宋正鋒，劉媛媛，戚鵬，談仙星，馬磊

腦缺血是一種發(fā)病率、致殘率和病死率均較高的腦血管疾病，在全球所有因病死亡原因排名中僅次于缺血性心臟?。?］。目前，臨床常用的腦缺血治療方法是及時恢復大腦血液灌注，但會造成腦缺血再灌注損傷［2］。有研究顯示，在腦缺血再灌注損傷中，腦細胞的生物膜結(jié)構(gòu)和線粒體功能被破壞，并觸發(fā)線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑和死亡受體途徑的細胞凋亡［3］。研究表明，微小核糖核酸-15b（microRNA-15b，miR-15b）能夠以凋亡抑制基因B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）為靶點，下調(diào)Bcl-2 的表達以促進細胞的凋亡過程［4］。而心肌缺血再灌注損傷會誘導miR-15b 的表達上調(diào)［5］，但miR-15b在腦缺血再灌注損傷中的具體功能尚不清楚。本研究通過構(gòu)建大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞缺血再灌注損傷模型，探討miR-15b 基因干擾對腦缺血再灌注損傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 5只新生24 h內(nèi)無特定病原體（SPF）級Wistar 乳鼠，雌雄不限，體質(zhì)量（17．59±2．35）g，購自南通大禹生物技術(shù)有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0008］；293 T細胞購自美國Sciencell 公司（批號T191203）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自廣州兆康生物科技有限公司（批號1915142）；兔抗鼠角質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體購自美國Merck 公司（批號190417C）；氮蘭四唑鹽（methyl tetrazolium salt，MTS）溶液購自上海羽哚生物科技有限公司（批號181203）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自日本TAKARA 公司（批號RR820A）；兔抗鼠Bcl-2、胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-9 單克隆抗體，羊抗兔Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 多克隆抗體購自美國Merck 公司（批號190225A、181006A、191117C、180526A、190718B、191225C）；pMiR-LucTM熒光素酶報告載體購自廣州伯信生物科技有限公司（批號1915179）。HALO MPR-96 型酶標儀購自英國Dynamica 公司；LABOSPECT 006 型自動生化分析儀購自日本Hitachi公司；Attune NxT型流式細胞儀購自美國Invitrogen公司；S1000?384 Well 型PCR 儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；MSMINIONE 型電泳儀購自英國Cleaver 公司；ZF-258型凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 取新生24 h以內(nèi)的Wistar 乳鼠，碘伏消毒后，在無菌環(huán)境下剪開頭皮和顱骨，分離出雙側(cè)大腦皮層，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后將大腦皮層剪碎。用胰蛋白酶消化20 min，加入3 mL 含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液并加入DMEM培養(yǎng)液，反復吹打成單細胞懸液。經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾后，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1．0×106個/mL，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)50 min，更換培養(yǎng)瓶并棄去未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)50 min，24 h后換液去除懸浮死亡細胞，每3 d換液1次，經(jīng)過9～11 d細胞融合為單層細胞即可傳代培養(yǎng)。

1.2.2 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞傳代培養(yǎng) 棄去原培養(yǎng)瓶內(nèi)DMEM 培養(yǎng)基，用D-Hanks 液清洗2 次，加入0．1%的胰酶，倒置相差顯微鏡下觀察。待細胞間隙增大、大部分細胞突起回縮且細胞形態(tài)略變圓時，棄去酶液，加入完全培養(yǎng)基以終止消化，反復吹打制成單細胞懸液。以1．0×104個/mL的細胞密度重新接種在新培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換液1次，5～7 d后可再次傳代，取第4代細胞（星形膠質(zhì)細胞純度較高）進行實驗。

1.2.3 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞鑒定 GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志蛋白，故通過免疫細胞化學染色鑒定GFAP 表達［6］。取培養(yǎng)所得的第4 代細胞進行GFAP 免疫化學染色，顯微鏡下觀察統(tǒng)計視野內(nèi)GFAP 陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例，陽性細胞占比大于95%即證實大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)成功。

