李博文 雷權(quán)強 黃俊 張婷 鄒玉瑩 車凡昊 鄧吉奇 劉金靈,2,3 劉雄倫,2,3*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2 作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙 410128；3 水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，長沙 410128；4 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育學(xué)院，長沙410128；*通訊作者：xionglun@hunau.edu.cn）

水稻是世界上最主要的糧食作物之一。由Magnaporthe oryzae 引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，在全球廣泛發(fā)生，對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，其以葉瘟、穗頸瘟最為常見，嚴(yán)重時可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)50%～80%，甚至顆粒無收[1]。實踐表明，培育和推廣抗稻瘟病水稻新品種[2-3]是防治稻瘟病最有效的方法之一。來源于小粒野生稻（Oryza minuta）的Pi9 基因是第1 個被成功克隆的廣譜持久抗稻瘟病基因，對來源于不同國家的多數(shù)稻瘟菌生理小種（菌株）均具有抗性[4-7]。

分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted Selection，MAS）育種可定向改良目的性狀，且不受外界環(huán)境影響，大大提高育種選擇效率、縮短育種年限，是現(xiàn)代分子育種的重要手段[8]。75-1-127 是通過小粒野生稻與秈稻品系IR31917 遠緣雜交再連續(xù)回交獲得的高抗稻瘟病秈稻品系[9]。桃農(nóng)1A 是湖南省桃源縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的優(yōu)質(zhì)秈型三系不育系，具有不育性好、遺傳性狀穩(wěn)定、高柱頭外露率、易制種、高配合力、米質(zhì)優(yōu)、抗倒能力強等優(yōu)點，至今還一直在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用[10]。然而，桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性較差，葉瘟與穗瘟均達到5 級[11]，使其推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重限制，因此，改良桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性將大大提高其應(yīng)用價值。本研究利用75-1-127 作為Pi9 基因的供體親本，先后以保持系桃農(nóng)1B 及其不育系桃農(nóng)1A 為受體親本，利用基于Pi9基因內(nèi)序列開發(fā)的共顯性InDel 標(biāo)記，通過MAS 連續(xù)回交育種定向改良桃農(nóng)1B 與桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料：高抗稻瘟病秈稻品系75-1-127（Pi9 基因供體親本、抗病對照）；三系不育系桃農(nóng)1A 及其保持系桃農(nóng)1B（Pi9 基因受體親本）；感病對照品系CO39。

稻瘟菌菌株：15 份來自國內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株，用于室內(nèi)接種抗菌譜分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)記基因型分析

DNA 模板提?。河? mL 滅菌離心管取候選水稻單株小分蘗葉片約0.2 g，加液氮研磨后用CTAB 法提取總DNA[12]。

PCR 體系（10 μL）：模板DNA 1.0 μL，5 U/μLTaq 酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O6.7 μL。PCR 熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃5 min；94 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃30 s；30 cycles；72 ℃10 min。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物，分析單株標(biāo)記基因型。

1.2.2 分子標(biāo)記輔助選擇育種實踐

自2015年夏季開始，用桃農(nóng)1B 作母本及輪回親本，75-1-127 作父本，連續(xù)多年在湖南長沙與海南三亞兩地開展分子標(biāo)記輔助選擇回交育種實踐，用CoInDF1R2標(biāo)記在各回交群體中進行Pi9 基因前景選擇，用田間主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀作為單株基因組背景選擇，于2018年冬季在海南獲得穩(wěn)定、整齊、高抗稻瘟病的桃農(nóng)1B-Pi9 的BC5F3代群體（株系）。同時，以桃農(nóng)1A 為母本，從改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9 群體中選擇高抗稻瘟病且農(nóng)藝產(chǎn)量性狀優(yōu)良的株系作父本及輪回親本，利用MAS 技術(shù)，于2020年冬季在海南獲得改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9 的BC3F1代群體（株系）。2021年5—6月份在湖南瀏陽大圍山病圃經(jīng)苗瘟抗性鑒定后，對改良抗病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 進行田間綜合調(diào)查分析，最后遴選高抗稻瘟病且不育特性好、農(nóng)藝產(chǎn)量性狀表現(xiàn)優(yōu)良的新不育系。

1.2.3 稻瘟病抗性鑒定與抗菌譜分析

田間病圃苗瘟抗性鑒定：試驗于2019—2021年的5月中旬至6月中旬在湖南瀏陽大圍山稻瘟病天然病圃進行，具體參考廖花等人的方法[13]。

稻瘟菌室內(nèi)人工接種：分別用15 份稻瘟菌菌株接種水稻第3 片完整葉片，接種孢子懸浮液濃度為1.5×105個/mL 左右。接種后調(diào)查苗瘟抗性表型、分析抗菌譜。接種方法為打孔接種法或噴霧接種法，其中打孔接種后于10～15 d 調(diào)查發(fā)病情況，噴霧接種后于7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。

稻瘟病分級標(biāo)準(zhǔn)參照Bonman 的0～5 級標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.2.4 不育特性調(diào)查

