路子佳，范春雪，辛 念，謝 瑤,*

(1.北京東方紅航天生物技術股份有限公司， 北京 100043；2.北京理工亙舒科技有限公司， 北京 100081)

肝纖維化是肝損傷、肝炎等問題導致的肝星形細胞被激活，肝內膠原纖維發(fā)生異常增生的病理過程[1-2]。研究表明，早期肝纖維化具有可逆轉性，采用調整膳食結構及制劑干預等方式可以改善肝組織的病理情況，包括降低肝纖維化指標、減少炎癥細胞的浸潤等[3-4]。

靈芝是我國傳統(tǒng)藥食兩用真菌，具有幾千年的食用歷史?，F代研究發(fā)現，靈芝中多種活性成分具有良好的肝臟保護作用，其中含量最高的是靈芝多糖和三萜類化合物，以及多種微量成分，包括生物堿、核苷、甾醇、多肽、氨基酸等[5-6]。在靈芝成熟期，靈芝孢子從菌蓋彈射出來，呈淡霧狀，含有靈芝子實體幾乎所有的活性物質，其中總三萜、總多糖含量明顯高于靈芝子實體[7]。目前，關于靈芝在肝臟保護作用及機制方面的研究已有較多報道，但相關研究主要集中在靈芝子實體、靈芝孢子、靈芝提取物對肝損傷的保護作用，發(fā)揮作用的有效成分通常被認為是靈芝多糖、三萜類等。而對于靈芝孢子油(Ganodermalucidumspore oil，GSO)的研究較少。

GSO是以破壁靈芝孢子粉經二氧化碳超臨界萃取得到的脂溶性混合物，其主要成分為脂肪酸、靈芝三萜、甾醇等[8-10]。趙灝等[11]研究發(fā)現，GSO能顯著降低四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化大鼠血漿谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)的水平，降低肝組織中丙二醛(MDA)的含量，減輕肝臟纖維化程度。三萜類物質作為靈芝的主要活性成分之一，能有效改善乙酰氨基酚誘導的肝損傷，降低血清中ALT、AST和乳酸脫氫酶水平以及肝組織中MDA含量，提高肝臟還原型谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]。Li等[13]研究發(fā)現，靈芝三萜灌胃后，雞肝臟中抗氧化酶的活性提高，鎘累積、MDA含量以及炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6等的水平均出現顯著下降。由此可見，GSO可以通過抗氧化和抗炎等途徑對肝損傷起到改善作用，其保肝活性可能與含有三萜類化合物活性成分相關。

CCl4是一種較為常用的肝損傷誘導劑，所致的肝損傷可導致肝纖維化的發(fā)生，最終發(fā)展為肝硬化[14-15]。采用低濃度的CCl4配合高脂飼料造模還可以模擬日常生活中高熱量等飲食因素對肝纖維化的影響，如脂肪在肝細胞內積累，細胞內脂肪空泡增多等，使研究更貼近于臨床實際[16]。本研究旨在通過對不同濃度的GSO對CCl4聯合高脂飼料喂養(yǎng)致肝纖維化大鼠的肝功能損傷、氧化損傷及肝纖維化的影響進行研究，探究其可能的機制，以期為GSO在保護肝部健康及肝纖維化的改善方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠(體質量150～170 g)60只，中國食品藥品檢定研究院[許可證號：SCXK(京)2017-0005]。普通生長飼料(22023211)，北京科澳協(xié)力飼料有限公司。高脂飼料(20210463)，北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：京飼證(2019)06076]。各組大鼠均飼養(yǎng)于北京理工大學SPF級實驗動物中心(動物倫理號：SYXK-BIT-20211223025)，12 h晝夜循環(huán)、溫度(22±2)℃、濕度50%±5%環(huán)境下，動物均自由進食飲水。

1.2 材料與試劑

復方鱉甲軟肝片(國藥準字：Z19991011)，內蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司；CCl4(CAS：56-23-5)，北京普諾欣生物科技有限公司；ALT測試盒(貨號：C009-2-1)、總膽紅素(TBIL)試劑盒(貨號：C019-1-1)、AST測試盒(貨號：C010-2-1)、堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(貨號：A059-2-2)、羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒(貨號：A030-2-1)、MDA測試盒(貨號：A003-1-2)、GSH測試盒(貨號：A006-2-1)、SOD測試盒(貨號：A001-3-2)，南京建成生物工程研究所；透明質酸(HA)測試盒、層黏蛋白(LN)測試盒、Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)測試盒、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)測試盒、MMPs組織抑制物-1(TIMP-1)測試盒，上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