1.3 細胞分組及干預(yù) 取第4代細胞接種于96孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時將細胞分為對照組和模型組。對照組加入含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至實驗結(jié)束；模型組采用氧糖剝奪/再恢復法處理模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，即在培養(yǎng)基內(nèi)加入含5．0×10-4mol/L 的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）的無糖Earle’s 液，1 h 后改為DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷［7］。構(gòu)建miR-15b 干擾腺病毒過表達載體（Ad miR-15b）、沉默載體（Ad as miR-15b）、過表達對照載體（Ad miR-15b-NC）和沉默對照載體（Ad as miR-15b-NC），送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司鑒定，將構(gòu)建成功的載體分別轉(zhuǎn)染上述模型組細胞，記為過表達組、沉默組、過表達對照組、沉默對照組，另設(shè)置空白組，每組各設(shè)置5個復孔。

1.4 各組細胞形態(tài)學變化和轉(zhuǎn)染效率觀察 各組細胞分組并培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化。另在熒光顯微鏡下觀察拍照，計算各組細胞轉(zhuǎn)染效率＝熒光顯微鏡下發(fā)光細胞數(shù)/普通顯微鏡下細胞數(shù)×100%。

1.5 各組細胞存活率、細胞活力及凋亡率檢測 （1）MTS 檢測細胞存活率。在培養(yǎng)于96孔板的各組細胞內(nèi)每孔避光加入20 μL MTS溶液，設(shè)置空白對照組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。并用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的光密度（OD）值，重復3 次取平均值，細胞存活率（%）=OD實驗組／OD空白對照組×100%。（2）LDH 漏出率實驗檢測細胞活力。取培養(yǎng)于96 孔板的各組細胞，按照LDH 檢測試劑盒說明書操作步驟，用自動生化分析儀分別檢測各組細胞上清液和細胞內(nèi)LDH活力。細胞活力（%）=上清液LDH活力/（上清液LDH活力＋細胞內(nèi)LDH活力）×100%。（3）流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。取各組細胞培養(yǎng)96 h 后，按1．0×105個/μL 置于流式管中，PBS沖洗2次，加入500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測，用FlowJo v10．8．1軟件分析細胞凋亡率。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測各組細胞miR-15b 以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達 取各組細胞，培養(yǎng)48 h后qPCR檢測各目的基因mRNA的表達。用PureLink 純化試劑盒提取總RNA，合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成，miR-15b 引物：上 游 5'-TAGCTAGTCATGCTAAGC-3'，下 游 5'-CATGTATAGCTAATGCAC-3'，產(chǎn)物大小318 bp；Bcl-2 引物：上 游 5'-ATCTATAATGCGTACCCATG-3'，下 游 5'-TTAGCTGACCAGTTACATTA-3'，產(chǎn)物大小326 bp；Caspase-3 引物：上游5'-TGTTCATGCTAATGCACCTTGA-3'，下游5'-GCAACTAGCATTACGGACAACT-3'，產(chǎn)物大小330 bp；Caspase-9引物：上游5'-ATAACTGAATCGAACACT-3'，下游5'-GCAACTACTGATACGTAC-3'，產(chǎn)物大小314 bp。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ10 μL，上下游引物各0．8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0．4 μL，cDNA 模板2．0 μL，DEPC 水6．0 μL。反應(yīng)過程：94 ℃3 min；94 ℃15 s，52 ℃1 min，72 ℃1 min，40 個循環(huán)。miR-15b 以U6 為內(nèi)參，其余基因以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

