李福貴 程林慧 何坤 張士林 劉錚錚 孫藝文 阮記明 吳華東

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)分別隸屬于鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)的泥鰍屬(Misgurnus)和副泥鰍屬(Paramisgurnus)，在我國及東南亞水域廣泛分布，是名特優(yōu)經(jīng)濟魚類品種[1-2]。然而，由于目前缺少國家審定的鰍科魚類新品種，再加上近親繁育、過度捕撈、養(yǎng)殖水域水體污染等因素，泥鰍的種質(zhì)資源正急劇衰退，因此，亟需加強泥鰍種質(zhì)資源保護和種質(zhì)創(chuàng)新利用。

遺傳多樣性是物種資源狀況評價的重要指標，也是物種適應(yīng)環(huán)境變化和進化的基礎(chǔ)。通過遺傳多樣性分析，可以評價物種資源現(xiàn)狀和種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用潛力[3-4]。線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因COⅠ具有母系遺傳、進化速率適中等特點，其序列常被用作物種鑒定的分子條形碼，也被廣泛應(yīng)用于魚類群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究[5-12]。筆者團隊前期開展了泥鰍、大鱗副泥鰍群體選育，獲得了具有較明顯生長優(yōu)勢的雜交子代，為新品種選育提供了優(yōu)良群體[2]。本研究基于線粒體COⅠ基因序列，分析了經(jīng)兩代群體選育的泥鰍、大鱗副泥鰍自繁及其雜交后代的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期對兩個選育群體開展科學(xué)評估，并為后續(xù)泥鰍新種質(zhì)資源創(chuàng)新利用提供基礎(chǔ)資料和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

本研究中親本培育、苗種繁育等試驗均在江西省吉安市新干縣贛源生態(tài)泥鰍養(yǎng)殖場(北緯27°47′12.96″，東經(jīng)115°27′35.67″)內(nèi)完成，遺傳多樣性分析試驗在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)鄱陽湖水生動物遺傳育種與生物技術(shù)實驗室完成。2018年5月，選擇經(jīng)兩代群體選育的二倍體(見圖1)泥鰍(M)與大鱗副泥鰍(P)作為親本，通過M(♀)×M(♂)與P(♀)×P(♂)群體自繁獲得M、P兩個自繁后代，通過M(♀)×P(♂)與P(♀)×M(♂)獲得正交(MP)和反交(PM)兩個雜交后代。

圖1 親本DNA含量測定

從4個后代群體中各隨機抽取30尾泥鰍(共120尾)，剪取魚鰭，置于無水乙醇中，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩⒖紭藴史?氯仿抽提法[13]提取并純化基因組DNA，共獲得120個DNA樣品。用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，用微量核酸濃度測定儀測定其濃度，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 PCR擴增及測序

參照張望等[14]報道的方法設(shè)計4個泥鰍群體COⅠ基因序列擴增引物，其中上游引物序列為：5’-CACGACGTTGTAAAACGACCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3’，下游引物序列為：5’-GGATAACAATTTCACACAGGACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)采用10 μL體系，其中含染料的TIANGEN 2×TaqPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.4 μL，DEPC水(無DNA/RNA酶)3.8 μL。PCR反應(yīng)在BIO-RAD T100TMThermal Cycler型PCR檢測儀上進行，反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，重復(fù)35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，從每個群體中各隨機挑取15個陽性擴增產(chǎn)物(共60個)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

線粒體COⅠ基因PCR產(chǎn)物測序完成后，用Clustal X軟件進行序列比對分析，用Codon W軟件分析密碼子的使用偏好性，用DNASP 5計算遺傳參數(shù)、MEGA 5.0計算群體遺傳距離，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)并基于Kimura雙參法構(gòu)建鄰接關(guān)系進化樹，利用Network 5010軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 COⅠ基因序列的堿基組成和密碼子偏好性

經(jīng)比對分析，得到4個泥鰍種群COⅠ基因片段同源序列，其全長為682 bp，共檢測到135個多態(tài)位點(占比19.79%)，其中有128個簡約信息位點，7個單堿基變異位點，變異均為轉(zhuǎn)換或顛換，且轉(zhuǎn)換多于顛換，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入與缺失(見圖2)。

