劉 彤,李王強,劉 丹,劉秀雨,路來風(fēng),2,李貞景,2,郭慶彬,2,王昌祿,2,*

(1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 天津 300457；2.天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室， 天津 300457)

在適宜的溫度和濕度條件下，小麥、玉米等食品原料在生長期和儲藏期都容易受到真菌侵染和真菌毒素的污染[1]。常見的產(chǎn)毒素菌種有鐮刀菌(Fusariumspp.)、青霉菌(Penicilliumspp.)和曲霉菌(Aspergillusspp.)[2]，其中黃曲霉(Aspergillusflavus)廣泛分布于土壤、空氣和腐爛的植物殘渣中，其代謝產(chǎn)物——黃曲霉毒素被認為是對人類健康有直接危害的真菌代謝物，黃曲霉毒素B1(aflataxin B1，AFB1)毒性最強[3-5]。

為從源頭上防止真菌及其毒素對食品的污染，可在原料收獲前后就對產(chǎn)毒真菌進行控制。如在種植過程中，采取輪作、農(nóng)田灌溉、適當(dāng)?shù)碾s草控制等措施[6]；在儲存期間，采用快速干燥、添加化學(xué)物質(zhì)或利用微生物等方法來防止真菌生長和毒素產(chǎn)生[7]。以化學(xué)物質(zhì)為基礎(chǔ)的防治仍然是預(yù)防食品中各種真菌毒素污染的常用措施，但化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)用不僅增加了食品中有毒殘留物的風(fēng)險，而且還導(dǎo)致真菌耐藥性。我國近年來在限制谷物和食品中使用化學(xué)殺菌劑方面做出了很大努力。

微生物作為天然產(chǎn)物的主要來源之一，在防治真菌及真菌毒素污染方面引起了廣泛關(guān)注。在現(xiàn)有研究中，分離到對霉菌有抑制作用的微生物主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、鏈霉菌等[8-11]。在各種微生物中，鏈霉菌(Streptomycesspp.)作為放線菌中種類最多、最典型的革蘭氏陽性需氧菌，在自然界中分布廣泛[12]。鏈霉菌次級代謝途徑復(fù)雜，可產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤劑、酶抑制劑、除草劑和殺蟲劑等，通常不會產(chǎn)生對環(huán)境有污染的有毒殘留物，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13-15]。

微生物可通過產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制霉菌的生長，活性物質(zhì)主要包括蛋白酶[8]、揮發(fā)性有機物[13]、有機酸[9]、抗生素[16]等。帕馬霉素是1979年Mccan等[17]從白黑鏈霉菌ATCC 12461(StreptonycesalbonigerATCC 12461)中分離到的一種新型抗生素。該抗生素對分枝桿菌、真菌和革蘭氏陽性細菌具有活性，并能刺激真菌氣生菌絲的形成[18]。隨著分子質(zhì)量的增大，帕馬霉素穩(wěn)定性增強，但抗菌活性減弱。

本研究以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的白黃鏈霉菌TD- 1為研究對象，利用薄層色譜、硅膠柱層析、高效液相色譜和液相- 質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)手段對鏈霉菌中的活性物質(zhì)——帕馬霉素進行分離，探明其對黃曲霉2219等霉菌的抑制機制，包括對霉菌細胞壁、細胞膜、線粒體等的影響以及對黃曲霉毒素含量和合成調(diào)控基因的影響。本研究從已報道的白黑鏈霉菌[19]、林可鏈霉菌[20]外的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的白黃鏈霉菌TD- 1中分離純化出帕馬霉素，并初步研究其對黃曲霉2219等霉菌的抑制機理。希望本研究可為開發(fā)新型生物防霉劑，降低我國糧食損失，防止食品原料受到霉菌及毒素污染，保證食品安全提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1供試菌株