1.7 Western blot 檢測各組細胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達 取各組細胞，培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)液，冰浴條件下用200 W功率超聲波破碎細胞5次，每次5 s，提取總蛋白。加入3 μL的上樣緩沖液混合均勻，100 ℃熱修復5 min。90 V電壓電泳15 min 濃縮膠，120 V 恒壓電泳1 h 分離膠。取凝膠，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。1．5 h 后洗膜3 次，每次10 min；用5%脫脂牛奶封閉1 h再次以同法洗膜；加入一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日加入二抗（1∶2 000）；加入400 μL化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL），室溫避光孵育1 min，保鮮膜包好置于壓片夾中，暗室顯影、定影，標定Marker，掃描分析，計算各目標蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.8 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-15b 是否靶向調(diào)控Bcl-2 采用TargetScan 靶基因在線軟件（http://www．targetscan．org/vert_72/）預(yù)測miR-15b的靶基因。將野生型和突變型Bcl-2 熒光素酶報告載體與Ad miR-15b、Ad miR-15b-NC共轉(zhuǎn)染293 T細胞，以空載體作為空白對照組。棄去培養(yǎng)液，用100 μL 的PBS 沖洗各孔，每孔加入50 μL 細胞裂解液，于搖床上室溫搖15 min裂解細胞，取10 μL上清液加入酶標板中，加入100 μL的LARⅡ檢測試劑，靜置2 s后用酶標儀檢測數(shù)據(jù)。隨后每孔加入100 μL 的淬滅劑，靜置2 s 后再次檢測數(shù)據(jù)。計算出前后2組數(shù)據(jù)的比值。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的鑒定 GFAP陽性細胞胞體肥大，突起分支少，胞核呈空泡狀，不顯色，其中陽性細胞占比（98．12±2．05）%，大于95%，證實大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)成功，見圖1。

Fig．1 Identification of astrocytes in rat cerebral cortex(immunochemical staining，×200)圖1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞鑒定（免疫化學染色，×200）

2.2 各組細胞形態(tài)學變化和轉(zhuǎn)染效率觀察 （1）形態(tài)學變化。對照組細胞貼壁生長，細胞體積較大，突起粗壯，具有折光性，胞間聯(lián)系緊密；空白組、過表達對照組和沉默對照組細胞明顯可見貼壁細胞減少，細胞縮小變圓，細胞間隙變大，分布松散，折光性差；過表達組細胞數(shù)量進一步減少，分布更加稀疏，可見有明顯細胞漂浮于培養(yǎng)液中；沉默組細胞數(shù)量較空白組和沉默對照組增加，但仍低于對照組，細胞有輕微縮小。（2）轉(zhuǎn)染效率。除對照組和空白組外，各組細胞轉(zhuǎn)染效率均在85%以上，其中對照組和空白組轉(zhuǎn)染效率為0；過表達對照組轉(zhuǎn)染效率為（89．26±5．13）%；沉默對照組轉(zhuǎn)染效率為（90．21±6．70）%；過表達組轉(zhuǎn)染效率為（92．04±6．55）%；沉默組轉(zhuǎn)染效率為（88．18±5．82）%，見圖2。

2.3 各組細胞存活率、細胞活力及凋亡率比較 與對照組比較，空白組、過表達對照組和沉默對照組細胞存活率降低，細胞活力和細胞凋亡率升高（P＜0．05）；與空白組和過表達對照組比較，過表達組細胞存活率降低，細胞活力和細胞凋亡率升高（P＜0．05）；與空白組和沉默對照組比較，沉默組細胞存活率升高，細胞活力和細胞凋亡率降低（P＜0．05），見圖3，表1。

Fig．2 Cell morphology and transfection efficiency of each group(×100)圖2 各組細胞形態(tài)學及轉(zhuǎn)染效率（×100）

Fig．3 Analysis of apoptosis rate in each group圖3 各組細胞凋亡率分析

Tab.1 Analysis of cell survival rate,cell viability and apoptosis rate in each group表1 各組細胞的存活率、細胞活力及凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Analysis of cell survival rate,cell viability and apoptosis rate in each group表1 各組細胞的存活率、細胞活力及凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與空白組比較，c與過表達對照組比較，d與沉默對照組比較，P＜0．05。

組別對照組空白組過表達對照組沉默對照組過表達組沉默組F存活率95．62±6．39 29．51±5．84a 28．94±5．73a 26．45±6．86a 9．12±1．02abc 55．23±8．04abd 76．586＊＊細胞活力1．85±0．33 52．27±9．02a 49．58±9．23a 51．14±9．55a 77．25±11．78abc 27．36±5．15abd 28．127＊＊凋亡率4．55±0．81 40．26±7．04a 42．55±7．30a 41．93±7．55a 64．54±10．06abc 21．18±2．03abd 28．700＊＊

