茍?zhí)鹛?，馬艷娜，吉軼楠，臧國長，鄭軼琦

(河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471000)

“克隆植物”是指在自然條件下能自發(fā)地利用根、匍匐莖或橫生根莖等器官產(chǎn)生具有潛在的獨(dú)立性個體的植物[1]。在高等植物中，克隆植物占到了35%～80%，并且它們在許多生態(tài)系統(tǒng)中處于優(yōu)勢地位[2]?？寺《鄻有允侵敢粋€克隆植物種群基株的數(shù)量水平，能夠反映該克隆種群的有性繁殖程度以及初始建群種的數(shù)量。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對糙葉苔草(Carexscabrifolia)[3]、劍葉金雞菊(Coreopsislanceolata)[4]、海菖蒲(Enhalusacoroides)[5]、穗狀狐尾藻(Myriophyllumspicatum)[6]、羊草(Leymuschinensis)[7]、竹葉眼子菜(Potamogetonmalaianus)[8]等植物進(jìn)行了克隆多樣性研究，表明不同植物間克隆多樣性存在著較大差異。

空間遺傳結(jié)構(gòu)(Spatial genetic structure,SGS)[9]，是物種繁育機(jī)制、繁殖體的散播方式、克隆繁殖模式、環(huán)境異質(zhì)性等因素共同作用的結(jié)果，它反映了植物種群適應(yīng)環(huán)境的能力[10]，有助于理解不同干擾因子對植物種群自然更新、遺傳格局以及種間關(guān)系的影響作用[11-12]，因此對克隆植物空間遺傳結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義。李鈞敏等[13]發(fā)現(xiàn)3個不同斑塊蛇莓(Duchesneaindica)的小尺度克隆結(jié)構(gòu)差異明顯，是因?yàn)槠涫艿江h(huán)境、干擾、突變等因素的強(qiáng)烈影響造成的。左威等[14]發(fā)現(xiàn)在較為單一的生境內(nèi)，活血丹(Glechomalongituba)采取克隆繁殖的模式，其空間遺傳結(jié)構(gòu)較強(qiáng)；而當(dāng)生境較為復(fù)雜時，活血丹采取種子繁殖的模式，其空間遺傳結(jié)構(gòu)較弱。Rico等[15]研究了放牧對石竹(Dianthuscarthusianorum)空間遺傳結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)與未放牧草原上的種群相比，輪流放羊的種群顯示出較弱的空間遺傳結(jié)構(gòu)。Ohsako利用7個微衛(wèi)星位點(diǎn)，研究了克隆植物篩草(Carexkobomugi)的空間遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在小距離范圍內(nèi)篩草的空間遺傳結(jié)構(gòu)顯著正相關(guān)，克隆繁殖在一定程度上對空間遺傳結(jié)構(gòu)有很大貢獻(xiàn)[16]。因此，開展對克隆植物在不同生境條件下空間遺傳結(jié)構(gòu)的研究，有助于闡明該克隆植物空間遺傳結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制。

狗牙根(Cynodondactylon)隸屬于禾本科(Gramineae)，自然條件下以營養(yǎng)繁殖為主[17]。由于其抗逆性強(qiáng)，生命力旺盛，適應(yīng)性廣，匍匐莖發(fā)達(dá)，侵占能力強(qiáng)，不僅能運(yùn)用于園林綠化、固土護(hù)坡還可以作為牧草[18-19]。我國狗牙根種質(zhì)資源豐富,主要分布在我國南方地區(qū)，另外華北省份、新疆、青海等地也有分布[20]，其種內(nèi)變異程度很大[21]。目前，對狗牙根的克隆多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)等方面研究較少。馬艷娜等[22]對采自不同生境的狗牙根進(jìn)行了克隆構(gòu)型和生物量的研究，發(fā)現(xiàn)狗牙根種群的克隆構(gòu)型分為“密集型”和“游擊型”。孫宗玖等[17]對新疆地區(qū)的狗牙根無性系構(gòu)件進(jìn)行了研究比較，由于原始生境的多樣性,導(dǎo)致狗牙根的表型性狀表現(xiàn)出較大的可塑性。趙玉等[23]發(fā)現(xiàn)狗牙根的無性系構(gòu)件的持續(xù)更新主要依靠根莖芽來實(shí)現(xiàn)。由于環(huán)境異質(zhì)性會導(dǎo)致克隆植物的無性系構(gòu)件，為了生存和發(fā)展，調(diào)整其生殖策略導(dǎo)致克隆多樣性的差異，從而形成不同的空間遺傳結(jié)構(gòu)，因此本研究通過SSR分子標(biāo)記對3個不同生境的狗牙根進(jìn)行了克隆多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)的分析，旨在探討各種干擾和生境異質(zhì)性對其克隆多樣性及空間遺傳結(jié)構(gòu)的影響，闡明狗牙根在不同生境中的生長繁衍機(jī)制，了解狗牙根對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 取樣方法