白黃鏈霉菌TD- 1，從天津市寶坻區(qū)飼料廠周圍土壤中分離篩選得到。專利菌株保藏編號是 CGMCC No.4666。

黃曲霉，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC NO. 2219)；桔青霉(Penicilliumcitrinum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰霉(Botrytiscinerea)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、米曲霉(Aspergillusoryzae)為實驗室保存菌種。

1.1.2主要培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯，200.0 g；葡萄糖，20.0 g；瓊脂，30.0 g；自來水，1 000 mL；pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

ISP4培養(yǎng)基：可溶性淀粉，10.0 g；K2HPO4，1.0 g；MgSO4·7H2O，1.0 g；NaCl，1.0 g；(NH4)2SO4，2.0 g；CaCO3，2.0 g； FeSO4·7H20，1.0 mg；MnCl2，1.0 mg；ZnSO4·7H20，1.0 mg；自來水，1 000 mL；pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

SGG培養(yǎng)基：可溶性淀粉，10.0 g；葡萄糖，10.0 g；甘油，10.0 g；玉米漿粉，2.5 g；蛋白胨，5 g；酵母膏，2.0 g；NaCl，1.0 g；CaCO3，3.0 g；自來水，1 000 mL；pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

PBS緩沖液：NaCl，8.0 g；KCl，0.2 g；Na2HPO4，1.44 g；KH2PO4，0.24 g；蒸餾水，1 000 mL；pH值7.4。

1.1.3主要試劑

羅丹明123、堿式磷酸酶試劑盒，北京索萊寶生物科技公司；甲醇(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)、正己烷(分析純)、二異丙胺(分析純)，天津康科德科技有限公司；乙酸銨(色譜純)，阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；IT- TOF型高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；FEI_Apreo型場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡，美國捷克公司；070- 851型PCR儀，德國Biometra公司；MX3000P型熒光定量PCR儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1霉菌抑制效果的測定

白黃鏈霉菌TD- 1在SGG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 d，發(fā)酵液過0.22 μm無菌濾膜。利用濾紙片法在PDA平板上進行抑制霉菌實驗，將200 μL白黃鏈霉菌TD- 1發(fā)酵液均勻涂布在PDA平板上，在每個平板的濾紙片中分別加入5 μL黃曲霉2219、桔青霉、黑曲霉、灰霉、哈茨木霉和米曲霉的孢子懸浮液(1×106CFU/mL)，每個平板均勻放置3個濾紙片。28 ℃下培養(yǎng)4 d，利用十字交叉法測量霉菌菌落直徑，計算菌落生長抑制率[21]，見式(1)。

(1)

式(1)中，d(對照)為對照組菌落直徑，cm；d(實驗)為實驗組菌落直徑，cm。

1.3.2活性物質(zhì)的分離純化及鑒定

從SGG培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d的白黃鏈霉菌TD- 1發(fā)酵液中提取活性物質(zhì)，發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min離心20 min，取上清液，利用乙酸乙酯和甲醇分別對上清液和菌絲體進行提取。乙酸乙酯和上清液的體積比為2∶1，甲醇和菌絲體的體積比為10∶1，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用甲醇復(fù)溶，合并提取物。利用硅膠柱層析對提取液進行分離，洗脫劑為V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)∶V(二異丙胺)=1∶40∶0.5，用量20 mL，周期2 s/滴，洗脫后的餾分經(jīng)真空濃縮，甲醇復(fù)溶，獲得混合物，利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)及液相- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrometry, LC- MS)進行檢測。

色譜條件：5020- 8973 Inertsustain AQ- C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；DAD檢測器波長，215 nm。進樣梯度：質(zhì)量分數(shù)0.2%的乙酸銨與甲醇體積比為3∶7。進樣量20 μL，時間30 min，流速1 mL/min，柱溫35 ℃。

質(zhì)譜條件：離子模式為ESI+、ESI-，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000 u，霧化器流速1.5 L/min，干燥氣壓強115.0 kPa，離子源溫度200 ℃。