2.4 各組細胞miR-15b 以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達比較 與對照組比較，空白組、過表達對照組和沉默對照組細胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達升高，Bcl-2 mRNA表達降低（P＜0．05）；與空白組和過表達對照組比較，過表達組細胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達升高，Bcl-2 mRNA 表達降低（P＜0．05）；與空白組和沉默對照組比較，沉默組細胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA表達升高（P＜0．05），見表2。

2.5 各組細胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達比較 與對照組比較，空白組、過表達對照組和沉默對照組細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0．05）；與空白組和過表達對照組相比較，過表達組細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低（P＜0．05）；與空白組和沉默對照組比較，沉默組細胞Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0．05），見圖4，表3。

2.6 熒光素酶基因報告實驗結(jié)果 TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 的3'-UTR 序列中含有miR-15b 的結(jié)合位點，表明Bcl-2 可能是miR-15b 的靶基因，見圖5。在轉(zhuǎn)染野生型Bcl-2細胞中，Ad miR-15b細胞的熒光素酶相對活性低于Ad miR-15b-NC 細胞（0．55±0．09vs.1．06±0．18，t=4．389，P＜0．05）；在轉(zhuǎn)染突變型Bcl-2 細胞中，Ad miR-15b 細胞的熒光素酶相對活性與Ad miR-15b-NC 細胞熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義（1．01±0．17vs.0．98±0．15，t=0．229，P＞0．05）。

Tab.2 Analysis of relative expression levels of miR-15b,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in cells of each group表2 各組細胞的miR-15b以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達量比較（n=3，±s）

Tab.2 Analysis of relative expression levels of miR-15b,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in cells of each group表2 各組細胞的miR-15b以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達量比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與空白組比較，c與過表達對照組比較，d與沉默對照組比較，P＜0．05。

組別對照組空白組過表達對照組沉默對照組過表達組沉默組F miR-15b 1．03±0．18 1．78±0．31a 1．85±0．34a 1．82±0．33a 2．98±0．52abc 1．11±0．19bd 16．952＊＊Bcl-2 1．01±0．20 0．52±0．09a 0．50±0．09a 0．47±0．08a 0．18±0．03abc 0．87±0．16abd 30．145＊＊Caspase-3 0．98±0．17 2．05±0．38a 2．01±0．35a 1．99±0．36a 3．26±0．57abc 1．24±0．21bd 21．377＊＊Caspase-9 1．00±0．19 1．62±0．28a 1．59±0．26a 1．65±0．30a 2．74±0．51abc 1．07±0．16bd 14．108＊＊

Fig．4 The expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 protein in cells of each group圖4 各組細胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達

Tab.3 Analysis of relative expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cells of each group表3 各組細胞的Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量分析（n=3，±s）

Tab.3 Analysis of relative expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cells of each group表3 各組細胞的Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量分析（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與空白組比較，c與過表達對照組比較，d與沉默對照組比較，P＜0．05。

組別對照組空白組過表達對照組沉默對照組過表達組沉默組F Bcl-2 1．71±0．27 0．79±0．12a 0．76±0．12a 0．80±0．13a 0．30±0．08abc 1．26±0．18abd 26．973＊＊Caspase-3 0．52±0．08 1．51±0．25a 1．55±0．28a 1．46±0．24a 2．31±0．37abc 0．78±0．14bd 20．052＊＊Caspase-9 0．48±0．07 1．15±0．21a 1．22±0．22a 1．06±0．18a 1．85±0．31abc 0．51±0．12bd 19．406＊＊

Fig．5 Binding site of miR-15b in Bcl-2圖5 miR-15b在Bcl-2的結(jié)合位點圖

3 討論

miR-15b位于SMC4基因的第5內(nèi)含子中，廣泛參與了細胞的增殖、分化、凋亡以及周期調(diào)控等重要細胞生物學過程［8］。有研究顯示，miR-15b 在肺癌、肝癌和胃癌細胞中均參與了調(diào)控細胞凋亡過程［9-10］。在新生大鼠的心肌細胞中，miR-15b被證實可以通過活化Caspase 信號通路和調(diào)控細胞凋亡線粒體途徑，從而誘導大鼠心肌細胞凋亡［11］。本研究中，各組細胞轉(zhuǎn)染效率均在85%以上，說明miR-15b成功轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞；與空白組和過表達對照組相比，過表達組細胞存活率降低，細胞活力和細胞凋亡率升高；與空白組和沉默對照組相比，沉默組細胞存活率升高，細胞活力和細胞凋亡率降低，表明miR-15b 過表達會降低細胞活力并誘導細胞凋亡，miR-15b 沉默則有增加細胞活力并減少細胞凋亡的作用。

