范欲航，許 悅，祝詩詞，王凈潔，賈紀(jì)原，黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，四川 成都 610000)

美洲狼尾草(Pennisetumglaucum)，一年生禾本科植物，又名珍珠粟、御谷，是一種優(yōu)質(zhì)的牧草資源，其原產(chǎn)地位于非洲中部熱帶地區(qū)，具有生長(zhǎng)速度快、莖葉產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)成分豐富、適應(yīng)性廣、家畜適口性好、抗旱能力強(qiáng)、抗逆性高等特點(diǎn)，非常適合在高溫、干旱、鹽堿的地區(qū)種植[1]。美洲狼尾草的價(jià)值主要體現(xiàn)在作為糧食作物、飼草作物生產(chǎn)和能源牧草利用等方面，世界范圍內(nèi)均有相關(guān)記載其在糧飼領(lǐng)域中的作用，例如撒哈拉沙漠以南和印度次大陸以北的干旱貧困地區(qū)以美洲狼尾草的籽實(shí)作為主要口糧，種植面積達(dá)到3 100萬公頃[2-3]；北美洲與澳洲部分干旱地區(qū)將美洲狼尾草制成青貯飼料喂養(yǎng)家畜[4];在我國(guó)北起黑龍江、南至海南的一定區(qū)域內(nèi)也引進(jìn)了美洲狼尾草進(jìn)行牧草生產(chǎn)[5];在張建麗等人的研究中發(fā)現(xiàn)狼尾草屬的作物具有高效生產(chǎn)乙醇的能力，可開發(fā)作為能源作物[6]。

我國(guó)美洲狼尾草的育種研究仍處于起步階段，相較于傳統(tǒng)的育種方式，結(jié)合轉(zhuǎn)基因的現(xiàn)代育種更能促進(jìn)該牧草作物在我國(guó)的發(fā)展?，F(xiàn)代分子育種在主要糧食作物與牧草作物上的應(yīng)用已經(jīng)相對(duì)成熟，例如抗除草劑小麥、抗蟲害玉米和抗葉斑病苜蓿等優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品種的創(chuàng)制[7-9]，而大部分的轉(zhuǎn)基因工作基于組培再生體系的構(gòu)建，所以構(gòu)建美洲狼尾草組培再生體系對(duì)于該牧草的育種工作具有很大意義。

以往的研究通常使用植物的器官、組織、胚胎或細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，在給予一定的培養(yǎng)條件后可以促使外植體再生為愈傷組織和叢生芽，最終形成完整的植株，這依賴于植物的全能性[10]，而在培養(yǎng)過程中需要考慮污染、誘導(dǎo)和分化三個(gè)因素[11-12]，其中污染問題是需要最優(yōu)先解決的，因?yàn)槲⑸镌谂囵B(yǎng)基中產(chǎn)生的霉變、毛囊狀、渾濁的污染痕跡會(huì)影響組培材料的良好保存與進(jìn)一步生長(zhǎng)[11]，所以通常采用例如NaClO、乙醇等殺菌劑清理外植體，減少污染狀況。愈傷組織的誘導(dǎo)與分化是外植體完成再生的兩個(gè)重要過程，由外植體被誘導(dǎo)形成愈傷組織再由愈傷組織分化形成叢生芽，外源激素在培養(yǎng)基中的組合與濃度搭配是促進(jìn)誘導(dǎo)與分化的關(guān)鍵[12]，生長(zhǎng)素類型的植物激素對(duì)愈傷組織細(xì)胞的分裂具有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)在細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素比例較高時(shí)會(huì)促進(jìn)叢生芽的生長(zhǎng)[12]。本試驗(yàn)通過不同消毒方式與多種激素組合對(duì)美洲狼尾草的幾種外植體進(jìn)行處理，探究由外植體發(fā)育為再生植株的有效方式，構(gòu)建美洲狼尾草的組培再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為美洲狼尾草‘斗?！姆N胚、幼葉、幼穗和莖節(jié)，外植體材料均采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州試驗(yàn)基地；種胚的收獲時(shí)間為2021年7月中旬，4℃低溫干燥貯存，幼葉、幼穗和莖節(jié)的采集時(shí)間為2021年7月至8月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的選擇與消毒處理 本試驗(yàn)以美洲狼尾草的種子、幼葉、幼穗、莖節(jié)為外植體。挑選成熟且顆粒飽滿的美洲狼尾草種子，用清水沖洗30 min備用；將出苗3-4天的美洲狼尾草子葉切割為長(zhǎng)寬約2 mm的小段備用；將灌漿期的美洲狼尾草幼穗切下并分割為長(zhǎng)度約5 mm的小節(jié)備用；將美洲狼尾草節(jié)上分生區(qū)的組織切割為長(zhǎng)寬高約2 mm的顆粒備用；對(duì)所有外植體均使用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗5次，再分別用升汞(0.1%HgCl2)與3%，5%，7%NaClO浸泡一段時(shí)間，時(shí)間設(shè)置為5 min，10 min，15 min，繼續(xù)用無菌水沖洗5次。消毒完成后即可接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo) 將不同外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+6-KT(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1 mg·L-1，2 mg·L-1，4 mg·L-1)+6-BA(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH=5.8，121℃滅菌20 min，每份培養(yǎng)基接種外植體15粒，設(shè)置三種植物激素的濃度梯度并做5個(gè)重復(fù)，找出誘導(dǎo)率最高的激素配比。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中每培養(yǎng)14 d進(jìn)行一次繼代，繼代兩次后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中。