1.3.3霉菌最小抑制濃度的測定

將帕馬霉素質(zhì)量濃度利用二倍稀釋法分別調(diào)整為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0 mg/mL，利用96孔板微量稀釋法測定帕馬霉素對6種霉菌的最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。以0 mg/mL為甲醇溶劑處理組，不添加帕馬霉素作為空白對照組，36 h后沒有變混濁的孔即MIC。

1.3.4霉菌細胞形態(tài)的觀察

利用濾紙片法進行帕馬霉素抑制霉菌實驗，28 ℃培養(yǎng)4 d后從平板上挑取菌絲。利用Li等[22]方法進行掃描電鏡觀察。用質(zhì)量分數(shù)為4%的戊二醛4 ℃下固定12 h，冷凍干燥24 h，研磨成粉。用棉簽蘸取少量菌絲體粉末，將各個樣品用導(dǎo)電膠固定在鋁臺上。用吸耳球吹打掉多余的粉末，離子濺射儀噴金后，置于掃描電子顯微鏡平臺上進行觀察。

1.3.5霉菌細胞膜通透性的測定

通過測定細胞懸浮液的OD260檢測霉菌細胞膜通透性的變化[23]。在PDA平板表面均勻涂布帕馬霉素，待揮干后貼上玻璃紙。在玻璃紙上接種黃曲霉2219等霉菌的孢子懸浮液，28 ℃培養(yǎng)4 d，用PBS緩沖液洗下霉菌菌絲體，4 ℃條件下4 500 r/min離心10 min，取上清液用紫外分光光度計測定OD260值。

1.3.6霉菌能量代謝的測定

采用Yang等[24]所述羅丹明123染色法檢測帕馬霉素處理后霉菌線粒體膜電位的變化。

1.3.7霉菌細胞壁完整性的測定

方法同1.3.5。用帕馬霉素處理黃曲霉2219等6種霉菌后，28 ℃培養(yǎng)4 d，用PBS緩沖液洗下霉菌菌絲體，4 500 r/min離心10 min，取上清液。用堿式磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)試劑盒測定AKP含量，利用酶標儀測定OD510值，根據(jù)繪制的標準曲線計算出酶活力單位。酶活越高，說明細胞壁破壞越嚴重。

1.3.8霉菌中麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)的測定

方法同1.3.5。用帕馬霉素處理黃曲霉2219等6種霉菌后，30 ℃培養(yǎng)3 d，分別離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌兩次至上清液無色，去上清液。按照Kumar等[25]方法對霉菌中麥角甾醇進行提取并測定其質(zhì)量分數(shù)。用式(2)計算麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)。

(2)

式(2)中，A230為上清液于230 nm處的吸光值；A282為上清液于282 nm處的吸光值；m(菌體)為菌體質(zhì)量，g。

1.3.9黃曲霉2219產(chǎn)毒素質(zhì)量濃度的測定

利用濾紙片法進行帕馬霉素抑制黃曲霉2219實驗。分別在培養(yǎng)2、3、4、5 d時從PDA平板上黃曲霉2219菌落邊緣取5個直徑0.6 cm瓊脂塞，利用體積分數(shù)為80%甲醇萃取AFB1，4 500 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)真空濃縮儀濃縮干燥，流動相[V(水)∶V(乙腈)=3∶1]復(fù)溶，進行高效液相色譜檢測。

色譜條件：5020- 8973 Inertsustain AQ- C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；FLD 檢測器波長，365 nm。進樣梯度：V(水)∶V(乙腈)=3∶1。進樣量20 μL，時間15 min，流速1 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3.10黃曲霉毒素生物合成途徑基因表達的測定

利用RT- qPCR法測定帕馬霉素處理組和對照組中黃曲霉毒素生物合成途徑中l(wèi)aeA、aflS、aflM、aflP和aflQ基因表達，驗證帕馬霉素對黃曲霉毒素合成的影響。