C3M型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JY6001型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；HHS-4S型水浴鍋，上海光地儀器設備有限公司；5 mL肝素鈉抗凝采血管，石家莊康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1靈芝孢子油的制備

將破壁靈芝孢子粉過60目篩后置于萃取釜中，在壓力30 MPa、溫度45 ℃、二氧化碳流速2.0～2.5 m3/h的條件下萃取4 h，減壓蒸餾后得淡黃色透明的GSO。經測定，GSO過氧化值為1.1 mg/g，含有總三萜(以齊墩果酸計，310 mg/g)、麥角甾醇(1.12 mg/g)[17]。GSO中剩余成分以脂肪酸為主[8,18]。

1.4.2動物分組及處理

SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，按照體質量隨機分為空白對照組(BC)、模型對照組(MC)、陽性藥物組(PC)、靈芝孢子油低(GSOL)、中(GSOM)、高(GSOH)劑量組，每組10只大鼠。BC大鼠不造模，使用普通生長飼料進行飼養(yǎng)。其余各組大鼠連續(xù)灌胃含有體積分數為0.40的CCl4的玉米油6周，每周2次，按照大鼠體質量首次灌胃5 mL/kg，其余每次灌胃3 mL/kg，同時使用高脂飼料進行飼養(yǎng)，建立大鼠肝纖維化模型[19]。造模的同時開始灌胃GSO和陽性對照藥物。按照大鼠體質量進行灌胃處理，MC大鼠灌胃玉米油，PC大鼠灌胃復方鱉甲軟肝片540 mg/kg，GSOL、GSOM、GSOH大鼠分別灌胃900、2 700、5 400 mg/kg的GSO。所有大鼠每日灌胃1次，連續(xù)8周。

陽性藥物復方鱉甲軟肝片適應用慢性肝炎，脂肪肝等多種原因所引起的肝纖維化[20]。靈芝孢子油人體推薦量為2 g/d，按成人體質量70 kg計算，人體推薦劑量為28.6 mg/kg，按人體推薦量的5、15、30倍劑量給大鼠灌胃[21]。實驗期間，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)。每周測定各組大鼠體質量、飲水量、進食量。

1.4.3指標測定

GSO干預8周后，采用質量分數為10%的水合氯醛溶液，按照大鼠體質量(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。負壓采血管(肝素抗凝管)腹主動脈取血，室溫靜置2 h，2 500 r/min、4 ℃離心15 min，分離血漿。解剖取肝臟，按質量(g)與體積(mL)比1∶9，加入生理鹽水，冰水浴條件下，制備肝臟組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。微板法及ELSA法檢測血漿中ALT、AST、TBIL、Hyp、AKP、HA、LN、Col Ⅳ的水平，及肝組織中SOD活性和MDA、GSH、MMP-9、TIMP-1的含量。

1.4.4肝組織病理檢測

取大鼠左葉肝臟，制作石蠟切片后，進行蘇木精- 伊紅(HE)染色、顯微鏡觀察；石蠟切片脫蠟水化后進行Masson染色、顯微鏡觀察，具體操作步驟參照文獻[22]。使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡選取組織的目標區(qū)域進行200倍成像。Masson染色結果使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，測定膠原纖維累積光密度值(integral optimistically，IOD)、組織像素的面積(Area)，計算膠原面積占比及面密度(IOD/Area)。

1.5 數據處理

2 結果與討論

2.1 GSO對大鼠存活率和體質量的影響

肝纖維化大鼠生存情況見表1。由表1可知，BC大鼠在8周的實驗期間無死亡，而MC大鼠及GSOL、GSOM大鼠出現死亡情況。在前6周的CCl4聯合高脂飲食誘導期間，MC和GSOM大鼠死亡1只，2組大鼠存活率降低至90%。在CCl4聯合高脂飲食誘導后2周期間，MC、GSOL、GSOM大鼠繼續(xù)出現死亡數量增加的趨勢，其中MC和GSOL大鼠死亡數量最高，存活率降低至70%。對照藥物和高劑量GSO干預能夠有效降低肝纖維化大鼠的死亡率，GSOM大鼠的存活率上升至80%。高劑量GSO保護效果最優(yōu)，大鼠存活率達到100%。由表1可知，實驗開始前后各組大鼠體質量差異不顯著(P>0.05)。實驗結果表明，GSO可以改善實驗大鼠的生存狀態(tài)，對CCl4聯合高脂飼料造大鼠肝纖維化模型具有明顯的提升大鼠存活率作用。