1.2.3愈傷組織的分化 將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基之前需要切除原本的外植體部位，只轉(zhuǎn)移愈傷塊，分化培養(yǎng)基配方為MS+6-BA(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，1.5 mg·L-1，2.0 mg·L-1，2.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8，每份培養(yǎng)基接種愈傷塊10粒，設(shè)置兩種植物激素的濃度梯度并做5個(gè)重復(fù)，找出再生率最高的激素配比。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中每14 d進(jìn)行一次繼代，直至再生苗生長(zhǎng)高度達(dá)到5 cm以后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。

1.2.4生根與再生植株的移栽 生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+3%蔗糖+1%瓊脂，生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后移栽至混合土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=2∶1)中完成再生。

1.2.5評(píng)價(jià)指標(biāo) 外植體污染率=污染的外植體數(shù)量/外植體接種數(shù)量×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)量/(外植體接種數(shù)量污染的外植體數(shù)量)×100%；

愈傷組織分化率=愈傷組織再生數(shù)量/愈傷組織接種數(shù)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對(duì)外植體污染的影響

結(jié)果表明，消毒過后的污染率都有所下降，其中種子在不同消毒方式處理后的污染率具有顯著差異。如表1所示，隨著消毒液濃度和消毒時(shí)間的增加，大多數(shù)外植體的污染率會(huì)隨之降低，相較于種子和幼葉，幼穗和莖節(jié)外植體經(jīng)過高濃度與長(zhǎng)時(shí)間的消毒液浸泡仍然有較高的污染率，其中種子在5%和7%的次氯酸鈉中消毒5～15 min，其污染率降低為1.33%，在升汞中消毒15 min能夠?qū)⑽廴韭式档椭?；幼葉、幼穗和莖節(jié)外植體最佳的消毒方式為升汞消毒10～15 min，其中幼葉在升汞中消毒10 min能夠?qū)⑽廴韭式档椭?。

表1 幾種外植體在不同消毒方式下的污染率

2.2 不同消毒方式對(duì)種子發(fā)芽率的影響

在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽率會(huì)影響其誘導(dǎo)率，于是在進(jìn)一步的工作中測(cè)量了不同消毒方式對(duì)發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明，高濃度的消毒試劑會(huì)明顯降低種子的發(fā)芽率，其中升汞處理10～15 min與NaClO處理10～15 min后種子的發(fā)芽率具有顯著差異。如表1所示，5%，7%次氯酸鈉與升汞消毒都可有效降低外植體在培養(yǎng)基中的污染率，雖然升汞消毒15 min能夠?qū)⑽廴韭式档椭?，但是會(huì)影響種子的發(fā)芽率，如表2所示，升汞消毒15 min后發(fā)芽率降低至26.67%。而5%次氯酸鈉消毒種子5 min后在保持較低污染率的同時(shí)又具有較高的發(fā)芽率，其發(fā)芽率為86.67%。

表2 不同消毒方式對(duì)種子發(fā)芽率的影響

2.3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

污染問題使我們放棄了幼穗誘導(dǎo)愈傷組織的工作，在此階段對(duì)種子、幼葉與莖節(jié)進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，不同植物激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率具有顯著差異，如表3所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT種子外植體的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到93.33%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加0.1 mg·L-16-BA后愈傷組織的最高誘導(dǎo)率沒有明顯變化，誘導(dǎo)率仍然為93.33%，但是愈傷組織的顏色由整體的黃褐色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S白色，美洲狼尾草不同顏色的愈傷組織如圖1所示。幼葉與莖節(jié)的誘導(dǎo)率為0(在多種激素組合中均為0，未放于圖中)，如圖2所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)了30 d后的幼葉、莖節(jié)均無愈傷組織的形成。得出結(jié)論以種子為外植體可高效誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

