單曉雪，馬 志，唐顏蘋，楊穎康，顧雨熹，王 錦，陳晉瑩?

（1. 中儲糧成都儲藏研究院有限公司，四川 成都 610000；2. 深圳市賽泰諾生物科技有限公司，廣東 深圳 518108）

真菌毒素是真菌在食品或飼料中滋生所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是農(nóng)產(chǎn)品的主要污染物之一[1-2]，可導(dǎo)致急、慢性中毒，嚴(yán)重時會危及人類和動物的生命安全[3-4]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又稱嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮（ZEN）是最常見的真菌毒素之一，在全世界的谷物及其副產(chǎn)品污染廣泛，主要存在于小麥、玉米和大麥等谷物之中[5-6]。玉米是世界上最重要的食糧之一，同時也是動物飼料必不可少的主要原料[7-8]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，我國飼料用玉米及原料中這兩種毒素檢出率較高，在抽調(diào)樣品中檢出率常在 80%以上[9-11]。故研究建立同時檢測DON和ZEN的快速、穩(wěn)定、科學(xué)的定量分析方法，對于糧食類食品中 DON、ZEN的暴露和風(fēng)險評估與控制具有重要意義。

真菌毒素快速檢測在糧食倉儲、基礎(chǔ)生產(chǎn)等大量應(yīng)用，大多以免疫層析法為主要檢測方法，現(xiàn)有的免疫層析法由于單抗的應(yīng)用，一張試紙只能針對一種真菌毒素實現(xiàn)快檢應(yīng)用，成本較高且效率較低。多毒素試紙條一般價格較高或在其中一種毒素的檢出限較高，毒素含量低時，檢測結(jié)果不穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，我們研發(fā)了高特異性免疫識別真菌毒素快檢試紙條如圖1，在發(fā)光物與抗體構(gòu)建偶聯(lián)過程中，利用超導(dǎo)體材料進行半包被，超導(dǎo)體有極高的導(dǎo)電特性，將發(fā)光物與抗體間靜電荷聚集在抗體側(cè)向吸附，電荷對抗體中雜質(zhì)及蛋白酶產(chǎn)生邊緣控制吸附效應(yīng)，從而提高單抗或者多抗的純度，增加抗體穩(wěn)定度，同時突破性改變免疫法對溫度的耐受，實現(xiàn)了真菌毒素檢測耗材常溫儲存及運輸轉(zhuǎn)變，避免了低溫儲存等苛刻條件帶來的檢測準(zhǔn)確度下降及數(shù)值偏差的風(fēng)險。方便在田間地頭或倉儲糧庫現(xiàn)場應(yīng)用。在提高檢測精準(zhǔn)度、平行性的同時，大大的提高了便利性；超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法可實現(xiàn)玉米中DON、ZEN的快速、定量檢測，在真菌毒素監(jiān)測和各環(huán)節(jié)監(jiān)管中可以快速、高效、準(zhǔn)確的反饋數(shù)據(jù)，為各方?jīng)Q策、導(dǎo)向提供了強有力的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

圖1 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙條Fig.1 The superconductor coated immunofluorescence test strips

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選取的是天然收獲玉米。

嘔吐毒素快速定量檢測卡（2～30 ℃密封儲存）：深圳市賽泰諾生物技術(shù)有限公司；嘔吐毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮毒素免疫親和柱：美國 ROMER公司；低濃度嘔吐毒素玉米質(zhì)控品（472±80 μg/kg）、中濃度嘔吐毒素玉米質(zhì)控品（990±130 μg/kg）、高濃度嘔吐毒素玉米質(zhì)控品（1 845±277 μg/kg）、低濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質(zhì)控品（46.5±6.3 μg/kg）、中濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質(zhì)控品（70.0±11 μg/kg）、高濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質(zhì)控品（108.6±18.8 μg/kg）：青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QD-Infinity系列霉菌毒素快速定量免疫熒光分析儀：深圳市賽泰諾生物技術(shù)有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀，配DAD和FLD檢測器：美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法

取玉米待測樣品500 g，經(jīng)粉碎（研磨）機進行充分粉碎，過20目篩混勻樣品，稱取樣品5 g于50 mL離心管中，加入55%甲醇溶液25 mL，混勻，渦旋震蕩5 min，選擇5 000 r/min離心2 min，收集上層甲醇提取液，移取提取液100 μL與ST緩沖液400 μL振蕩混勻，從中移取75 μL待檢液垂直滴入毒素檢測卡的加樣孔中，靜置反應(yīng)10 min后，檢測卡經(jīng)QD—Infinity快速免疫熒光分析儀檢測分析。

