王綺玉，劉 歡*，仁增旺堆，王敬龍，羅建民，黃 穎，董 凱

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院草業(yè)科學研究所，西藏 拉薩 850000)

藏沙蒿(Artemisiawellbyi)為菊科(Compositae)蒿屬(Artemisia)半灌木狀草本，是西藏特有植物種,在群落中為建群種或優(yōu)勢種，具抗寒、抗旱和防風固沙等重要生態(tài)功能[1]，其生境多為河灘、草坡和流石灘,主要分布在西藏藏北和藏西北地區(qū)。西藏高原是青藏高原的主體，該區(qū)氣候獨特，全區(qū)草地類型豐富，其生態(tài)環(huán)境卻極其脆弱[2]。近年來，由于全球變暖及人為因素等干擾，高寒荒漠草原類和高寒荒漠類草地均出現(xiàn)了不同程度的退化現(xiàn)象。草牧矛盾一直是中國高寒區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中最突出的問題之一，尤其是冬春季草場超載嚴重，草場放牧強度急劇增大，導致草場風蝕和風積過程加劇，進一步加速了草場荒漠化[3-5]。在西藏高寒干旱生境下，藏沙蒿形成了其獨有特征和適應機制，對干旱具有極強的抗性，可作為該類退化草地修復的優(yōu)良補播草種。因此，開展藏沙蒿種質材料抗旱性篩選、鑒定是該類草地修復的基礎。

植物抗旱性受多種因素影響，以單一指標評價具有一定的片面性，需用多個指標進行綜合評價[6-7]。通常多采用抗旱系數(shù)和抗旱指數(shù)指標來評價植物的抗旱性。這些指標在長穗偃麥草(Elytrigiaelongate)[8]、披堿草屬(Elymus)[9]、沙棘屬(Hippophae)[10]等植物抗旱性研究中已成功應用。目前，有關藏沙蒿的研究主要集中于資源調查[1]、營養(yǎng)成分分析[11]和與其它植物的競爭效應[12]等方面，對藏沙蒿苗期抗旱性綜合評價還未見報道。苗期作為植物對水分變化最敏感的時期，對于鑒定植物的抗旱能力具有時間短、結果準確、可重復性強等優(yōu)點，在植物抗旱性評價中應用廣泛[8]?；诖?，本研究以采自西藏地區(qū)不同生境的藏沙蒿種質材料為研究對象，采用盆栽控水法，對13份材料的11個抗旱指標進行綜合評價，篩選抗旱型和干旱敏感型種質材料，以期為藏沙蒿種質資源作為生態(tài)草在青藏高原的合理開發(fā)利用提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藏沙蒿種質材料共13份(表1)，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院研究所協(xié)助采集藏沙蒿成熟種子，室溫保存在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院實驗室。

表1 藏沙蒿種質資源表

1.2 試驗設計

試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院生長室內進行，采用盆栽控水法。

將13份籽粒飽滿均勻無缺損的藏沙蒿種子均勻撒播于裝有等量經(jīng)高溫滅菌的蛭石、沙子和營養(yǎng)土(1∶1∶2混合)的塑料花盆(底徑11.4 cm、口徑21 cm、深12 cm)中，用環(huán)刀法測得土壤田間持水量為29.6%，每盆裝基質1.6 kg，置于人工智能溫室中發(fā)芽。待藏沙蒿幼苗真葉長出2片后間苗，每盆根據(jù)實驗設計留長勢基本一致的幼苗，每盆20株。溫室溫度為(25±2)℃，光照16 h，黑暗8 h，光強2 000 lx，相對濕度60%?？厮荻葏⒖祭钏豙13]對干旱脅迫生理響應的水分梯度劃分方法并根據(jù)預實驗結果加以改進，設計3個土壤水分脅迫處理(表2)，每個處理3個重復。

表2 干旱脅迫試驗處理

待盆內藏沙蒿幼苗生長90 d后，進行干旱脅迫處理。試驗前3 d對所有植株進行連續(xù)澆水處理，使每盆土壤處于飽和含水狀態(tài)，CK每2 d補充定量水分至田間最大持水量的70%～80%，干旱處理自試驗開始后不再澆水，待土壤水分自然消耗至設定的土壤含水量時，采用稱重補水法進行控水，使各處理含水量維持在設定范圍內。各處理在干旱脅迫30 d后將植株地上部分混合取樣，每個處理3次生物學重復，測定各指標。