圖1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后愈傷組織呈現(xiàn)的4種不同顏色

圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后愈傷組織的誘導(dǎo)情況

表3 不同濃度6-BA，6-KT與2,4-D組合對(duì)種子愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.4 不同分化培養(yǎng)基激素配比對(duì)愈傷組織分化的影響

愈傷組織于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)42 d(2次繼代)后，于無菌工作臺(tái)中剪去原生的胚芽與胚根，然后接種至分化培養(yǎng)基中，如表4所示，在分化培養(yǎng)基中加入1 mg·L-1NAA，3 mg·L-16-BA愈傷組織的分化率最高，其分化率為81%。分化率的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為產(chǎn)生再生苗的愈傷組織數(shù)量，如圖3 d所示，再生苗由愈傷組織切去原生胚芽附近的胚性愈傷組織產(chǎn)生，胚性愈傷組織的顏色由黃白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，同時(shí)形成不定芽，如圖4 d所示，不定芽的生長(zhǎng)形態(tài)為厚實(shí)顏色偏綠的葉片，與原生胚芽細(xì)長(zhǎng)單薄的葉片不同。如圖3e所示，胚性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)基培育21 d后形成了密集的再生芽叢。

表4 不同濃度NAA與6-BA組合對(duì)愈傷組織分化的影響

圖3 美洲狼尾草愈傷組織分化再生過程

2.5 再生苗的生根與移栽

如圖3f所示，將分化21 d后的芽叢接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中再培養(yǎng)20 d即可移土栽培，如圖3 h所示，分化形成的叢生芽發(fā)育形成了一簇茂盛的美洲狼尾草株系，完成了由愈傷組織再生為完整植株的過程。

3 討論

3.1 外植體的選擇與消毒處理

據(jù)報(bào)道，外植體的生理狀態(tài)、再生功能不同將影響愈傷組織的形成[13]，而在許多雙子葉植物的外植體再生研究中，為了驗(yàn)證植物的全能性，通常以植物的器官誘導(dǎo)愈傷組織，例如煙草(Nicotianatabacum)的組織培養(yǎng)選用葉片為外植體[14]，建立番茄(Lycopersiconesculentum)的再生體系選用莖段為外植體[15]。在外植體的選擇上單子葉植物與雙子葉植物有一定差別，禾本科在構(gòu)建組培再生體系時(shí)常常選用種子、幼穗作為外植體，例如鴨茅(Dactylisglomerata)以幼穗為外植體，柳枝稷(Panicumvirgatum)以種子、幼穗為外植體均成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織并形成再生苗[16-19]，這或許與單子葉植物器官的分化程度有關(guān)，較高的分化程度會(huì)增加器官脫分化的難度，所以需要選用具有一定胚性的外植體來構(gòu)建其再生體系，本試驗(yàn)選用具有一定胚性的外植體種胚、幼穗與胚性較弱的幼葉和莖段作為外植體，初步驗(yàn)證了美洲狼尾草在構(gòu)建組培體系時(shí)需要依靠外植體本身的胚性。

在消毒過程中發(fā)現(xiàn)種子的消毒效果比較好，NaClO與升汞處理后都可有效的降低污染率，但是結(jié)合兩種消毒方式對(duì)種子發(fā)芽率的影響，最終選擇5%NaClO消毒5 min的消毒方式，而在其他外植體中升汞的消毒效果要明顯高于NaClO，但是并未探索到對(duì)于其他外植體誘導(dǎo)愈傷組織的有效方法，所以對(duì)于升汞對(duì)其他外植體的誘導(dǎo)過程是否有影響還需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

3.2 不同激素配比對(duì)種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2,4-D是一種生長(zhǎng)素類似物，常常作為組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)的外源激素，在誘導(dǎo)外植體脫分化的過程中環(huán)境內(nèi)的生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比例升高會(huì)促進(jìn)外植體的脫分化并形成愈傷組織[20]，以2,4-D為單一變量在僅有這一種外源激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選出誘導(dǎo)率相對(duì)較高的激素配比即3 mg·L-1，其誘導(dǎo)率為 44%。通過篩選出單一變量的最佳效果，并在此基礎(chǔ)上添加其他植物激素進(jìn)行優(yōu)化可以增加篩選效率并降低工作難度。KT是一種天然植物內(nèi)源激素，外源添加可以發(fā)揮細(xì)胞分裂素的性能，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值進(jìn)而影響外植體的脫分化，在許多組織培養(yǎng)體系中常使用2,4-D與KT搭配來誘導(dǎo)愈傷組織的形成[20-23]。因此以3 mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)逐量添加KT來篩選更高誘導(dǎo)率的植物激素配比，試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這種篩選方法，1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基其對(duì)種胚發(fā)育形成愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到93%，是僅添加2,4-D誘導(dǎo)率的兩倍。6-BA是一種人工合成的類細(xì)胞分裂素，在組織培養(yǎng)中可以起到提高愈傷質(zhì)量與增加誘導(dǎo)率的作用，所以進(jìn)一步的以1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)逐量添加6-BA，我們觀察到在加入0.1 mg·L-16-BA中愈傷組織的整體顏色由黃褐色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S白色，這減緩了愈傷組織的褐化速度，加入6-BA后并沒有明顯增加誘導(dǎo)率但是提高了胚性愈傷組織分化前的愈傷質(zhì)量，更利于再生苗的分化。