表1 大鼠存活率及體質量Tab.1 Survival rate and body weight of rats

2.2 GSO對大鼠肝組織病理變化的影響

大鼠肝臟切片HE染色結果見圖1。由圖1可知，BC大鼠肝小葉結構、肝細胞大小正常，匯管區(qū)未見纖維組織增生及炎細胞浸潤，無脂肪變性等異常。采用CCl4配合高脂飼料造模后，MC、GSOL、GSOM大鼠的肝組織出現不同程度的肝損傷病變。MC大鼠的肝臟組織出現明顯的肝索和肝血竇紊亂，匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見明顯的膠原纖維增生、炎性細胞浸潤、靜脈間互相連接，形成纖維橋接(黑色箭頭)。同時MC大鼠肝臟組織還伴隨匯管區(qū)周圍膽管增生、膽管輕度擴張(綠色箭頭)，出現明顯的肝細胞脂肪變性、肝細胞體積增大。MC大鼠肝臟胞質內可見大量甘油三酯蓄積導致的圓形空泡(黃色箭頭)，出現較多的肝細胞水腫、胞質疏松淡染(紅色箭頭)。肝臟組織切片形態(tài)觀察結果顯示，與MC大鼠相比，陽性藥物和GSO干預能夠顯著緩解肝纖維化大鼠相應癥狀。PC大鼠肝臟出現脂質沉積、纖維橋接、膽管增生和擴張等癥狀減輕。GSO干預也顯著抑制了大鼠肝纖維化的進展，GSOM大鼠肝臟僅出現少量的脂質沉積。而高劑量GSO干預的保護效果最優(yōu)，大鼠肝臟組織形態(tài)基本恢復至正常狀態(tài)。研究結果證實，GSO能夠顯著改善肝纖維化病變，并與PC大鼠相比，GSO還顯著抑制了高脂飲食導致的肝脂肪變性。

黑色箭頭標識纖維形成，綠色箭頭標識膽管病變，黃色箭頭標識脂質積累，紅色箭頭標識細胞病變。圖1 大鼠肝臟HE染色Fig.1 HE staining of rat liver

大鼠肝臟切片Masson染色結果如圖2。由圖2可知，MC大鼠肝臟組織出現不同靜脈間增生的膠原纖維(藍色)互相連接形成假小葉(橙色箭頭)。GSO干預組大鼠肝組織病理變化較MC組均有改善，其中高劑量GSO改善效果最優(yōu)，GSOH大鼠的肝組織大部分肝細胞結構完整、排列整齊，炎性細胞浸潤、膽管擴張、脂肪變性、細胞水腫等異常改變明顯減輕。膠原面積占比及面密度結果顯示，MC大鼠肝臟組織膠原面積占比及面密度均極顯著高于BC大鼠(P<0.01)。而與MC相比，GSOM、GSOH膠原面積占比值及面密度顯著降低。實驗結果表明，GSO可顯著改善CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝臟病變。

橙色箭頭標識假小葉。與BC比較，*表示差異具有顯著性(P<0.05)，** 表示差異具有極顯著性(P<0.01)；與MC組比較，#表示差異具有顯著性(P<0.05)，## 表示差異具有極顯著性(P<0.01)。圖2 大鼠肝臟纖維化分析Fig.2 Analysis of liver fibrosis in rats

2.3 GSO對大鼠肝功能的影響

各組大鼠肝功能相關指標檢測結果見圖3。如圖3所示，與BC大鼠比較，MC大鼠血漿中ALT、AST、TBIL、AKP水平極顯著升高(P<0.01)。而與MC大鼠比較，陽性藥物、中、高劑量GSO可以顯著降低肝纖維化引起的血漿ALT、AST、AKP的升高，PC、GSOM、GSOH大鼠血漿中ALT水平分別降低36.1%、55.2%、44.6%，AST水平分別降低30.2%、36.3%、35.0%，AKP水平分別降低23.5%、33.6%、33.8%。與MC組比較，PC和GSO干預組均可以極顯著改善由于CCl4聯合高脂飲食誘導引起的大鼠血漿TBIL水平的升高(P<0.01)。相較于MC，PC、GSOL、GSOM、GSOH大鼠血漿TBIL水平分別降低了54.7%、35.6%、64.0%、55.9%。且與BC大鼠相比，PC和GSO干預組大鼠血漿TBIL水平差異不顯著(P>0.05)。在4項肝功能指標中，GSOM和GSOH大鼠的肝功能指標水平與PC大鼠不具有顯著性差異(P>0.05)。實驗結果表明，GSO能夠顯著改善CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝損傷，并且中、高劑量GSO對于肝損傷的保護效果與陽性藥物一致。