1.3 測定項目與方法

根冠比(Root shoot ratio，Rsr)和生物量(Biomass，Bio)采用烘干稱重法測定；離體葉片失水速率(Rate of water loss of detached leaves，RWL)采用稱重法測定[14]；相對電導率(Relative conductivity，REC)采用電導率儀測定[15]；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[16]；過氧化物酶(Peroxidase，POD)采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)采用氮藍四唑還原法測定[16]；過氧化氫酶(Catalase，CAT)采用高猛酸鉀滴定法測定[16]；可溶性糖含量(Soluble sugar，SS)采用蒽酮法測定[17]；可溶性蛋白含量(Soluble protein，SP)采用考馬斯亮藍G-250測定[17]；脯氨酸含量(Proline，Pro)采用茚三酮比色法測定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2 010進行數(shù)據(jù)整理，SPSS19.0軟件進行方差分析?？购敌灾笜撕Y選采用Speorman相關性分析和主成分分析(PCA)，Origin 2 021軟件作圖。

1.4.1抗旱性指標篩選 對測定指標分別進行單項指標抗旱系數(shù)值(DC)計算，公式如下：

抗旱系數(shù)[18]：

(1)

式中：Tj表示干旱處理j指標測定值的平均值；CKj表示對照處理j指標測定值的平均值；n為測定指標數(shù)，n=11

計算后得到的重度干旱脅迫下DC值用于主成分分析，通過主成分計算各綜合指標因子權重系數(shù)(Wj)，公式如下：

各指標權重[19]：

(2)

式中：Wj表示第j個指標在所有指標中的重要程度即權重，Vj表示經(jīng)主成分分析所得各材料第j個指標的貢獻率。

1.4.2抗旱性綜合評價 抗旱性綜合評價采用賦予權重法[19]。

藏沙蒿材料綜合指標隸屬函數(shù)值：

(3)

式中，X為藏沙蒿種質材料重度干旱脅迫下某一綜合指標值，Xmax和Xmin分別為綜合指標的最大值及最小值。

抗旱性綜合評價值：

(4)

式中：D值為干旱脅迫下各指標評價所得的抗旱性綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料生物量和根冠比的影響

干旱脅迫使藏沙蒿種質材料總生物量均呈不同程度的下降趨勢(圖1a)。CK處理下，13份藏沙蒿材料的平均單株生物量為0.17 g。中度干旱脅迫下，5號材料總生物量與其余各材料差異顯著(P<0.05)。與CK相比，8號材料的總生物量降幅比其它材料更大(17.77%)，1，2和13號材料降幅度較其它材料小，其中1號材料降幅最小為4.09%。重度干旱脅迫下，各材料總生物量減少49.58%～88.76%。不同材料根冠比隨干旱脅迫程度的增加持續(xù)增大(圖1b)。13份藏沙蒿材料的根冠比范圍為0.15～0.38。中度干旱脅迫下，13，4和11號材料較CK分別增加了45.14%，32.47%和29.22%，5號材料增幅最少(2.49%)。重度干旱脅迫下，5號材料增幅最大為160.13%，與其余各材料差異顯著(P<0.05)，13和1材料次之，較對照分別增加了79.39%和72.85%(P<0.05)，8號材料增幅最小，為18.50%。

圖1 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料生物量和根冠比的影響

2.2 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料離體葉片失水速率(Rate of water loss of detached leaves，RWL)的影響

13份藏沙蒿材料在不同程度干旱脅迫下的RWL差異性不一致(圖2)。CK和中度條件下，8號材料離體葉片失水速率最高，分別為2.41 mg·h-1和1.75 mg·h-1，5號材料最低，分別為1.17 mg·h-1和0.83 mg·h-1；隨著干旱脅迫的加劇，離體葉片失水速率逐漸降低，重度干旱脅迫下，失水速率排序為：4>3>8>6>1>9>10>12>11>5>13>7>2。在整個失水過程中，2，5和11號材料離體葉片失水速率較其它材料低，表現(xiàn)出較強的抗脫水能力。

圖2 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料離體葉片失水速率的影響

2.3 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料相對電導率(Relative conductivity，REC)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的影響