在河南省唐河縣境內(nèi)采集了131份狗牙根材料。樣地概況參見馬艷娜等[22]的報(bào)道，具體生境詳見表1。所選樣地的狗牙根種群都呈帶狀分布，在每個樣地的中間位置設(shè)置1個160 cm×80 cm的矩形樣方(圖1)，每個樣方都被劃分為20 cm×20 cm的正方形網(wǎng)格，在橫縱線的交點(diǎn)處，選取長勢良好，無病蟲害植株的葉片，編號并記錄每個樣本的空間坐標(biāo)，將采集的葉片放入裝有變色硅膠的塑封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 3個狗牙根樣方的生境概況

1.2 總DNA的提取與檢測

采用高效植物DNA提取試劑盒(DP350-02，北京天根生化科技有限公司)提取DNA。所提取DNA的質(zhì)量用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，DNA的純度和濃度利用紫外分光光度儀(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)進(jìn)行檢測，并將DNA溶液稀釋至50 ng·μL-1，放置-20℃保存?zhèn)溆?。從本?shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)篩選的狗牙根SSR引物中，選擇多態(tài)性豐富、重復(fù)性較好、條帶清晰的9對引物(表2)進(jìn)行分析，引物序列、擴(kuò)增反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序參考Wang等[24]的報(bào)道。

表2 本研究所采用的SSR引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)產(chǎn)物在電泳圖譜中的位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，得到0/l矩陣。使用R軟件‘Polysat’程序包‘a(chǎn)ssignClones’功能對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置閾值，閾值范圍內(nèi)的個體被分配到同一克隆組[25]。遺傳多樣性等參數(shù)如Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(h)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、遺傳分化系數(shù)(Gst)以及基因流(Nm)使用POPGENE 1.32 軟件[26]獲得。

克隆多樣性水平通過基株總數(shù)(G)、平均克隆大小(NC)、基因型比率(PD)、基因型分布的均勻度Fager指數(shù)(E)、Simpson多樣性指數(shù)(D)這5個參數(shù)[27]進(jìn)行估算。克隆分布范圍通過計(jì)算基株數(shù)(G)、分株數(shù)(ni)、同一克隆內(nèi)分株間的最大距離(lmax)、最小距離(lmin)、總距離(L)以及平均距離(M)進(jìn)行分析，其中同一克隆內(nèi)分株間的總距離為各分株的直線距離之和，平均距離M=L/ni[28]。利用GenAlEx 6.5[29]計(jì)算3個樣方中每個分株的遺傳距離矩陣，計(jì)算空間自相關(guān)系數(shù)r，并對遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)[30]。利用SPAGeDi 1.2軟件[31]計(jì)算Sp值以進(jìn)一步量化群體空間結(jié)構(gòu)的水平。參考Erichsen等[32]的報(bào)道計(jì)算3個樣方的混交度(Mi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果與遺傳多樣性

利用9對SSR引物對采自3個樣方的131份狗牙根材料進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果見表3。各遺傳參數(shù)表明供試狗牙根材料的遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數(shù)Gst為48.47%，表明48.47%的遺傳變異來自樣方間，51.53%來自樣方內(nèi)部，樣方內(nèi)的遺傳分化大于樣方之間。由Gst估算的狗牙根的基因流較小，僅為0.53。

表3 SSR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性

2.2 克隆多樣性與克隆大小

3個樣方的克隆空間分布情況如圖1所示。結(jié)果顯示3個樣方都是由多克隆組成，共鑒別出46個基株，其中樣方a共檢測到17個基株，樣方b檢測到22個，樣方c檢測到7個。狗牙根各樣方的克隆多樣性結(jié)果見表4，從各項(xiàng)指標(biāo)反應(yīng)，供試的3個樣方中，克隆多樣性水平由高到低依次為：樣方b>樣方a>樣方c。