各組大鼠肝臟氧化應激指標檢測結果見圖4。由圖4可知，與BC大鼠比較，MC大鼠肝組織中MDA含量顯著升高(P<0.01)，GSH含量與SOD活性顯著降低(P<0.01)。而與MC組比較，陽性藥物和高劑量GSO可以顯著降低大鼠肝損傷引起的肝臟MDA含量的升高(P<0.01)，顯著升高GSH含量(P<0.05)，其中MDA含量分別降低了11%、19%，GSH含量分別升高9%、12%。陽性藥物和中、高劑量GSO則可顯著提高肝纖維化大鼠肝組織中SOD活性，分別提高13%、12%、19%。同時，高劑量GSO對于肝臟氧化應激指標的改善，與PC大鼠相比不具有顯著性差異(P>0.05)。實驗結果表明，高劑量GSO能夠顯著改善CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝臟氧化應激，并且其保護作用與陽性藥物的保護效果一致。

2.4 GSO對大鼠肝纖維化的影響

大鼠血漿肝纖維化相關指標檢測結果見圖5。由圖5可知，與BC大鼠比較，MC大鼠血漿中HA、LN、Col Ⅳ、Hyp的含量均出現極顯著升高(P<0.01)。而與MC比較，GSOH大鼠血漿中HA的含量降低15.9%，LN的含量降低6.8%，且差異均具有顯著性(P<0.05)。同時，GSOM、GSOH大鼠血漿中Col Ⅳ的含量分別降低9.0%、9.7%，Hyp的含量分別降低14.6%、26.5%，且差異均具有顯著性。高劑量GSO對于肝纖維化指標的改善效果與陽性藥物之間的差異不具有顯著性(P>0.05)。實驗結果表明，高劑量GSO能夠顯著改善CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝臟纖維化，并且其保護作用與陽性藥物的保護效果一致。

2.5 GSO對大鼠肝臟MMP-9和TIMP-1蛋白水平的影響

大鼠肝纖維化相關蛋白表達水平如圖6。由圖6可知，與BC大鼠比較，MC大鼠肝組織中MMP-9水平明顯降低(P<0.05)。而陽性藥物與GSO干預均不同程度升高肝組織中MMP-9水平，其中GSOH大鼠肝組織中MMP-9水平升高最為顯著(P<0.05)，其MMP-9水平提高7.16%。與BC組比較，MC大鼠肝臟的TIMP-1水平明顯升高(P<0.05)；陽性藥物與GSO干預均不同程度的降低，其中PC大鼠肝臟TIMP-1水平降低最為顯著(P<0.05)，其水平降低11.9%。實驗結果表明，高劑量GSO能夠顯著改善CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝纖維化相關蛋白表達改變，并且其保護效果可能依賴MMP-9的表達。

與BC比較，*表示差異具有顯著性(P<0.05)，**表示差異具有極顯著性(P<0.01)；與MC組比較，#表示差異具有顯著性(P<0.05)，##表示差異具有極顯著性(P<0.01)。圖3 大鼠血漿肝功能相關指標Fig.3 Liver function related-indexs of rat plasma

與BC比較，*表示差異具有顯著性(P<0.05)，**表示差異具有極顯著性(P<0.01)；與MC組比較，#表示差異具有顯著性(P<0.05)，##表示差異具有極顯著性(P<0.01)。圖4 大鼠肝組織氧化應激水平Fig.4 Level of oxidative stress in rat liver tissues

與BC比較，*表示差異具有顯著性(P<0.05)，**表示差異具有極顯著性(P<0.01)；與MC組比較，#表示差異具有顯著性(P<0.05)，##表示差異具有極顯著性(P<0.01)。圖5 大鼠血漿肝纖維化相關指標Fig.5 Liver fibrosis indexs of rat plasma