干旱脅迫下，13份藏沙蒿材料的REC和MDA含量均較CK有所升高，并隨干旱程度的增大呈上升趨勢(圖3a，3b)。中度干旱脅迫下，REC含量5號和13號材料與4號和6號材料差異不顯著，與其余各材料差異顯著(P<0.05)，11號材料植物細胞內MDA含量與其它各材料差異顯著(P<0.05)。其中，11號材料的REC最大，12號材料的MDA含量最高且增幅最大為121.40%；隨著干旱程度增大到重度時，材料間的差距進一步增大。所有材料中，13號材料的REC較CK升高294.53%，4號材料較CK升高41.57%，可見脅迫對13號材料細胞膜的傷害最大，對4號材料的傷害不顯著，7號材料的MDA含量高于其它材料，但增幅小于11號材料，13號材料最小為46.58%，由此可見，干旱脅迫會導致各藏沙蒿材料不同程度地積累MDA，對13號材料MDA的積累則沒有明顯促進作用。

圖3 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料相對電導率和丙二醛含量的影響

2.4 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質的影響

干旱脅迫下，13份藏沙蒿材料的抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質呈現(xiàn)一定程度的變化。POD，SOD活性和Pro，SS含量均增加(圖4a，4b，4d，4e)，說明干旱脅迫在一定程度上造成藏沙蒿細胞膜脂過氧化及細胞液滲透壓過大。中度干旱脅迫下，9號材料的POD活性最高且增幅最大(113.23%)，與其余各材料差異顯著(P<0.05)，3號材料的SOD活性和SS含量最高，10號材料的Pro含量最高；隨著干旱脅迫程度的進一步加劇，與各自的CK相比，13份種質的POD，SOD活性和Pro，SS含量均顯著增加。在所有材料中，8號材料POD酶活性增幅最大(344.36%)，3，4和11號材料SS含量顯著高于其它材料，較CK分別增加16.01，17.75和21.10倍，9號材料增幅最小為2.84倍。11號材料的SOD酶活性和Pro含量增幅最大(379.78%，24.42倍)。CAT和SP含量不同材料之間存在差異性，5號材料在重度干旱脅迫下CAT酶活性較CK有所下降(61.72%)，其余材料CAT酶活性均較CK有所升高，其中3號材料增幅最大為322.94%(圖4c)，SP含量，5，7和8號材料在中度干旱脅迫下先增加，隨干旱程度進一步增加，SP含量又下降，12和13號材料則一直呈下降趨勢(4f)，可見5，7，8，12和13號材料對干旱脅迫的膜系統(tǒng)抗氧化能力和細胞滲透調節(jié)能力弱于其它藏沙蒿材料。

圖4 干旱脅迫對藏沙蒿種質材料抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質的影響

2.5 藏沙蒿種質材料各指標相關性分析

對13份藏沙蒿種質材料的11項指標在3個不同程度干旱脅迫下的測定值均賦相同權重1，進行Spearman相關性分析(圖5)。結果表明，MDA與Pro和POD，CAT與SP和Rsr，SOD與REC和RWL呈顯著相關(P<0.05)，其中MDA和POD呈正相關且相關系數(shù)最大為0.69，MDA與Pro，CAT與Rsr，SOD與REC以及RWL均呈負相關。REC和POD相關系數(shù)為0.76，相關性達到極顯著水平(P<0.01)。從相關性分析可知，各指標耐旱信息有重疊，需要進一步對11項觀測指標進行主成分分析以確保評價結果更加準確可靠。

圖5 干旱脅迫下13份藏沙蒿材料各指標間相關系數(shù)

2.6 藏沙蒿各種質材料單項指標的主成分分析

對13份藏沙蒿種質材料的11項觀測指標進行主成分分析(表3)，前5個成分的累計貢獻率達到86.341%，具有較好的代表性，可作為藏沙蒿苗期抗旱性評價的綜合指標。第一個主成分中載荷較大的是POD和CAT，載荷數(shù)分別為0.765和0.820，其特征向量反映了干旱脅迫下藏沙蒿幼苗的抗氧化酶活性，其活性越高，藏沙蒿受到的損害就越小。第二個主成分中載荷最大的是Rsr和RWL，載荷數(shù)為0.586和0.739，主要反映了藏沙蒿幼苗的生長特性和水分利用狀況，因此Rsr和RWL是評價藏沙蒿抗旱性的兩個重要指標。第三個主成分對應特征向量中載荷最大的是MDA和SP，載荷數(shù)為0.842和0.674，第四個主成分對應特征向量中載荷最大的是REC和SS，載荷數(shù)為0.520和0.595。第三和第四主成分的特征向量反映了藏沙蒿幼苗的細胞膜損傷程度、質膜相對透性和滲透調節(jié)特性。說明藏沙蒿幼苗的抗旱性與細胞膜損傷程度、質膜相對透性和滲透調節(jié)特性密切相關。第五個主成分對應特征向量中載荷最大的是Pro和SOD，載荷數(shù)為0.511和0.330，主要反映了干旱脅迫下藏沙蒿幼苗的滲透調節(jié)能力和抗氧化酶活性。綜合來看，藏沙蒿的生長特性、水分利用狀況、質膜相對透性、抗氧化酶活性以及滲透調節(jié)物質可作為藏沙蒿苗期抗旱性評價的綜合指標。