根據(jù) NCBI 公布的黃曲霉基因組信息，結(jié)合RT- qPCR引物設(shè)計原則，使用 primer5 軟件設(shè)計引物，以β-tubulin基因為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 RT- qPCR 基因引物Tab.1 Gene primers for RT- qPCR

表2 RT- qPCR 反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of RT- qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著，實驗結(jié)果均采用平均值±標準差表示；采用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白黃鏈霉菌TD- 1對黃曲霉2219等霉菌的抑制作用分析

按照1.3.1方法，對白黃鏈霉菌TD- 1無細胞發(fā)酵液進行抑制黃曲霉2219、桔青霉、黑曲霉、灰霉、木霉、米曲霉等霉菌實驗，計算菌落生長抑制率，結(jié)果見表3。由表3可知：白黃鏈霉菌TD- 1無細胞發(fā)酵液對6種霉菌的生長均具有抑制作用，尤其對黑曲霉和黃曲霉2219有較強的抑制效果，抑制率高于50%；對桔青霉、灰霉、木霉、米曲霉的抑制率在25%～50%。因此，白黃鏈霉菌TD- 1無細胞發(fā)酵液對霉菌具有廣譜抑菌性。一些對植物有危害的病原菌，在采前、采后、運輸、儲藏等不同環(huán)節(jié)都可能使果實產(chǎn)生病害，甚至腐爛，可利用白黃鏈霉菌TD- 1對食品原料中的病原真菌污染尤其是黃曲霉和黑曲霉污染進行生物防治。

表3 白黃鏈霉菌TD- 1 對6種霉菌的抑制作用Tab.3 Inhibition of six kinds of fungus by Streptomyces alboflavus TD- 1

2.2 活性物質(zhì)的鑒定及分析

對白黃鏈霉菌TD- 1上清液和菌絲體中的活性物質(zhì)進行分離純化，結(jié)果見圖1至圖3。由圖1可知，13.5 min的峰為主要活性物質(zhì)，峰面積占比62.516%。對樣品繼續(xù)進行LC- MS檢測，由圖3可知，該混合物的相對分子質(zhì)量包含593、607、621、635和649。利用LC- MS儀器中的結(jié)果分析軟件進行分子式預(yù)測，結(jié)果見表4。由表4可知，活性物質(zhì)的分子式為C34H59NO7、C35H61NO7、C36H63NO7、C37H65NO7和C38H67NO7，判斷其為帕馬霉素- 593、607、621、635、649(pamamycin)；且該物質(zhì)的最大吸收波長為211～221 nm(圖2)，與文獻報道的帕馬霉素的最大紫外吸收波長215 nm相一致[18]。判斷白黃鏈霉菌 TD- 1對黃曲霉2219等霉菌發(fā)揮抑制作用中的活性物質(zhì)為帕馬霉素及其同系物，同系物之間相差一個亞甲基 CH2。

表4 白黃鏈霉菌TD- 1代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的質(zhì)譜信息Tab.4 MS information of active compounds produced by metabolism of Streptomyces alboflavus TD- 1

圖1 白黃鏈霉菌TD- 1代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的HPLCFig.1 HPLC of active compounds produced by metabolism of Streptomyces alboflavus TD- 1

圖2 13.5 min活性物質(zhì)峰的紫外吸收光譜Fig.2 Spectrogram of UV absorption of 13.5 min active compounds peak

圖3 白黃鏈霉菌TD- 1代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的總離子流圖Fig.3 TIC profile of active compounds produced by metabolism of Streptomyces alboflavus TD- 1