圖2 4個泥鰍種群COⅠ基因片段的變異位點比較

4個泥鰍種群的COⅠ基因片段堿基組成相似，且種間差異小。4個泥鰍種群的COⅠ基因片段堿基A、T、C、G含量平均值分別為22.85%、31.9%、26.6%、18.7%，A+T的含量(54.0%～56.2%)均高于C+G的含量(43.8%～46.4%)，呈現(xiàn)出典型的堿基組成偏向性(見表1)。

表1 4個泥鰍種群線粒體COⅠ基因序列堿基組成的比較分析

4個泥鰍種群COⅠ基因編碼氨基酸時的密碼子使用偏好性分析結(jié)果顯示，M、P、MP、PM明顯偏好使用的密碼子分別有31、32、36、31個，其中Leu-CUU是M、MP、PM最主要的密碼子，TER-UGA和Arg-CGA是P的主要密碼子。M、P、MP、PM這4個泥鰍種群分別有7、12、6、6個密碼子使用率為0，表明這些密碼子在編碼氨基酸時沒有被使用(見表2)。

表2 4個泥鰍種群COⅠ基因密碼子的使用偏好性

表2 (續(xù))

除去使用率始終為1和非編碼氨基酸的終止密碼子，基于剩余密碼子對基因的密碼子使用偏好性進行聚類分析,結(jié)果見圖3。由圖3可見，MP與M首先聚為一支，再與PM、P聚類。這一結(jié)果表明MP的密碼子使用偏好性與母本M更為相似，也一定程度上表明泥鰍和大鱗副泥鰍雜交子代偏母系遺傳。

圖3 基于COⅠ基因密碼子偏好性的聚類圖

2.2 遺傳多樣性和單倍型組成

4種泥鰍COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)見表3。M、P、MP、PM 4種泥鰍的單倍型多態(tài)性(h)均為1.000±0.024，整體合計單倍型多樣性(h)為0.997±0.004；M、P、MP、PM 4種泥鰍的核苷酸多態(tài)性(π)分別為0.020 66±0.006 48、0.025 80±0.002 31、0.029 61±0.005 62和0.022 30±0.001 94，整體合計核苷酸多態(tài)性(π)為0.092 82±0.001 77。綜上，4種泥鰍均具有高單倍型多樣性和高核苷酸多態(tài)性，多態(tài)性由高到低依次為MP>P>PM>M。

表3 4種泥鰍COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)

4個泥鰍種群的單倍型分布情況見表4。60個泥鰍樣本共檢測到56個單倍型，包括3個種類共享單倍型和53個獨有單倍型。其中，P群體中15個個體共檢查到15個獨有單倍型(Hap1～Hap15)；M群體中13個個體為獨有單倍型(Hap16～Hap25，Hap27～Hap29)，2個個體共享1種單倍型(Hap26)；MP群體中13個個體為獨有單倍型(Hap30～Hap32，Hap34～Hap43)，2個個體共享1種單倍型(Hap33)；PM群體中12個個體為獨有單倍型(Hap44～Hap46，Hap48～Hap56)，3個個體共享1種單倍型(Hap47)(見表4)。利用Network 10.20.0軟件對4個泥鰍種群間的單倍型進化關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，MP的單倍型與M聚集在一個主支，PM的單倍型與P聚集在一個主支(見圖4)。

表4 4個泥鰍種群的單倍型分布

2.3 遺傳距離

M、P、MP、PM 4個泥鰍種群的種內(nèi)遺傳距離分別為0～0.020、0～0.024、0～0.027和0～0.023，種間遺傳距離在0.024～0.180，其中MP與M遺傳距離最近，為0.046；PM與P遺傳距離最近，為0.024(見表5)。

表5 基于COⅠ基因不同單倍型的Kumara 2-parameter遺傳距離

采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹(見圖5)，結(jié)果顯示，4個泥鰍種群同種不同個體間大部分以較高的置信值分別聚類，相聚之后再與外群聚類；有3個MP個體與M聚類，2個M個體與MP聚類，7個PM個體與P聚類，6個P個體與PM聚類，這與單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果相符合。

3 討論

3.1 4個泥鰍種群的COⅠ基因序列特征

本研究發(fā)現(xiàn)，在泥鰍、大鱗副泥鰍選育群體自繁和雜交后代群體的線粒體COⅠ基因序列中，A+T含量均高于C+G含量，呈現(xiàn)出明顯的AT堿基偏好，此結(jié)果與硬骨魚類COⅠ基因的研究結(jié)果[15-19]一致。