表3 各因子載荷矩陣及貢獻率

2.7 藏沙蒿各種質材料抗旱性綜合評價

采用主成分分析和隸屬函數(shù)相結合的方法對藏沙蒿材料抗旱性進行綜合評價。首先根據(jù)1.4.1中的公式(2)計算出5個綜合指標因子的權重系數(shù)()分別為0.348，0.251，0.192，0.133和0.096。再依據(jù)1.4.2中的公式(3)計算各綜合指標的隸屬函數(shù)值μ(x)(表4)，最后依據(jù)公式(4)計算抗旱性綜合評價值(D)，從表5可知，13份藏沙蒿材料抗旱性排序為：11>10>3>4>5>12>9>8>7>13>2>1>6。

表4 13 份藏沙蒿材料苗期各綜合指標值、權重、隸屬函數(shù)值、D值及綜合評價

2.8 藏沙蒿苗期抗旱性聚類分析

對供試藏沙蒿材料的抗旱性綜合評價值D進行系統(tǒng)聚類，在歐氏距離為0.25時，可將13份藏沙蒿材料分為4個抗旱類型(圖6)，第一類為強抗旱型(0.703≤D≤0.761)，包括3，10和11號材料，第二類為中度抗旱型(0.455≤D≤0.534)，包括4，5，8，9和12號材料，占總數(shù)的38.46%。第三類為弱抗旱型材料(0.345≤D≤0.413)，包括1，2，7和13號材料，占總數(shù)的30.77%。第四類6號材料單為一類，為抗旱敏感型材料，其抗旱性綜合評價值D為0.249。

圖6 13份藏沙蒿材料苗期抗旱性聚類分析

3 討論

植物的干旱適應能力與其地上/地下生物量的分配密切相關[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫程度的增加，各材料總生物量降低，根冠比增加，說明藏沙蒿通過降低地上部分營養(yǎng)分配比重，增加地下部分的營養(yǎng)分配比重來應對干旱。就不同種質而言，在中度干旱脅迫下，5號材料根冠比增幅最少，但隨著干旱程度的進一步增強，在重度干旱脅迫下，其根冠比增幅達到最大且與各材料差異顯著，說明在干旱環(huán)境中，5號材料對干旱的適應性更強。離體葉片失水速率是反映植物葉片原生質抗脫水能力的重要指標[22-23]，一般認為，抗旱性強的植物其葉片能夠維持較低的離體葉片失水速率[24]。不同藏沙蒿材料離體葉片失水速率不一致，說明其葉片抗脫水能力存在差異。在整個干旱脅迫過程中，11號材料離體葉片失水速率較低，2號和7號材料在中度干旱脅迫下能夠維持較低的離體葉片失水速率，但在重度干旱脅迫下其離體葉片失水速率降幅很大，這有可能是土壤水分虧缺超出了植物葉片水分調節(jié)能力的限度，與最終抗旱性綜合評價的結果一致，說明植物的抗旱性與水分狀況密切相關，且主成分分析中離體葉片失水速率載荷數(shù)較大并為第二主成分，表明RWL是反應植物抗旱性的重要指標。