與BC比較，*表示差異具有顯著性(P<0.05)；與MC組比較，#表示差異具有顯著性(P<0.05)。圖6 大鼠肝臟MMP-9與TIMP-1水平Fig.6 Level of MMP-9 and TIMP-1 in rat liver

3 討 論

CCl4致肝損傷時，會使血漿中ALT、AST、TBIL水平升高，同時還可降低肝組織中GSH水平及SOD活性，引起脂質過氧化，從而使得MDA含量激增，這些指標的變化程度與肝細胞或組織的受損程度密切相關。采用GSO進行干預后，肝纖維化大鼠肝組織結構得到不同程度的改善，其中GSOH大鼠的肝組織與MC比較，大部分肝細胞結構完整且排列整齊，炎性細胞浸潤、膽管擴張、脂肪變性、細胞水腫等異常改變明顯減輕，同時可顯著降低大鼠血漿中ALT、AST、TBIL、AKP水平及大鼠肝臟組織中MDA的水平，提高GSH含量與SOD活性，證明GSO具有提高肝臟抗氧化能力的作用，可改善肝功能、減輕肝損傷。

當肝細胞損傷使周圍非實質細胞受到不斷刺激，導致HA、LN、Col Ⅳ、Hyp等肝臟細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)大量形成并沉淀，進而導致肝組織結構破壞，肝纖維化的形成[23-24]。其中HA 由肝間質細胞合成，其水平與肝內纖維量及肝細胞受損程度呈正相關[25-26]。LN為基底膜中特有，是慢性肝炎、肝硬化及肝癌指標[26]。Col Ⅳ在肝纖維化時最早出現，纖維組織生成過程中大量沉積，是肝纖維化早期與肝硬化的重要指標之一[27]。Hyp是膠原代謝的重要產物，是組織纖維化檢測的基本指標[28]。MMP-9具有降解ECM中的各種蛋白成分等作用[29]；而蛋白酶抑制劑TIMP-1則具有抑制MMP-9的表達的作用，因此MMP-9/TIMP-1信號轉導失調是促進肝纖維化及肝癌發(fā)展的重要原因[29-30]。采用GSO進行干預后，各給藥組大鼠肝臟不同靜脈間膠原纖維增生的情況明顯改善。其中GSOH大鼠的肝臟膠原面積占比值及面密度、血漿中肝纖維化指標(HA、LN、Col Ⅳ、Hyp)水平顯著降低。同時，GSOH大鼠的肝臟MMP-9表達水平顯著上調(P<0.05)，而TIMP-1表達下調未出現顯著差異。研究結果證明，GSO具有抗肝纖維化的作用，包括降低ECM含量、抑制ECM的形成。因此，本研究推測GSO發(fā)揮保肝作用機理與其調控MMP-9的表達有關。

本研究結果與趙灝等[11]、胡宗苗等[31]采用注射 CCl4構建肝纖維化模型，并以GSO、破壁靈芝孢子粉進行干預的研究結果一致。同時，結合陳潔等[32]、敖艷霞等[12]對靈芝三萜在肝保護方面的研究結果，即靈芝三萜可降低肝臟中MDA水平，提高肝臟GSH水平和SOD活性，能通過下調TGF-β1 mRNA、MMP-2蛋白的表達抑制肝組織的纖維化。推測GSO中起到減輕肝損傷、抑制肝臟纖維化的作用與其含有的生物活性成分三萜類化合物有關。

4 結 論

本研究結果表明，靈芝孢子油可以改善CCl4聯合高脂飲食誘導的肝纖維化大鼠生存狀態(tài)和肝損傷。高劑量GSO干預可顯著改善肝組織病理情況，降低血漿肝功能相關指標(ALT、AST、TBIL)水平及肝組織中MDA含量，提高GSH含量與SOD活性。本研究結果表明，中、高劑量GSO(人體推薦量的15、30倍劑量)能夠提高肝抗氧化能力，減輕肝損傷。同時，GSO干預可降低大鼠血漿HA、LN、Col Ⅳ、Hyp的含量，顯著升高肝臟MMP-9蛋白的表達，具有抑制肝臟纖維化的作用，其作用機理可能與調控MMP-9/TIMP-1信號通路有關。本研究旨在探究GSO改善肝纖維化的規(guī)律及作用機制，以期為GSO在保護肝臟健康及肝纖維化的改善方面提供科學依據。