張愛萍 劉愛華 惠文鵬

(1濟(jì)南市第四人民醫(yī)院(山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)，山東 濟(jì)南 250000；2山東省第二人民醫(yī)院)

骨質(zhì)疏松(OP)是最常見的全身性骨骼疾病，其特征是骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨脆性增加，易患骨質(zhì)疏松骨折〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有數(shù)百萬的骨折病例，考慮到人口老齡化，預(yù)計(jì)將在未來幾年穩(wěn)步增加，使OP成為全球性健康經(jīng)濟(jì)問題〔2〕。OP早期無明顯癥狀，而當(dāng)骨骼出現(xiàn)疼痛、脆性，體型發(fā)生改變時(shí)，疾病已相當(dāng)嚴(yán)重，患者預(yù)后相對較差〔3〕。因此，早期診斷無疑會(huì)利于OP患者的治療和預(yù)后。近年來，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，為OP診斷提供新的可能。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(LCN)2屬于分泌型糖蛋白之一，與代謝異常類疾病密切相關(guān)〔4〕，研究發(fā)現(xiàn)OP患者血液中LCN2異常表達(dá)，而LCN2基因下調(diào)后，會(huì)顯著影響干細(xì)胞的成骨分化能力〔5〕。脂肪細(xì)胞因子(Apelin)是人類G蛋白受體內(nèi)源性配體的成員，而Apelin-13是Apelin家族中研究最多的成員之一，是糖尿病和肥胖等代謝紊亂性疾病的有益靶點(diǎn)〔6,7〕。吳繼芳等〔8〕以2型糖尿病患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)Apelin-13會(huì)影響其OP發(fā)生?？梢?，LCN2和Apelin-13均有望成為預(yù)測OP發(fā)生的潛在標(biāo)志物。本研究檢測血清LCN2和Apelin-13水平，分析二者用于老年男性O(shè)P早期診斷的價(jià)值。

1 對象和方法

1.1研究對象 選取2018年1月到2020年6月到濟(jì)南市第四人民醫(yī)院檢查的老年男性256例，按照設(shè)定的入排標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選，收集其病史、年齡、身高、體重等基本信息，并進(jìn)行常規(guī)檢查，參考世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦方法診斷OP。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60周歲；(2)無甲狀腺、糖尿病等其他影響骨代謝相關(guān)疾??；(3)無臟器功能嚴(yán)重受損相關(guān)疾??；(4)檢測前半年內(nèi)未服用激素類藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，獲得了所有患者的書面同意。年齡60～88歲，平均(73.43±10.24)歲。所有患者行骨密度(BMD)測定，結(jié)果93例確診為OP，納入為OP組，其他163例為非OP病例，納入為對照組。

1.2試劑與儀器 B超型BMD(古野電氣株式會(huì)社)；Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏公司)；BK400全自動(dòng)生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)驗(yàn)有限公司)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京北利時(shí)代公司)。

1.3研究方法

1.3.1BMD測定 負(fù)責(zé)BMD測量的人員為經(jīng)過培訓(xùn)的?？萍夹g(shù)人員。測量前必須先通過測量標(biāo)準(zhǔn)體模，以確保儀器測量結(jié)果的準(zhǔn)確性；測量時(shí)，調(diào)整患者體位以適應(yīng)不同位置BMD測量；雙側(cè)股骨一般選取股骨頸、大轉(zhuǎn)子、粗隆間進(jìn)行檢測，腰椎骨則選取L1-L4腰椎前后位進(jìn)行檢查。采用OSTEOCORE3雙能X線BMD檢測儀進(jìn)行測定，可通過儀器自帶軟件進(jìn)行結(jié)果計(jì)算和分析。

參照WHO標(biāo)準(zhǔn)〔9〕進(jìn)行評價(jià)，通常用T-Score(T值)表示，代表測得的受試者BMD值與同種族和性別健康成年人的骨峰值之比：BMD正常：T值≥-1.0標(biāo)準(zhǔn)差(SD)；骨量減少：-1.0 SD>T值>-2.5 SD；OP：T值≤-2.5 SD。OP病例為OP組，骨量減少和BMD正常病例納入為對照組。

1.3.2血指標(biāo)檢測 所有患者禁食至少8 h，清晨空腹條件下，采集所有患者靜脈血，采用Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX)、Ⅰ型前膠原氨基端延長肽(PINP)、全段甲狀旁腺素(iPTH)及骨鈣素(OC)水平；血鈣(Ca)、血磷(P)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及胱抑素(Cys)C用BK400全自動(dòng)生化分析儀檢測，采用ELLSA法并嚴(yán)格按照說明檢測血清LCN2及Apelin-13的水平。

