活血湯干預能夠調(diào)節(jié)腦梗死大鼠Th1/Th2平衡，改善大鼠免疫應答。

臨床研究表明，腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著機體腦組織氧化應激損傷、炎癥反應〔15,16〕。腦組織氧化應激、炎癥反應會導致機體腦組織損傷、神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織氧化應激、炎癥反應是治療腦梗死、改善患者神經(jīng)功能和預后的關(guān)鍵〔17,18〕。本研究結(jié)果說明，腦梗死大鼠腦組織出現(xiàn)一定程度的氧化應激損傷及炎癥反應，從而導致腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損。本研究說明，使用清熱熄風活血湯進行干預能夠有效減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應激損傷、炎癥反應，這可能也是清熱熄風活血湯減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損的重要機制之一。

有學者表示，腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)元細胞異常凋亡具有密切聯(lián)系〔19,20〕。JNK/p38 MAPK通路能夠介導神經(jīng)元細胞分化、凋亡，還能夠分化炎性因子，在腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔21,22〕。本研究結(jié)果顯示，使用清熱熄風活血湯進行干預能夠調(diào)控JNK/p38 MAPK通路蛋白表達，抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元細胞凋亡，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重程度，起到腦保護作用。

綜上所述，使用清熱熄風活血湯對腦梗死模型大鼠進行干預，能夠有效改善腦梗死大鼠認知功能、神經(jīng)功能，其作用機制可能是清熱熄風活血湯干預能夠減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應激、炎癥反應，調(diào)控JNK/p38 MAPK通路，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用，為腦梗死的治療提供一定的理論依據(jù)。