李曉華 郭欣怡

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350009；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院普通外科，福建 福州 350009）

乳腺癌是全世界婦女常見的惡性腫瘤之一，在我國女性惡性腫瘤中的發(fā)病率也排在第一位[1]。細(xì)胞遷移和侵襲在乳腺癌中已被腫瘤研究者廣泛研究，具體發(fā)生機(jī)制尚未可知，所以對其遷移侵襲的機(jī)制值得我們深入探討。細(xì)胞黏附分子的異常表達(dá)意味著腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2]，整合素家族、選擇素家族，免疫球蛋白超家族及鈣黏素超家族這些都屬于與細(xì)胞遷移相關(guān)的黏附分子。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）主要在各種上皮組織中表達(dá)，是參與細(xì)胞之間黏附連接的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，它通過與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）形成穩(wěn)定的復(fù)合物發(fā)揮相互黏附作用，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。重組蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11（Solute carrier family7 member11，Slc7a11）位于細(xì)胞膜上，它的主要作用是將胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，胱氨酸在胞內(nèi)迅速被還原為半胱氨酸[4]。多項(xiàng)研究表明[5,6]，Slc7a11在乳腺癌組織中的高表達(dá)在介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于Slc7a11促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未有研究，Slc7a11與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的E-cadherin/β-catenin信號(hào)通路是否有關(guān)也尚未可知。本研究擬通過Slc7a11在人乳腺癌細(xì)胞中，對遷移及黏附分子相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控情況，探討Slc7a11對人乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，為臨床上治療乳腺癌腫瘤提供參考價(jià)值

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231于中國科學(xué)院細(xì)胞庫上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞研究所購入。

1.2 儀器與試劑

高糖 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液及青霉素-鏈霉素抗生素均購自Gibco公司，二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxid，DMSO）和兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自Sigma公司，E-cadherin（Cat No：3195）和兔單克隆抗體β-catenin（Cat No：8480）購自美國CST公司，Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG過表達(dá)質(zhì)粒由安徽通用生物股份有限公司合成，其中耗材包含Transwell小室（8 μm）、24孔板、培養(yǎng)皿（美國Coring公司），儀器包含Bio-Rad成像儀、Thermo CO2培養(yǎng)箱、尼康倒置相差顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中放置在37℃、5%二氧化碳（Carbon dioxide，CO2）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察生長情況，密度達(dá)到85%即可傳代。凍存一定數(shù)量的人乳腺癌細(xì)胞后，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，先將MDA-MB-231少量接種于6孔板中，觀察細(xì)胞生長密度達(dá)到80%后用Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，其中一組轉(zhuǎn)染過表達(dá)Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG質(zhì)粒（Slc7a11過表達(dá)組），一組轉(zhuǎn)染sh-Slc7a11質(zhì)粒（干擾Slc7a11表達(dá)組），一組不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒作為對照組，其余實(shí)驗(yàn)操作保持一致。每孔轉(zhuǎn)染4 μg，并用新霉素篩選陽性克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Western blotting檢測

細(xì)胞在六孔板中長滿后提取細(xì)胞總蛋白，加入上樣緩沖液后渦旋30 s混勻后，將金屬煮沸儀調(diào)至95℃，加熱樣品5 min，使蛋白煮沸變性，酶標(biāo)儀測定計(jì)算蛋白濃度。Western blotting免疫印記操作步驟如下：每孔上樣量為30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳1 h，結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，提前裁剪好適宜大小的聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)調(diào)節(jié)電壓為120 V恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜 1 h，用5%的脫脂奶粉放在搖床上均勻封閉1 h，封閉結(jié)束后TBST洗膜進(jìn)行裁剪，然后加入一抗（1:1000）放置4℃冰箱中孵育過夜，第二天以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1:10000）在室溫?fù)u床上孵育2 h，以化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.3 遷移實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)前一天先用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h。用胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)在顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)縮小有少量飄起立刻用培養(yǎng)基終止消化，離心并小心吸棄上層培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗兩遍，用無血清培養(yǎng)基重懸后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)·mL-1。取200μL細(xì)胞懸液加入24孔板Transwell小室的上室，下室加入500 μL含20% FBS的高糖培養(yǎng)基，放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室用4%的多聚甲醛溶液室溫固定15 min，吸棄多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的結(jié)晶紫溶液染色30min，用棉球?qū)⑸鲜壹?xì)胞擦去后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取6個(gè)視野記錄遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4 侵襲實(shí)驗(yàn)

人乳腺癌細(xì)胞用胰酶消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1。在Transwell小室中鋪好基質(zhì)膠，下室加入含20%FBS的高糖培養(yǎng)基500 μL，上室加入200μL細(xì)胞懸液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，吸棄多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的結(jié)晶紫溶液染色30 min，用棉球?qū)⑸鲜壹?xì)胞擦去后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取6個(gè)視野并記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Slc7a11促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，過表達(dá)Slc7a11組E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。Transwell小室細(xì)胞體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穿過細(xì)胞小室的細(xì)胞數(shù)量明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 Slc7a11 基因過表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±SD，n=3）