調(diào)查桃農(nóng)1A 與其改良系的不育特性，包括柱頭外露率、包頸粒率、自交結(jié)實率、不育度、不育株率、花粉育性及其敗育類型、不育花粉率，具體操作參考文獻[15-17]。

柱頭外露率與包頸粒率：待不育系抽穗揚花結(jié)束后，隨機選取30 穗，調(diào)查總穎花數(shù)和柱頭外露穎花數(shù)（包括柱頭單邊外露穎花數(shù)和柱頭雙邊外露穎花數(shù)），計算柱頭外露率；同時調(diào)查終花后的每穗抽出穎花數(shù)和包頸穎花數(shù)，計算包頸粒率。

自交結(jié)實率、不育度與不育株率：不育系于孕穗末期隨機取10 株，用羊皮紙袋套袋，于20 d 后調(diào)查自交結(jié)實率、不育株率及不育度。

花粉育性及敗育類型：不育系開花盛期，隨機取10 個剛開始開花的稻穗進行鏡檢，在每個稻穗的上、中、下三個部位分別取即將開花的3 朵穎花，將其花藥用干凈的鑷子夾出至蓋玻片上并搗碎，用1% I2-KI 溶液染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉育性及敗育類型。

不育花粉率：鏡檢時取10 個干凈清晰的視野，統(tǒng)計每個視野下的不育花粉率。

1.2.5 農(nóng)藝產(chǎn)量性狀調(diào)查

調(diào)查桃農(nóng)1B、桃農(nóng)1A 及其改良群體的播始歷期、株高、劍葉長和劍葉寬、穗長、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、單穗穎花數(shù)、著粒密度、千粒重、結(jié)實率等主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀，方法見參考文獻[18-19]。

每個水稻材料為1 個小區(qū)，每個小區(qū)7 行，每行7株，株距20 cm，行距25 cm，正常肥水管理，在分蘗期曬田以抑制無效分蘗生長。水稻分蘗末期，調(diào)查每個小區(qū)第3、4 行共14 株植株的分蘗數(shù)；在水稻始穗期調(diào)查每個材料的播始歷期；待水稻成熟后，同樣以每個小區(qū)第3、4 行共14 株作為樣本，調(diào)查每株株高、劍葉長和劍葉寬、穗長、有效穗數(shù)、單穗穎花數(shù)、實粒數(shù)，計算每穗著粒密度與結(jié)實率；水稻種子收割后經(jīng)曬干水分、室內(nèi)脫粒后測量千粒重，3 次重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010、Statistix 8.0 與GraphPad Prism 8.3.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析；采用最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi9 基因多態(tài)分子標(biāo)記篩選

用本實驗室開發(fā)的Pi9 基因內(nèi)分子標(biāo)記對供體親本75-1-127 與受體親本桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 做基因型分析，篩選多態(tài)標(biāo)記用于MAS 育種實踐。獲得供體/受體親本間多態(tài)性穩(wěn)定的共顯性InDel 標(biāo)記CoInDF1R2（Pi9 基因內(nèi)元序列；正向引物：5'-ATCCACGAAACATCCACCATCC -3',反向引物 ：5' -TGAGCTAGCTCTTGCCTCCGAG-3'），該標(biāo)記在75-1-127 基因組中擴增出1 條大小為354 bp 的穩(wěn)定條帶，而在桃農(nóng)1B 或桃農(nóng)1A 基因組中的PCR 產(chǎn)物大小約為470 bp，2 條擴增產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳簡便區(qū)分（圖1）。

2.2 CoInDF1R2 輔助選擇育成高抗稻瘟病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 及其保持系桃農(nóng)1B-Pi9

利用共顯性標(biāo)記CoInDF1R2連續(xù)多年開展MAS 育種實踐，2015年夏季至2018年冬季獲得26 個改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9，從中遴選出3 個高抗稻瘟病、農(nóng)藝產(chǎn)量性狀較好的改良系作為父本與輪回親本，繼續(xù)與桃農(nóng)1A 雜交并連續(xù)回交，于2020年冬季在海南三亞獲得3 個對應(yīng)改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9。標(biāo)記基因型鑒定結(jié)果（圖1）表明，改良不育系及其配套保持系的Pi9 基因位點均已純合。