1.3.2 超導(dǎo)體包被免疫熒光的制備

配置質(zhì)控線C、檢測線DON、ZEN的劃線液，C劃線液為0.7 L的0.4 mg/mL兔抗體加上3. 5μL的10%海藻糖和30.8 L的PBS緩沖液的混合液；DON劃線液為2.33 μL的0.8 mg/mL抗DON抗體與32.67 μL PBS的混合液；ZEN劃線液為2.33 μL的0.8 mg/mL抗ZEN抗體與32.67 μL PBS的混合液。再將硝酸纖維素膜貼到 PVC快檢試紙條上，再將貼有PVC板的硝酸纖維素膜放至金標(biāo)劃膜儀上標(biāo)記的指定位置，啟動劃線至貼有PVC板的硝酸纖維素膜上，完成 C-DON劃線環(huán)節(jié)。然后再ZEN劃線，完成后在37 ℃烘箱中烘干12 h，待用。

分別將0.44 μL 18.18 mg/mL羊抗兔抗體、11.11 mg/mL抗DON抗體、抗9.09 mg/mL抗ZEN抗體用0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)整pH為7.4按3∶1∶1進行配置，再放入配置好的金顆粒于旋轉(zhuǎn)盤上旋轉(zhuǎn)混勻15 min。將BSA封閉劑按每1 mL加100 μL的量加入標(biāo)記好的金顆粒中渦旋15 min。再放至冷凍離心機中離心 4 ℃，5 min。取上清液，棄沉淀；再4 ℃離心20 min，棄去上清液，取沉淀物復(fù)溶，用復(fù)溶液按每標(biāo)記1 mL復(fù)溶100 μL的量進行復(fù)溶?；旌蠘?biāo)記好的復(fù)溶金顆粒，羊抗兔抗體、抗ZEN抗體、抗DON抗體混合金顆粒按1∶1∶1進行混合后，取金標(biāo)墊放到金標(biāo)儀標(biāo)記好的指定位置，用磁鐵壓住，以4.5 μL/cm進行噴金。完成后在37 ℃烘箱中烘干12 h。

1.3.3 免疫親和柱液相色譜法

按照國標(biāo)GB 5009.111—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》[12]第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法進行試樣提取、凈化、上機。

按照國標(biāo) GB 5009.209—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》[13]第一法液相色譜法進行試樣提取、凈化、上機。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各組實驗重復(fù)3次，采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，Origin 9.0軟件進行作圖處理，P＜0.05為在統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異，結(jié)果以x±s來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低檢出限和最低定量限

超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢出限與定量限的確定是用連續(xù)獨立測定20份空白樣（天然的陰性玉米樣本），分別按照 IUPAC推薦的公式s+3× b、s+ 10× b計算檢出限與定量限[14]，式中：s為20份空白樣品檢測值的平均值；b為標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)分布見圖2、表1和表2。

圖2 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測20份玉米空白樣品的DON和ZEN的數(shù)據(jù)分布圖Fig.2 DON and ZEN data distribution of 20 blank maize samples detected by superconductor coated immunofluorescence test strip method

表1 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法和液相色譜法測DON的最低檢出限和定量限對比數(shù)據(jù)Table 1 Superconductor coated immunofluorescence test strip method and HPLC method for the measurement of DON’s LOD and LOQ data

表2 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法和液相色譜法測ZEN的最低檢出限和定量限對比數(shù)據(jù)Table 2 Superconductor coated immunofluorescence test strip method and HPLC method for the measurement of EZN’s LOD and LOQ data

由圖2中數(shù)據(jù)可知超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測20份玉米空白樣品中DON的測定值幅度在 14.1～45.8 μg/kg范圍內(nèi)，ZEN的測定幅度在0～5.6 μg/kg范圍內(nèi)，DON和ZEN的測定平均值分別是30.6 μg/kg和1.1 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.96%和1.38%。由表1和表2，可以看出超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法 DON、ZEN雙聯(lián)檢測中DON檢出限和定量限上是低于國家標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法的規(guī)定，ZEN檢出限和定量限略高于國家標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法的規(guī)定。說明超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法在稱取樣品量減少，檢測時間大大縮短的情況下，檢測限量水平同液相色譜法相近。

2.2 準(zhǔn)確性測定

用超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法快速定量檢測系統(tǒng)在相同實驗條件下，使用不同檢測卡檢測同一樣品，分別測定3個毒素含量梯度的玉米質(zhì)控樣，每個樣品平行檢測3次，結(jié)果見表3和表4。

表3 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測玉米質(zhì)控樣的DON含量Table 3 Determination of DON content in maize quality control samples by superconductor coated immunofluorescence test strip method

表4 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測玉米質(zhì)控樣的ZEN含量Table 4 Determination of ZEN content in maize quality control samples by superconductor coated immunofluorescence test strip method