1.3.3紅外線治療 對確診為OP的患者采用CQ-61型紅外線治療儀(重慶航天火箭電子技術(shù)有限公司)治療。連接電源，將電源開關(guān)植入開啟狀態(tài)，時(shí)間設(shè)定為20 min?；颊呷∈孢m體位，暴露治療部位，將燈頭中心對準(zhǔn)患者左側(cè)足三里部位，按啟動(dòng)開始治療；治療結(jié)束后再以相同方法重新將燈頭中心對準(zhǔn)患者神闕穴位，再治療20 min。治療結(jié)束后，切斷電源。隔日治療1次，3個(gè)月為1個(gè)療程，連續(xù)治療2個(gè)療程，治療前后測定血清LCN2、ApeLin-13、BMD的水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析、Logistic回歸分析；并通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線分析LCN2、Apelin-13對OP的預(yù)測價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組年齡、CysC及BMD差異顯著(P<0.05)，而體重指數(shù)(BMI)、Ca、P、ALT及AST無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2兩組骨代謝及血清學(xué)指標(biāo)水平比較 與對照組相比，OP組CTX、PINP明顯高于對照組，OC、血清LCN2及Apelin-13明顯低于對照組(均P<0.001)，但兩組間iPTH無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3BMD與各參數(shù)的相關(guān)分析 BMD與老年男性的CTX(r=-0.438，P<0.001)、PINP呈負(fù)相關(guān)(r=-0.326，P<0.001)，與OC(r=0.319，P<0.001)、血清LCN2(r=0.368，P<0.001)及Apelin-13呈正相關(guān)(r=0.451，P<0.001)。

表2 兩組骨代謝及血清學(xué)指標(biāo)水平比較

2.4多因素Logistic回歸分析 以是否發(fā)生OP為因變量，年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、Cys-C(≥1.1 mg/L=1，<1.1 mg/L=0)、CTX(≥600 pg/ml=1，<600 pg/ml=0)、PINP(≥58 ng/ml=1，<58 ng/ml=0)、OC(≥1.0 μg/L=1，<1.0 μg/L=0)、LCN2(≥50.46 ng/L=1，<50.46 ng/L=0)、Apelin-13(≥968.42 pg/ml=1，<968.42 pg/ml=0)為自變量進(jìn)行多因素Logistic分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、CTX、PINP、OC、血清LCN2及Apelin-13均是影響老年男性發(fā)生OP的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 Logistic回歸預(yù)測危險(xiǎn)因素

2.5血清LCN2、Apelin-13預(yù)測老年男性O(shè)P發(fā)生的ROC曲線 以發(fā)生OP賦值為1，未發(fā)生OP賦值為0，繪制預(yù)測OP發(fā)生的ROC曲線。以50.46 ng/L作為血清LCN2的臨界值，結(jié)果其ROC曲線下面積為0.806，預(yù)測的敏感度為76.8%，特異性為77.4%；以968.42 pg/ml作為血清Apelin-13的臨界值，結(jié)果其ROC曲線下面積為0.854，預(yù)測的敏感度為82.9%，特異性為81.6%。見圖1。

圖1 血清LCN2、Apelin-13預(yù)測老年男性O(shè)P發(fā)生的ROC曲線

2.6紅外灸療儀治療前后OP患者血清LCN2、Apelin-13水平變化 OP患者治療后血清LCN2、Apelin-13水平分別為(56.43±6.01)ng/L,(1 121.23±189.81) pg/L，BMD為(1.08±0.13)g/cm2，治療后的LCN2、Apelin-13、BMD水平明顯高于治療前(均P<0.05)。

3 討 論

OP常易引起骨折發(fā)生，常見于脊椎、股骨、肱骨、皮下骨、骨盆和肋骨，OP發(fā)病率在老年人中顯著增加，其引起的骨折與跌倒密切相關(guān)〔10〕。大約30%的65歲以上的老年人每年跌倒一次，其中近10%的患者每年跌倒超過兩次以上〔11〕。跌倒不僅導(dǎo)致患者個(gè)人醫(yī)療成本的增加，也會(huì)導(dǎo)致長期社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本上升，特別是健康醫(yī)療保險(xiǎn)。來自德國的數(shù)據(jù)顯示，OP引起骨折的治療每年花費(fèi)大約110億歐元成本〔10〕。普遍認(rèn)為婦女絕經(jīng)后易患OP，但男性也存在著巨大的患病風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性O(shè)P患者超過50歲后，約22%會(huì)出現(xiàn)骨折〔12〕。不同于女性O(shè)P，男性骨量丟失相對緩慢，癥狀更不明顯，臨床診斷難度更大〔13〕。因此，找到早期預(yù)測發(fā)生OP的生物標(biāo)志物，有助于易感人群提前預(yù)警，減少骨質(zhì)流失并降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。