本研究中，干旱脅迫使供試藏沙蒿材料的REC及MDA含量均增大。而在4號和5號材料中，干旱對REC的影響較小，對6，9，12和13號材料的REC的影響較大，說明4號和5號材料的細胞膜損傷輕微，6，9，12和13號材料細胞膜的膜脂過氧化程度較重。當植物遭受干旱脅迫時，體內會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引起氧化脅迫，使細胞膜透性增大[25]。植物細胞膜透性以及損害程度可由相對電導率反映[26]，而細胞膜透性損害會導致細胞內容物外滲，進一步引起丙二醛含量增加。干旱脅迫顯著增加了5，7，8，11和12號材料MDA含量，而對13號材料影響較小，因此，對13號材料來說，苗期干旱脅迫的膜脂過氧化程度較輕。這與樊仙等[27]對甘蔗研究以及王平等[9]對披堿草屬牧草的研究結果一致。在長期干旱脅迫條件下，活性氧(ROS)產(chǎn)生過多并造成氧化損傷，為了避免自身受到傷害，體內的抗氧化酶POD、CAT與SOD協(xié)同作用使活性氧維持在較低水平[28]。本研究發(fā)現(xiàn)SOD和POD酶活性與干旱脅迫程度表現(xiàn)為正相關，這與鄒苗等研究結果一致[29]；而白旭瑞[30]研究小麥的POD呈現(xiàn)出不同的趨勢，可能是小麥各酶活性對干旱的表達時期有所不同。也有研究表明隨著脅迫程度的增大，SOD，POD和CAT酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是干旱脅迫程度超過了植物的耐受范圍[31]。本研究中，干旱脅迫初期，所有材料的抗氧化酶活性均升高，但與之不同的是，隨著干旱脅迫程度的加劇，5號材料CAT酶活性較CK有所下降，表明5號材料對干旱脅迫的膜系統(tǒng)抗氧化能力弱于其它材料。本研究中，干旱脅迫改變了供試藏沙蒿材料的滲透調節(jié)物質含量，SS和Pro較CK均上升，SP含量不同材料存在差異性，說明藏沙蒿可以通過增加滲透調節(jié)物質來提高應對干旱的能力，這與對燕麥和栓皮櫟等研究結果一致[31，32]。SS，SP和Pro為植物體內重要的滲透調節(jié)物質[33]，植物在干旱脅迫下主動積累細胞溶質，使?jié)B透勢降低，從而提高細胞保水力，保持細胞膨壓，保證正常生長[34]。干旱脅迫導致藏沙蒿幼苗SS和Pro含量增加，3號和10號材料SS和Pro含量都有較大的增加，另外，5，7和8號材料SP含量在中度干旱脅迫下先增加，隨干旱程度進一步增加，SP含量又下降，12和13號材料SP含量隨干旱脅迫程度的增加呈下降趨勢。這表明3號和10號材料滲透調節(jié)能力強于其它材料，5，7，8，12和13號材料的滲透調節(jié)能力弱于其它材料。藏沙蒿葉片中SOD，POD以及SS和Pro含量的增加，以去除超氧化物自由基并調控干旱脅迫條件下膜脂質過氧化的水平，這也是藏沙蒿對水分虧缺的一種適應策略。

植物的抗旱性是由多種基因控制的且相互作用而形成的復雜的綜合性狀。不同植物對干旱的適應方式不同，以單一指標評價植物抗旱性具有一定局限性，不能準確反映其真實抗旱能力，應用多個指標進行綜合評價[35]。但是，鑒定植物抗旱性的生理指標較多，且不同指標之間存在一定相關性。隸屬函數(shù)法采用多個指標進行綜合評價，但由于不同指標之間存在相關性，致使耐旱信息有重疊。主成分分析將多個指標整合成幾個較少的綜合指標且這些綜合指標之間不存在相關性，可以從原有的多個與植物抗旱性相關的指標中反映出整體的信息，也有采用多個抗旱生理指標、多種評價方法綜合評價植物的抗旱性研究[19，36-37]。本研究在此基礎上通過主成分分析法將13份藏沙蒿材料各單項指標的抗旱系數(shù)轉換成5個相互獨立的綜合指標，隸屬函數(shù)法計算各綜合指標隸屬函數(shù)值μ(x)，進一步結合權重計算抗旱性綜合評價值(D)鑒定其抗旱性，增強了研究結果的準確性。

4 結論

通過主成分分析和隸屬函數(shù)相結合的方法對干旱脅迫下13份藏沙蒿幼苗種質材料的11個與抗旱相關的生長和生理指標進行綜合評價，根據(jù)抗旱性綜合評價值(D)對13份藏沙蒿材料幼苗的抗旱性由強到弱進行排序,結果為11>10>3>4>5>12>9>8>7>13>2>1>6。運用聚類分析法對13份藏沙蒿材料的D值進行聚類分析，可將供試材料抗旱性劃分為 4個類型，包括強抗旱型3份材料，中度抗旱型5份材料，弱抗旱型 4份材料和抗旱敏感型材料1份。建議11，10和3號藏沙蒿材料作為西藏高寒荒漠草地生態(tài)恢復和育種研究的首選材料。