在整個(gè)試驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)單一的外源激素2,4-D其實(shí)并不能達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果，而在逐步添加激動(dòng)素KT后愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯增加，這體現(xiàn)了不同類型的外源激素搭配在愈傷組織的形成過程中發(fā)揮著重要作用。針對(duì)于狼尾草屬作物的組培研究，或許可以參考以上方法嘗試添加多種激素類型的組合，例如添加激動(dòng)素、細(xì)胞分裂素等配合生長(zhǎng)素共同促進(jìn)愈傷組織的形成，能夠有效的找出不同品種狼尾草屬作物的組培方式。

3.3 不同激素配比對(duì)胚性愈傷組織分化的影響

在誘導(dǎo)愈傷組織分化的過程中需要促進(jìn)植物細(xì)胞的再分化，因?yàn)榧?xì)胞分裂素可以促進(jìn)愈傷組織向再生植株的方向發(fā)展[22]，所以需要使得培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)胞分裂素的比值高于生長(zhǎng)素，6-BA與6-KT均為細(xì)胞分裂素類型的植物激素，但是相較而言6-BA具有誘導(dǎo)不定根與不定芽的能力[24-25]，所以采用6-BA作為外源激素來增加分化環(huán)境內(nèi)細(xì)胞分裂素的含量。在僅加入3 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基愈傷組織的分化率明顯增加，分化率達(dá)到55%，是空白組分化率的10倍。NAA是一種人工合成的類生長(zhǎng)素類物質(zhì)，在許多組培分化試驗(yàn)中常常作為促進(jìn)分化的植物激素來添加，在本試驗(yàn)中以3 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)逐量添加NAA，篩選出分化率較高的激素配比，最終試驗(yàn)結(jié)果顯示3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織分化形成再生苗的分化率影響最大，分化率達(dá)到81.4%。

因?yàn)榉只囼?yàn)使用的胚性愈傷組織是以美洲狼尾草的種胚誘導(dǎo)形成的，而種胚本身會(huì)發(fā)育原生的胚芽與胚根，所以在分化階段為了區(qū)分原胚芽與再生的不定芽需要在接種前切去原生胚芽與胚根，成功分化的胚性愈傷組織會(huì)形成密集的不定芽芽叢，這些芽叢呈現(xiàn)為顏色深綠葉片厚實(shí)的形態(tài)，每個(gè)芽叢發(fā)育后可形成15-25株美洲狼尾草個(gè)體，此外我們發(fā)現(xiàn)在不添加外源激素的MS培養(yǎng)基中胚性愈傷組織原生胚芽的部位會(huì)繼續(xù)延伸，這樣形成的再生植株不會(huì)產(chǎn)生不定芽的芽叢，可視為由原生胚芽發(fā)育而來的植株，不計(jì)入分化再生數(shù)量。本試驗(yàn)中選用1/2MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基,并未添加額外的添加物來促進(jìn)生根,一方面是因?yàn)?/2MS本身具有促進(jìn)植物生根的能力,另一方面是美洲狼尾草的生根能力比較強(qiáng)[26-28]。

綜上通過選用的種子外植體，我們誘導(dǎo)出了美洲狼尾草的胚性愈傷組織，并促使此愈傷組織分化成為可自然生長(zhǎng)的植株，在此過程中產(chǎn)生的愈傷組織材料和叢生芽對(duì)于美洲狼尾草的遺傳轉(zhuǎn)化研究與育種擴(kuò)繁建立了基本體系。

4 結(jié)論

美洲狼尾草‘斗?！軌蛞苑N胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)再生并形成再生植株，使用5%NaClO消毒 5 min可降低污染率同時(shí)保證發(fā)芽率不受消毒液影響，污染率為 1.33%，發(fā)芽率為86.67%，以MS+3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT+0.1 mg·L-16-BA作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基可高效誘導(dǎo)愈傷組織的形成，誘導(dǎo)率為93.3%，以MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA可促進(jìn)美洲狼尾草胚性愈傷組織的分化，分化率為81.4%。