2.3 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌的最小抑制濃度分析

采用質(zhì)量濃度為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0 mg/mL的帕馬霉素對黃曲霉2219進行抑菌活性測定，結(jié)果見表5。由表5可知，帕馬霉素對桔青霉的抑制效果最好，僅需0.125 mg/mL帕馬霉素即可對桔青霉產(chǎn)生抑制作用；其次是灰霉，需要0.500 mg/mL帕馬霉素抑制其生長；對于黃曲霉2219、黑曲霉、木霉和米曲霉，帕馬霉素的最小抑制濃度均為1.000 mg/mL。6種霉菌主要為引起食品原料污染的病原菌，在糧食、果蔬的生長、采后或儲藏期間易對植物造成霉菌污染；其中，桔青霉是在柑桔的采后環(huán)節(jié)對其產(chǎn)生嚴重危害，從而引起果實的病害和腐爛[27]。帕馬霉素可考慮作為桔青霉的有效抗菌劑，選擇合適濃度對柑桔采后病害進行防治。

表5 帕馬霉素對6種霉菌的最小抑制濃度Tab.5 MIC of pamamycin for six kinds of fungus

A.孢子空白組, B.孢子甲醇組， C.孢子實驗組， D.菌絲體空白組， E.菌絲體甲醇組， F.菌絲體實驗組。圖4 帕馬霉素對霉菌孢子和菌絲體微觀形態(tài)的影響Fig.4 Effect of pamamycin on morphologies of spores and mycelia of fungus

2.4 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌菌絲形態(tài)的影響

按照1.3.4的方法，利用2 000倍掃描電子顯微鏡觀察帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌孢子和菌絲體形態(tài)的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：帕馬霉素對黃曲霉2219和米曲霉的孢子菌絲體均有明顯的致畸作用，使其形態(tài)發(fā)生明顯改變，失去正常形態(tài)，表現(xiàn)為孢子凹陷，菌絲體扭曲、皺縮以及斷裂；帕馬霉素使桔青霉、木霉和灰霉的菌絲體發(fā)生斷裂，表面不平，嚴重畸形，但對孢子形態(tài)則沒有顯著影響；對于黑曲霉，帕馬霉素使其菌絲體形態(tài)沒有發(fā)生改變，仍可見豐富生長點，但孢子形態(tài)則發(fā)生嚴重塌陷?？梢?，帕馬霉素會使霉菌的孢子和菌絲體形態(tài)發(fā)生不同程度的畸變。

2.5 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌細胞膜通透性的影響

通過測定PBS緩沖液的OD260值研究帕馬霉素對6種霉菌細胞膜通透性的影響，OD260值越高，則細胞膜損傷越嚴重，通透性增加[28]，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知：黃曲霉2219和黑曲霉經(jīng)帕馬霉素處理后，OD260值均升高。帕馬霉素造成黃曲霉2219和黑曲霉的細胞膜結(jié)構(gòu)損傷，改變了通透性，說明黃曲霉2219和黑曲霉對帕馬霉素更為敏感，帕馬霉素對兩者細胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響；帕馬霉素對哈茨木霉和桔青霉的細胞膜無損傷，甚至使米曲霉和灰霉的OD260降低。OD260值的降低可能是由于帕馬霉素使細胞膜的物質(zhì)運輸功能降低，阻礙了胞內(nèi)核酸等物質(zhì)的泄露。

圖5 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌細胞膜的影響Fig.5 Effect of pamamycin on cell membrane of Aspergillus flavus 2219 and other fungus

2.6 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌能量代謝的影響

線粒體是細胞內(nèi)一種細胞器，能為細胞產(chǎn)生能量，是細胞呼吸的主要場所[29]。羅丹明123是一種親脂性陽離子染料，可以通過被動擴散進入細胞并累積在線粒體基質(zhì)中。羅丹明123可以作為熒光強度的指示劑，熒光強度與染料聚集的多少呈正相關(guān)關(guān)系[30]。線粒體膜被損傷，即破壞了線粒體的完整性，從而導(dǎo)致能量的合成能力減弱。帕馬霉素對霉菌的線粒體能量代謝影響見圖6。