在4種泥鰍COⅠ基因的682 bp同源序列中共檢測到135個變異位點，占比為19.79%，變異位點中有128個簡約信息位點。施文瑞等[9]在大鱗副泥鰍4個群體104個樣本642 bp的COⅠ基因序列中，共檢測到44個多態(tài)性位點，僅占總位點數(shù)的6.85%，簡約信息位點只有35個，這可能與分析區(qū)域或物種間的差異有關(guān)[3,9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在4個泥鰍種群所檢測的變異位點中，轉(zhuǎn)換比例遠大于顛換，盡管轉(zhuǎn)換不易引起密碼子編碼的氨基酸變化，但仍呈現(xiàn)了豐富的變異特征。

3.2 4個泥鰍種群的遺傳多樣性

線粒體COⅠ基因因具有較高的遺傳多態(tài)性而被廣泛用于大鱗副泥鰍[9]、銀魚(Hemisalanxprognathus)[10]、帶魚(Trichiuruslepturus)[11]、哈氏仿對蝦(Parapenaeopsishardwickii)和細巧仿對蝦(Parapenaeopsistenella)[12]等水產(chǎn)動物遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)Grant等[20]提出的遺傳多樣性標準，單倍型多樣性與核苷酸多樣性的臨界值分別為0.5和0.005，數(shù)值越高表明遺傳多樣性越高。本研究中，M、P、MP、PM 4種泥鰍的單倍型多態(tài)性(h)均為1.000±0.024，核苷酸多態(tài)性(π)分別為0.020 66±0.006 48、0.025 80±0.002 31、0.029 61±0.005 62和0.022 30±0.001 94，均顯著高于臨界值，全部呈現(xiàn)出高單倍型和核苷酸遺傳多樣性，遺傳多樣性由高至低依次為MP>P>PM>M。物種內(nèi)遺傳多樣性或變異豐富度是物種對環(huán)境適應(yīng)性和進化潛力的象征[21]，因此可以預(yù)測，本研究中的4個泥鰍種群具有較強的環(huán)境適應(yīng)力和遺傳進化潛力。

3.3 4個泥鰍種群的遺傳進化

物種密碼子的使用具有保守性的特點，相近物種的密碼子使用模式相似[22]。本研究結(jié)果表明，MP與M的密碼子使用偏好性相似，P與PM的密碼子使用偏好性更相似，表明泥鰍和大鱗副泥鰍雜交子代COⅠ基因序列偏母系遺傳。單倍型多樣性進化分析和COⅠ基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果也共同驗證了這一結(jié)果。群體間親緣關(guān)系與其遺傳距離和遺傳相似系數(shù)有直接關(guān)系[23-24]。研究表明，不同種魚類的線粒體基因組DNA序列存在10%左右的遺傳變異[23]，且基于COⅠ基因序列的種內(nèi)遺傳距離大多在0.02以下，而種間遺傳距離在0.2以上[24]。本研究中，4個泥鰍種群的種內(nèi)最大遺傳距離為0.020～0.023，種間遺傳距離為0.024～0.180，表明存在一定的種內(nèi)差異，但種間差異較小。這是否與泥鰍、大鱗副泥鰍兩個物種間存在基因嵌套現(xiàn)象有關(guān)[25]，還有待進一步研究驗證。

3.4 泥鰍種質(zhì)創(chuàng)新建議

筆者團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，MP的形態(tài)特征與泥鰍(M)母本相似并具有明顯的超母本生長優(yōu)勢[2]、性腺發(fā)育障礙等特點。因此，團隊將針對上述兩個方面繼續(xù)開展泥鰍新品種的選育研究，具體工作為：(1)繼續(xù)分別開展泥鰍、大鱗副泥鰍的群體選育至F4～F5代，最終通過兩個物種間經(jīng)濟雜交獲得雜種優(yōu)勢更加突出的MP新品種；(2)以泥鰍、大鱗副泥鰍選育群體間正交獲得MP并輔以染色體組操作，以期獲得異源四倍體泥鰍新品系(種)；(3)若異源四倍體泥鰍有正常和穩(wěn)定的經(jīng)濟性狀且為可孕育群體，可與二倍體泥鰍或大鱗副泥鰍進行輪回雜交，獲得異源三倍體泥鰍新品系(種)。