表4 狗牙根3個樣方的克隆多樣性

圖1 狗牙根3個樣方的個體基因型及克隆空間分布

46個基株通過克隆繁殖共形成了84個分株(表5)。分株間的總距離為2340.59 cm，分株間的最大距離為178.89 cm，最小距離為20.00 cm，平均距離為37.10 cm。樣方a的最大克隆有8個分株，分株總數(shù)為25，克隆大小為3.13，同一克隆內(nèi)分株間的最大和最小距離分別為141.42 cm和20 cm，總距離的范圍40.00～161.42 cm，平均距離的范圍為18.54～80.71 cm。樣方b的最大克隆有5個分株，分株總數(shù)為22，克隆大小為2.44，同一克隆內(nèi)分株間的最大和最小距離分別為161.25 cm和20.00 cm，總距離的范圍20.00～217.82 cm，平均距離的范圍為20.00～108.91 cm。樣方c的最大克隆、分株總數(shù)、克隆大小均為38，同一克隆內(nèi)分株間的最大和最小距離分別為178.89 cm和20 cm，總距離為760 cm，平均距離為20 cm。

表5 狗牙根3個樣方內(nèi)的克隆分株數(shù)和分株間的距離

2.4 空間遺傳結(jié)構(gòu)分析

狗牙根3個樣方的空間自相關(guān)分析結(jié)果如圖2所示。樣方a在空間距離小于20 cm時存在顯著的正空間遺傳結(jié)構(gòu)，在20 cm處空間自相關(guān)系數(shù)最大(r=0.24)，X-軸截距為47.17 cm。樣方b在空間距離小于50 cm時存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)，在40 cm處出現(xiàn)最大空間自相關(guān)系數(shù)(r=0.22)，X-軸截距為66.27 cm，在空間距離大于50 cm時不存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)。樣方c在所研究的距離等級下不存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu),X-軸截距為15.26 cm。Mantel檢測表明樣方b(r=0.15，P=0.01)的遺傳距離和空間距離之間存在顯著正相關(guān)性，而樣方a(r=0.01，P=0.36)和c(r=-0.04，P=0.21)的遺傳距離和空間距離之間均不相關(guān)。

圖2 3個樣方狗牙根的空間自相關(guān)分析

利用SPAGeDi軟件進(jìn)一步量化各樣方的SGS水平，Sp值表明樣方b的空間遺傳結(jié)構(gòu)最強(qiáng)(Sp=0.13)，樣方c的空間遺傳結(jié)構(gòu)次之(Sp=0.12)，而樣方a的空間遺傳結(jié)構(gòu)最弱(Sp=0.06)。

2.5 混交度分析

3個狗牙根樣方混交度在0.37～0.81之間，表明3個樣方中的克隆分布差異較大。樣方a的混交度為0.67，呈現(xiàn)中度混交結(jié)構(gòu)狀態(tài)，樣方b的混交度為0.81呈現(xiàn)出強(qiáng)度混交結(jié)構(gòu)，說明樣方a，b狗牙根的分株間競爭激烈，內(nèi)異質(zhì)性很強(qiáng)，為游擊性策略。樣方c的混交度為0.37，基株混雜程度較低，邊緣明顯，為密集型策略。

3 討論

3.1 克隆多樣性分析

本研究結(jié)果表明，供試狗牙根的克隆多樣性水平高于蛇莓[13](PD=0.20，D=0.64)，也高于Ellstrand等[27]總結(jié)的克隆植物的平均值(PD=0.17，D=0.62)，說明供試狗牙根克隆多樣性水平較高。供試的3個樣方中，樣方b的克隆多樣性水平最高(PD=0.50，D=0.95)，樣方a略低(PD=0.41，D=0.92)，樣方c遠(yuǎn)低于前2個樣方(PD=0.16，D=0.25)。生境異質(zhì)性、基因流、體細(xì)胞突變、繁育方式、取樣策略等會影響植物的克隆多樣性水平[13,27]。樣方a的狗牙根生長在鄉(xiāng)間小路上，有行人和車輛的踐踏，樣方b位于林緣草地，遮蔭較嚴(yán)重，這2個樣方的狗牙根生長環(huán)境受到較多的干擾，狗牙根分配更多的資源給有性繁殖，以逃避不良的生存環(huán)境，因此樣方內(nèi)的基株數(shù)目較多，克隆多樣性和基因型比例較高。樣方c陽光充足，且無人為干擾，生存環(huán)境相對穩(wěn)定，因此該樣方的狗牙根克隆繁殖比例較高，基株數(shù)目少，克隆多樣性較低。Brzosko等[33-34]的研究也表明在干擾生境中，有性繁殖占據(jù)優(yōu)勢，有利于克隆多樣性的提高；而在相對穩(wěn)定的生境中，植物將更多的繁殖資源分配給無性繁殖，其克隆多樣性水平越低。此外，在3個狗牙根樣方中均存在單個分株組成的克隆，這可能是由于體細(xì)胞突變造成的，從而使該植物能夠更好的適應(yīng)環(huán)境[35],李鈞敏等[13]對蛇莓克隆結(jié)構(gòu)的研究中也存在單株組成克隆的現(xiàn)象。