*為0.01

6種霉菌經(jīng)帕馬霉素處理后，熒光強度變?nèi)?，表明帕馬霉素破壞了霉菌線粒體膜，影響了線粒體能量代謝，使 ATP合成能力減弱。對于黑曲霉，對照組和帕馬霉素處理組的線粒體熒光強度的差異最顯著(P<0.001)，表明帕馬霉素對黑曲霉的線粒體膜損傷最嚴重，并減弱其合成 ATP 的能力；帕馬霉素對黃曲霉2219和米曲霉的線粒體膜電位也具有非常明顯的破壞作用，影響代謝使其不能正常產(chǎn)生能量；木霉、桔青霉和灰霉的線粒體熒光強度也有所減弱，但帕馬霉素對其破壞能力不明顯。

2.7 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌細胞壁完整性的影響

細胞壁存在于細胞膜外，維護細胞形態(tài)，對細胞起到保護作用。當(dāng)細胞壁發(fā)生破壞時，細胞膜和細胞壁之間的AKP就會滲出到胞外[31]。因此，可以通過測定細胞外AKP含量的變化，間接反映白黃鏈霉菌TD- 1產(chǎn)生的活性物質(zhì)——帕馬霉素對細胞壁的影響。實驗結(jié)果見圖7。

*為0.01

由圖7可知，經(jīng)帕馬霉素處理后，霉菌胞外的AKP含量均顯著升高，表明帕馬霉素損傷了霉菌細胞壁，阻礙了物質(zhì)運輸和信息傳遞。尤其可以看出，帕馬霉素處理后的黃曲霉2219胞外AKP含量明顯升高，破壞了進入黃曲霉2219細胞內(nèi)部的第一屏障；對于米曲霉和黑曲霉，帕馬霉素對其細胞壁也具有較強的破壞能力，使胞外AKP 含量顯著升高(P<0.001)；桔青霉、灰霉和木霉經(jīng)帕馬霉素處理后，位于細胞壁和細胞膜之間的AKP也不同程度地滲透到胞外，具有顯著性差異(P<0.001)?？梢?，帕馬霉素可以顯著破壞霉菌細胞壁的完整性。

2.8 帕馬霉素對黃曲霉2219等霉菌麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)的影響

麥角甾醇是細胞膜的組成成分，有利于維持細胞活力和酶活性，保證流動性和完整性，促進物質(zhì)的運輸[32]。帕馬霉素對霉菌麥角甾醇含量影響的實驗結(jié)果見圖8。由圖8可知：經(jīng)帕馬霉素處理后，除米曲霉外，其他菌絲細胞膜中麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)均降低，表明帕馬霉素可抑制菌絲細胞膜中麥角甾醇的生物合成，并通過這種作用使菌絲不能正常生長；尤其是木霉菌細胞膜中的麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)經(jīng)帕馬霉素處理后有極顯著降低(P<0.001)；帕馬霉素對黃曲霉2219、黑曲霉和灰霉細胞膜中麥角甾醇的作用也非常顯著(P<0.01)；帕馬霉素也使桔青霉細胞膜中麥角甾醇的質(zhì)量分數(shù)降低，但與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。米曲霉細胞膜中麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)升高，可能由于甲醇溶劑與麥角甾醇間的作用，促進了麥角甾醇的合成。