表1 Slc7a11 基因過表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè)) 細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè)) Slc7a11 E-cadherin β-catenin對照組 108.00±11.67 79.99±11.99 1.00±0.04 1.03±0.05 1.10±0.06 Slc7a11過表達(dá)組 309.67±12.50* 287.33±11.70* 3.80±0.02* 0.43±0.05* 0.67±0.09*

2.2 干擾Slc7a11促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

Transwell小室細(xì)胞體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，干擾Slc7a11組E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），穿過細(xì)胞小室的細(xì)胞量明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 干擾SLC7A11基因表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±SD，n=3）

表2 干擾SLC7A11基因表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè)) 細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè)) Slc7a11 E-cadherin β-catenin對照組 262.337±12.05 214.33±12.05 1.00±0.04 1.00±0.05 1.10±0.05干擾Slc7a11表達(dá)組 60.33±12.50* 46.67±13.94* 0.41±0.03* 1.73±0.10* 1.61±0.03*

2.3 過表達(dá)Slc7a11誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬水平

MDA-MB-231細(xì)胞過表達(dá)Slc7a11后，自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3II的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），p62表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 Slc7a11 基因過表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞自噬蛋白的影響（±SD，n=3）

表3 Slc7a11 基因過表達(dá)后對MDA-MB-231細(xì)胞自噬蛋白的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 Slc7a11 Beclin-1 LC3II p62對照組 1.00±0.04 1.03±0.20 1.09±0.18 1.03±0.08 Slc7a11過表達(dá)組 0.41±0.03* 1.67±0.21* 1.76±0.02* 0.63±0.27*

3 討論

惡性腫瘤后期表現(xiàn)為易擴(kuò)散且易轉(zhuǎn)移，因此臨床上腫瘤患者常常治療無果，需要繼續(xù)二線治療。當(dāng)外界各種理化刺激因素或者自身致病因素導(dǎo)致同質(zhì)細(xì)胞間黏附性降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞都有可能從瘤塊脫落并向其他部位遷移，從局限期轉(zhuǎn)變?yōu)閺V泛期[7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在侵襲性的MDAMB-231中過表達(dá)Slc7a11，與對照組相比，Ecadherin和β-catenin兩個(gè)黏附蛋白明顯降低，侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯升高；與此同時(shí)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II的表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)降低。當(dāng)干擾Slc7a11基因時(shí)，E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)明顯上升，侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)明顯降低。以上結(jié)果表明Slc7a11能夠調(diào)控細(xì)胞自噬促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其主要機(jī)制可能與其下調(diào)細(xì)胞黏附分子E-cadherin/β-catenin復(fù)合體表達(dá)有關(guān)。

據(jù)研究報(bào)道，鈣黏蛋白家族中的E-cadherin蛋白與β-catenin蛋白共同構(gòu)成的E-cadherin/βcateninn復(fù)合體是完成細(xì)胞間黏附的重要黏附分子[8]。E-cadherin蛋白的表達(dá)與婦女乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且E-cadherin蛋白量表達(dá)越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量越多[9]，婦女乳腺癌轉(zhuǎn)移重要的生物學(xué)標(biāo)志之一即E-cadherin蛋白表達(dá)的下調(diào)或缺失[10]，通過檢測E-cadherin蛋白表達(dá)情況來對早期乳腺癌患者的診斷并制定個(gè)體化治療方案具有重要的意義。如果通過干預(yù)使E-cadherin表達(dá)正?；蛱岣咂浔磉_(dá)，對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移可以起到有效抑制作用，成為降低腫瘤初始治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的新的治療靶點(diǎn)。β-catenin作為一種可溶性蛋白在腫瘤細(xì)胞免疫抵抗中奠定了重要得生物學(xué)功能基礎(chǔ)，主要存在于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)則以游離型和結(jié)合型兩種形式存在。β-catenin在正常上皮細(xì)胞和非侵襲性腫瘤細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)中存在少量游離的β-catenin，在經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，β-catenin多分布于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的定位反映了其與E-cadherin的分離[11]。大量研究顯示，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中，E-cadherin和β-catenin都有不同程度的分布異常和表達(dá)下調(diào)[12,13]。因此，不少研究希望通過促進(jìn)或調(diào)節(jié)E-cadherin和βcatenin的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。

Slc7a11為谷胱甘肽的合成提供底物，主要參與調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)、鐵死亡和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，Slc7a11在多種癌組織中高表達(dá)，特別是在對化療和放療等治療有抵抗力的腫瘤中，被認(rèn)為是一種重要的致癌蛋白，對腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后產(chǎn)生多重影響[14,15]。細(xì)胞自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，屬于機(jī)體抵御不良環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制，對維持細(xì)胞穩(wěn)定有著較好的作用。隨著生物學(xué)研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)在腫瘤化療藥物細(xì)胞毒性也發(fā)揮作用。

本研究目前未能對Slc7a11促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行深入探索。目前研究只能說明Slc7a11有促進(jìn)細(xì)胞自噬作用，而自噬又參與了乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究?；诖耍琒lc7a11是一個(gè)非常有價(jià)值的靶點(diǎn)，可通過對其的抑制進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，達(dá)到增強(qiáng)抗癌治療效果。