本研究可見年齡對OP的發(fā)生具有重要影響，而OP組CysC的升高，可能與其抑制骨吸收功能有關(guān)〔14〕，董旋等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，CysC與2型糖尿病患者發(fā)生OP有關(guān)，可能參與調(diào)整其骨骼穩(wěn)態(tài)，但本研究相關(guān)性分析，并未發(fā)現(xiàn)CysC與老年男性BMD的存在明顯相關(guān)性，其機(jī)制仍需更深入研究予以確認(rèn)。骨組織處于不斷轉(zhuǎn)換的新陳代謝過程，舊骨被破骨細(xì)胞吸收，而成骨細(xì)胞不斷產(chǎn)生等量的新骨，在此過程中，骨代謝指標(biāo)起著重要的調(diào)節(jié)功能，早已在OP臨床診斷方面發(fā)揮重要作用〔15〕。在眾多的骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)中，PINP是Ⅰ型膠原的代謝產(chǎn)物，其含量可反饋成骨細(xì)胞合成能力，且不易受激素的影響，其水平增高提示骨代謝疾病加重，用于OP具有敏感性和特異性高的特點(diǎn)；CTX是能夠反映破骨細(xì)胞活性的有效標(biāo)志物，在多種代謝性疾病中發(fā)現(xiàn)CTX水平升高；OC是骨基質(zhì)進(jìn)行礦化的必要物質(zhì)，其水平升高，常見于高轉(zhuǎn)化OP，但在年齡、女性絕經(jīng)等條件下，其水平表現(xiàn)各異〔16〕。本研究說明BMD更低的OP病例血清中CTX、PINP水平升高，這與上述描述相符；而BMD與OC呈正相關(guān)，說明老年男性的OC會(huì)有所下降，罹患OP的風(fēng)險(xiǎn)更高。然而，盡管這些標(biāo)志物在診斷OP領(lǐng)域引入了創(chuàng)新，但仍存在缺乏規(guī)范的參考人群數(shù)據(jù)庫、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化不足等不足，故研究可以單獨(dú)或與現(xiàn)有指標(biāo)結(jié)合使用的新型標(biāo)志物，對于OP臨床診斷實(shí)踐和轉(zhuǎn)化研究意義重大〔3〕。

LCN2是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族的一員，由小分子蛋白組成，其特征是存在3個(gè)保守基團(tuán)，具有與有機(jī)配體結(jié)合的能力，和特定的細(xì)胞表面受體或可溶性大分子形成復(fù)合物〔17〕。LCN2生物作用強(qiáng)大，除與糖、脂代謝相關(guān)外，還可以通過控制食欲而影響脂肪增長，從而間接影響骨代謝，因?yàn)橹敬x與骨代謝本就存在密切聯(lián)系，脂肪組織可通過旁分泌和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)骨代謝〔18〕。另外，循環(huán)系統(tǒng)中的LCN2主要來源于骨，成骨細(xì)胞中LCN2的表達(dá)水平接近白色脂肪細(xì)胞的10倍〔19〕，Mosialou等〔20〕研究表明，成骨細(xì)胞來源的LCN2通過誘導(dǎo)胰島素分泌維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，提高葡萄糖耐受性和胰島素的敏感性。本研究提示LCN2可反映老年男性BMD變化情況，與其骨代謝存在一定相關(guān)性，可能通過影響B(tài)MD而發(fā)揮保護(hù)作用，該結(jié)論與王煒等〔4〕研究結(jié)果相一致。LCN2可能具有抑制形成破骨細(xì)胞并維持骨量穩(wěn)定的作用，對于老年男性，LCN2低表達(dá)，其對破骨細(xì)胞的作用相對較弱，發(fā)生OP風(fēng)險(xiǎn)可能增加。

Apelin為77個(gè)氨基酸組成的不成熟的單肽，是孤兒受體血管緊張素受體AT1相關(guān)受體蛋白的內(nèi)源性配體，并且可以進(jìn)一步衍生出Apelin-36、Apelin-13等多種活性分子，其中Apelin-13是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最活躍和研究最充分的變體〔21〕。研究表明，Apelin-13對于骨骼組織生長具有重要的調(diào)節(jié)功能。Han等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的Apelin-13基因后，其骨膜、骨髓面積明顯減少，loxl3、loxl4等膠原相關(guān)基因及Wnt/β-catenin信號通路均明顯下調(diào)，推測其BMD調(diào)節(jié)作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，增加Apelin-13濃度可使大鼠骨折愈合時(shí)間提前，可能與誘導(dǎo)I型膠原的表達(dá)有關(guān)〔23〕。本研究提示通過檢測血清中Apelin-13也可反應(yīng)OP病變程度，該結(jié)論與范曉霞等〔24〕結(jié)論相符。Apelin-13可能通過表達(dá)，促進(jìn)生成Ⅰ型膠原，借助Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用，但相關(guān)報(bào)道相對較少，仍待更進(jìn)一步研究確認(rèn)其作用機(jī)制。

當(dāng)然，老年男性患者發(fā)生OP的影響因素很多，如生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)多少及疾病狀態(tài)等〔25〕，本研究可見，血清LCN2及Apelin-13對于OP均表現(xiàn)出較強(qiáng)的預(yù)測價(jià)值，可作為新的標(biāo)志物用于老年男性O(shè)P的預(yù)測。

本研究說明LCN2、Apelin-13與OP密切相關(guān)，可作為康復(fù)治療的療效指標(biāo)來評估治療效果。