*為0.01

2.9 帕馬霉素對黃曲霉2219產(chǎn)毒素質(zhì)量濃度的影響

本研究實驗結(jié)果表明，帕馬霉素能夠抑制黃曲霉2219的生長。而黃曲霉2219在生長狀態(tài)下可以合成致癌的黃曲霉毒素。利用帕馬霉素處理黃曲霉2219，每天測定AFB1的質(zhì)量濃度，判斷帕馬霉素對黃曲霉毒素質(zhì)量濃度的影響，實驗結(jié)果見圖9。黃曲霉2219生長3 d后開始產(chǎn)生AFB1，空白組質(zhì)量濃度為45.5 ng/mL。在第3天時帕馬霉素對AFB1發(fā)揮最大作用，使其質(zhì)量濃度下降 98.3%。隨著時間的增長，空白組中的AFB1質(zhì)量濃度逐漸升高，實驗組仍未檢出AFB1；同時，甲醇組AFB1質(zhì)量濃度開始下降，此時可能由于帕馬霉素的不穩(wěn)定性導(dǎo)致甲醇溶劑開始對AFB1發(fā)揮作用[33]，但其中帕馬霉素使AFB1質(zhì)量濃度下降了65.7%，仍發(fā)揮主要作用?？梢?，帕馬霉素可使黃曲霉2219產(chǎn)生AFB1的質(zhì)量濃度得到有效控制，尤其在第3天開始合成AFB1時，帕馬霉素即可顯著抑制其合成。

2.10 帕馬霉素對黃曲霉毒素生物合成途徑中基因表達的影響

*為0.01

為驗證白黃鏈霉菌TD- 1所產(chǎn)帕馬霉素是否可以下調(diào)黃曲霉2219的毒素合成、調(diào)控基因的表達，選取了曲霉屬的關(guān)鍵全局調(diào)控基因laeA，黃曲霉毒素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因aflM、aflP和aflQ以及調(diào)控基因aflS為目的基因，對相關(guān)基因表達量進行測定，結(jié)果見圖10。由圖10可知，除laeA外，aflM、aflP、aflQ和aflS等目的基因均在1.00 mg/mL帕馬霉素處理下表達量下降，尤其aflP下降了1.72倍，而laeA在0.50 mg/mL帕馬霉素處理下表達量可顯著下降3.64倍，由此可見，帕馬霉素可以降低黃曲霉毒素合成和調(diào)控基因的表達。

圖10 帕馬霉素處理對AFB1生物合成基因表達量的影響Fig.10 Effect of pamamycin on AFB1 biosynthetic gene expression

3 結(jié) 論

為降低糧谷類的損失，保障人類健康和食品安全，一些天然產(chǎn)物作為化學(xué)殺菌劑的替代品被廣泛用于食品工業(yè)。從白黃鏈霉菌TD- 1中分離純化出了活性物質(zhì)——帕馬霉素，研究發(fā)現(xiàn)，其對黃曲霉2219等霉菌的生長具有明顯的抑制作用，MIC為0.125～1.000 mg/mL。經(jīng)帕馬霉素處理后的霉菌，其孢子和菌絲體的形態(tài)會發(fā)生不同程度的畸變。帕馬霉素破壞霉菌細胞壁的完整性，影響霉菌的線粒體能量代謝，使 ATP 合成能力減弱，并使黃曲霉2219和黑曲霉細胞膜損傷，改變其通透性；帕馬霉素還可使除米曲霉外的其他霉菌菌絲細胞膜中麥角甾醇質(zhì)量分數(shù)降低，表明帕馬霉素能抑制菌絲細胞膜中麥角甾醇的生物合成，并通過這種作用使霉菌菌絲不能正常生長。帕馬霉素對黃曲霉2219產(chǎn)AFB1的抑制效果更強，在黃曲霉2219生長至第3天時，帕馬霉素即使AFB1的質(zhì)量濃度下降了98.3%。經(jīng)過驗證，帕馬霉素可以降低黃曲霉毒素的合成，當(dāng)其質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，可使黃曲霉毒素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因aflP表達量下降1.72倍；當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL時，曲霉屬關(guān)鍵全局調(diào)控基因laeA表達量下降了3.64倍。本研究表明，利用白黃鏈霉菌TD- 1等微生物可以防治食品原料中的黃曲霉等霉菌污染。未來還將對帕馬霉素調(diào)控黃曲霉毒素生物合成的分子機制進行深入研究。