檢測結(jié)果均與質(zhì)控樣的理論值符合率達(dá)100%，質(zhì)控樣品的嘔吐毒素含量重復(fù)測定的變異系數(shù)范圍在1.00%～6.70%之間，玉米赤霉烯酮含量重復(fù)測定的變異系數(shù)范圍在4.87%～6.47%之間，嘔吐毒素平均變異系數(shù)為 3.70%，玉米赤霉烯酮含量重復(fù)測定的平均變異系數(shù)為 5.69%，檢測的準(zhǔn)確度符合實驗要求。

2.3 回收率和方法精密度

在陰性玉米樣品中添加DON標(biāo)準(zhǔn)品和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品制成三個含量梯度的樣品，樣品中DON理論含量分別為 500 μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg、ZEN 理論含量分別為50 μg/kg、100 μg/kg、150 μg/kg，進行回收率和精密度測定，每個梯度測定6次，數(shù)據(jù)分布見圖3。

圖3 超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測加標(biāo)玉米樣品DON和ZEN的回收率分布圖Fig.3 Recovery distribution of DON and ZEN in spiked maize samples detected by superconductor coated immunofluorescence test strip method

取6次結(jié)果的平均值得三個含量梯度的玉米樣品中DON加標(biāo)回收率分別為107.45%、108.17%、103.72%，相對偏差分別為7.45%、8.17%、3.72%，ZEN加標(biāo)回收率分別為 97.81%、111.27%、109.68%，相對偏差分別為2.19%、11.27%、9.68%，符合國標(biāo)定量檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。由圖2箱形圖可以看出，DON和ZEN回收率檢測結(jié)果波動范圍在20%以內(nèi)，回收率范圍均在 80%～120%以內(nèi)，符合加標(biāo)回收要求。DON在三個含量梯度的檢測數(shù)據(jù)較 ZEN檢測數(shù)據(jù)要更集中。ZEN在檢測低含量樣品，理論含量為50 μg/kg時，檢測數(shù)據(jù)較分散，回收率檢測結(jié)果 81.72%～111.03%，在檢測理論含量為150 μg/kg時，檢測數(shù)據(jù)較集中，總體上DON和ZEN方法精密度，符合國標(biāo)定量檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4 與液相色譜法比較測定

將 30份玉米樣品同時用液相色譜法和超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測DON和ZEN，并對結(jié)果數(shù)據(jù)進行比較，由于快檢卡數(shù)據(jù) DON檢測結(jié)果低于100 μg/kg，ZEN檢測結(jié)果低于5 μg/kg的無法讀出，故不做統(tǒng)計，其他檢測數(shù)據(jù)比較見圖4。

圖4 液相色譜法和超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測玉米樣品中DON和ZEN數(shù)據(jù)對比及相對偏差圖Fig.4 Comparison and relative deviation of DON and ZEN data in maize samples detected by HPLC method and superconductor coated immunofluorescence test strip method

由圖4可知在測定的30組數(shù)據(jù)中，去除儀器無法讀數(shù)的數(shù)據(jù)，液相色譜法和超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法檢測DON和ZEN的結(jié)果符合率達(dá)到100%。2種方法的DON檢測結(jié)果的相對偏差在–0.37%～9.04%之間，ZEN的相對偏差在–4.99%～6.54%之間，說明超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法的檢測數(shù)據(jù)與液相色譜法的檢測數(shù)據(jù)相一致，方法間偏差較小，精密度將近，結(jié)果可靠，符合國家標(biāo)準(zhǔn)偏差要求。

4 討論與結(jié)論

本研究表明超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法能夠同時快速定量檢測玉米中DON和ZEN兩種毒素的檢測方法，測定法準(zhǔn)確、可靠。本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法相比，具有快速、靈敏、方便、科學(xué)、檢測成本低的特點，與單聯(lián)快檢法相比，具有省時、節(jié)約成本、同時呈現(xiàn)2個毒素指標(biāo)的特點?？梢栽跐M足農(nóng)產(chǎn)品及其制品中真菌毒素快速檢測需求。此外，本方法為內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，不需要在實驗中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少人為檢測誤差，保持每臺儀器的穩(wěn)定性。試紙條和試劑耗材在2～30 ℃儲存的技術(shù)優(yōu)勢，便于在各種溫度條件的運輸和使用，可用于不同檢測環(huán)境如田間調(diào)查，市場抽查等。隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)迅猛發(fā)展，人們對食品、飼料安全日益重視，快速篩查、實時監(jiān)控是檢測發(fā)展的趨勢，超導(dǎo)體包被免疫熒光試紙法同時快速定量檢測玉米中DON和ZEN兩種毒素的檢測方法具有現(xiàn)實意義。