腦缺血再灌注損傷誘導神經(jīng)細胞凋亡的途徑包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑和死亡受體途徑［12］。Caspase-3是這3種凋亡途徑共同的下游效應(yīng)分子，是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。有研究顯示，在正常人腦神經(jīng)細胞中Caspase-3蛋白幾乎無表達，在腦缺血狀態(tài)下Caspase-3 蛋白表達明顯升高，且Caspase-3 蛋白表達的變化趨勢與腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的變化趨勢保持一致［13］。Bcl-2 基因被廣泛認為是一種內(nèi)源性凋亡抑制基因，對維持腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞的生存有重要作用。Bcl-2蛋白是一種主要存在于線粒體外膜的穩(wěn)定蛋白，能夠保護線粒體內(nèi)外膜的穩(wěn)定性。線粒體是細胞凋亡線粒體途徑的控制中心，線粒體外膜被破壞后釋放的細胞色素C等凋亡誘導因子，能夠激活Caspase-9和Caspase-3并誘導細胞凋亡［14］。Caspase-9是細胞線粒體凋亡途徑中的重要起始因子，當線粒體發(fā)出促凋亡信號后，被活化的Caspase-9通過激活下游的Caspases，進一步放大級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞凋亡［15］。另有研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，可以通過誘導Bcl-2 基因的表達，抑制Caspase-3 活性，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，保護腦組織［16］。本研究中，與空白組和過表達對照組相比，過表達組細胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表達降低，miR-15b表達以及Caspase-3、Caspase-9 mRNA 和蛋白表達升高；與空白組和沉默對照組比，沉默組細胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表達升高，miR-15b 表達以及Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達降低，表明miR-15b過表達能降低Bcl-2的表達，增加Caspase-3、Caspase-9 的表達，miR-15b 沉默則升高Bcl-2 的表達，抑制Caspase-3、Caspase-9 的表達，推測miR-15b 是通過降低Bcl-2 的表達，增加Caspase-3、Caspase-9 的表達以實現(xiàn)降低細胞活力并誘導細胞凋亡的效果，進一步加重腦缺血再灌注損傷。

miRNA 作用于靶基因的3'-UTR 起作用，故把目的基因的3'-UTR 區(qū)域構(gòu)建于熒光素酶報告基因載體中，可通過比較過表達或者干擾miRNA 前后，檢測螢光素酶活性變化以反映miRNA 對目的基因的靶向作用［17］。有研究顯示，山奈酚可通過激活胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）途徑下調(diào)miR-15b的表達，下調(diào)的miR-15b靶向作用于Bcl-2并通過調(diào)節(jié)Bcl-2 的表達減少氧-葡萄糖剝奪引起的細胞凋亡，緩解缺血性心臟病病情［18］。本研究中，在轉(zhuǎn)染野生型Bcl-2 細胞中，Ad miR-15b 細胞的熒光素酶相對活性低于Ad miR-15b-NC 細胞，說明miR-15b 與Bcl-2 的3'-UTR 序列有結(jié)合位點，miR-15b轉(zhuǎn)染進入細胞后抑制了該靶點的熒光素酶活性，干擾Bcl-2 的3'-UTR 序列結(jié)合位點后，熒光強度基本恢復正常，證實了miR-15b可靶向調(diào)控Bcl-2。

綜上所述，miR-15b 沉默是通過線粒體凋亡途徑增加Bcl-2 的表達，降低Caspase-3、Caspase-9 的表達，從而抑制細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷。這為miR-15b運用于腦缺血再灌注損傷治療提供了理論依據(jù)。