3.2 空間遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究對狗牙根3個不同生境的空間自相關(guān)分析，表明a樣方和b樣方分別在20 cm和50 cm處存在顯著性正相關(guān)。狗牙根為典型的克隆植物，無性繁殖可以使相同基因型的個體聚集，導(dǎo)致短距離內(nèi)呈現(xiàn)正的空間自相關(guān)，從而對植物種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響[36-38]。此外，本研究中狗牙根的空間遺傳結(jié)構(gòu)形成距離低于活血丹，左威等[14]認(rèn)為活血丹較大的空間遺傳結(jié)構(gòu)形成距離可能與其較高的種子萌發(fā)率有關(guān)，狗牙根種子的萌發(fā)率約為48%[39]，遠(yuǎn)低于活血丹(79.3%)，可能導(dǎo)致其空間遺傳結(jié)構(gòu)的形成距離較小。3個樣方狗牙根的Sp值存在差異，b(Sp=0.13)、c(Sp=0.12)樣方的狗牙根存在較高水平的空間遺傳結(jié)構(gòu)，而樣方a(Sp=0.06)的空間遺傳結(jié)構(gòu)較弱。小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)存在與否以及空間遺傳結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度大小與物種分布的生境、基因流以及外界干擾狀況密切相關(guān)[40-41]。樣方c光照、養(yǎng)分等資源充足，不存在任何干擾，克隆繁殖占據(jù)優(yōu)勢，克隆分株呈聚集分布，從而導(dǎo)致小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)較強(qiáng)[42-43]，樣方b較高的空間遺傳結(jié)構(gòu)可能是因?yàn)榉N子傳播受限導(dǎo)致的，在四葉重樓(Parisquadrifolia)空間遺傳結(jié)構(gòu)的研究中也發(fā)現(xiàn)種子傳播受限導(dǎo)致了其較強(qiáng)的空間遺傳結(jié)構(gòu)[44]，而樣方a由于人類和動物的頻繁活動，導(dǎo)致種子的有效傳播距離增加，從而削弱了其空間遺傳結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。

3.3 混交度分析

混交度反映了基因型之間的聚集程度，如果各基因型個體在樣方里各自聚集，不同基因型之間沒有交集，邊緣明顯，混交度低，則為密集型生長策略；如果各基因型個體相互混雜，混交度高，則為游擊型生長策略[45]。Erichsen等[32]利用9對微衛(wèi)星標(biāo)記對小葉椴(Tiliacordata)克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，其混交度為0.48～0.58，居群內(nèi)不同的基因型處于混合狀態(tài)，并采取游擊型的生長策略。本研究中a，b樣方處于中強(qiáng)度混交結(jié)構(gòu)(Mi>0.5)，說明樣方內(nèi)基因型混雜程度較高，這是因?yàn)?個樣方的生境均受到了不同程度的干擾，如遮蔭、車輛碾壓以及人類踐踏，狗牙根通過克隆整合，呈現(xiàn)出游擊型生長策略，樣方內(nèi)的狗牙根表現(xiàn)出強(qiáng)烈的覓食反應(yīng)[1]，該生長策略便于對分散分布資源的獲取和利用，從而占據(jù)更多的生存空間，獲取更多的資源。樣方c的混交度較低，同一基因型聚集較多，這是因?yàn)闃臃絚光照充足，并靠近農(nóng)田，環(huán)境條件較好，狗牙根呈現(xiàn)出密集型的生長策略[1]，該生長策略對獲取集中分布的資源占優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用9對SSR引物分析了3個不同生境小尺度格局狗牙根的克隆多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)供試3個樣方的狗牙根材料克隆多樣性較高，空間遺傳結(jié)構(gòu)與繁育方式、人為干擾以及生境異質(zhì)性密切相關(guān)，同時，狗牙根可采取不同的克隆構(gòu)型來應(yīng)對異質(zhì)性生境。因此，本研究對了解狗牙根進(jìn)化潛力、生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制以及生態(tài)穩(wěn)定性的維持能力等方面具有十分重要的意義。