圖1 桃農(nóng)1A-Pi9、桃農(nóng)1B-Pi9 標(biāo)記基因型鑒定和人工接種表型1B-Pi9

2.3 親本及改良株系病圃苗瘟抗性表型及抗菌譜

田間病圃苗瘟抗性鑒定結(jié)果表明，供體親本75-1-127 苗瘟為0 級，表現(xiàn)為高度抗?。皇荏w親本桃農(nóng)1B與桃農(nóng)1A 苗瘟均達到4 級，表現(xiàn)為高度感??；3 份改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9（BC3F1群體）及其配套改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9（BC5F6群體）苗瘟抗性表型均為0 級，表現(xiàn)為高度抗病，且均未出現(xiàn)感病分離株；感病對照材料CO39 苗瘟為5 級，表現(xiàn)為高度感病。室內(nèi)人工接種抗菌譜結(jié)果（表1）顯示，75-1-127 對15 份稻瘟菌菌株中的13 份表現(xiàn)抗病，但對X2007A-7 和ROR1 表現(xiàn)感病，抗性頻率為86.67%；CO39 對15 份菌株均表現(xiàn)感病，抗性頻率為0；桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 均對X2007A-1表現(xiàn)抗病，而對其余14 份菌株表現(xiàn)感病，抗性頻率為6.67%；改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其保持系桃農(nóng)1B-Pi9-1 的抗病表型與供體親本75-1-127 一致，均對X2007A-7 和ROR1 表現(xiàn)感病，而對其余13 份菌株表現(xiàn)抗病，抗性頻率均為86.67%。上述結(jié)果表明，Pi9基因抗性水平高、抗譜廣，已被成功應(yīng)用于改良桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性。

表1 親本及改良材料對15 份供試稻瘟菌菌株的抗菌譜

2.4 桃農(nóng)1A-Pi9 不育特性

受體親本桃農(nóng)1A 與3 個改良抗病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 的柱頭肥大且均為黑色。調(diào)查結(jié)果（圖2）表明，3 個改良不育系的柱頭總外露率均有提高，其中桃農(nóng)1A-Pi9-1 柱頭外露率最高（74.82%）且顯著高于桃農(nóng)1A（62.79%），異交習(xí)性獲得改良。自然狀態(tài)下桃農(nóng)1A包頸嚴(yán)重，桃農(nóng)1A-Pi9-1 和桃農(nóng)1A-Pi9-3 的包頸粒率（分別為29.92%、24.48%）均低于桃農(nóng)1A（33.97%），而桃農(nóng)1A-Pi9-2 包頸粒率（48.21%）顯著高于桃農(nóng)1A。經(jīng)田間調(diào)查統(tǒng)計，桃農(nóng)1A 與3 個改良不育系的自交結(jié)實率均為0，不育株率與不育度均為100%，不育性徹底且穩(wěn)定?；ǚ坨R檢結(jié)果顯示，桃農(nóng)1A 與3 個改良不育系的花粉敗育率均為100%，圓敗花粉和典敗花粉率各約50%?？梢姡牧疾挥堤肄r(nóng)1A-Pi9-1 和桃農(nóng)1A-Pi9-3 不育性徹底且穩(wěn)定，柱頭外露率高，包頸粒率低，不育特性進一步提升。

圖2 不育系主要不育特性

2.5 桃農(nóng)1B-Pi9 與桃農(nóng)1A-Pi9 主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀

3 個改良保持系的播始歷期為72～73 d，比桃農(nóng)1B長1～2 d；3 個改良不育系的播始歷期為74～75 d，比桃農(nóng)1A 長1～2 d。與2 個受體親本一樣，3 個改良不育系及其保持系株型緊湊，葉片上舉，抗倒伏性好。調(diào)查結(jié)果（表2、表3）表明，桃農(nóng)1B-Pi9-1 株高最低，但仍顯著高于桃農(nóng)1B；桃農(nóng)1A-Pi9-1 在3 個改良不育系中最矮，略高于桃農(nóng)1A。3 個改良不育系分蘗力、單穗穎花數(shù)相對于桃農(nóng)1A 均有所提高；3 個改良保持系單穗穎花數(shù)、著粒密度、千粒重和結(jié)實率相對于桃農(nóng)1B 也均有提高?？梢?，3 個改良不育系及其保持系的不同性狀表現(xiàn)各有優(yōu)劣，但桃農(nóng)1A-Pi9-1 的株高明顯低于其他2 個改良不育系，且其柱頭外露率在3 個改良系中最高，包頸粒率也比較低。綜合農(nóng)藝產(chǎn)量性狀與不育特性，桃農(nóng)1A-Pi9-1 是今后生產(chǎn)上應(yīng)用的首選。

表2 不育系與保持系主要農(nóng)藝性狀

表3 不育系與保持系主要產(chǎn)量結(jié)構(gòu)

3 討論

水稻稻瘟病抗性是典型的質(zhì)量-數(shù)量性狀，不僅受到單個或主效R 基因的控制，還與多種環(huán)境因素尤其是與病原菌的互作有著密切聯(lián)系[20-22]。稻瘟病抗性育種中，僅通過田間表型選擇的常規(guī)育種方法效率低，且不利于開展多基因聚合育種，選育出來的新品種很難實現(xiàn)廣譜持久抗性[23]。MAS 育種是對標(biāo)記基因型的直接鑒定和選擇，不受外界環(huán)境因素影響，大大提高了選擇準(zhǔn)確性與效率，是現(xiàn)代分子育種的主要方式[24]。MAS 育種改良稻瘟病抗性已有較多報道，如R153 的選育[25]、龍黑198 的選育[26]、M630 的改良[27]等。本實驗室10 多年來通過MAS 技術(shù)改良了一批水稻品系的稻瘟病抗性，包括常規(guī)稻如湘晚秈13 號[28]、恢復(fù)系如R747[13]、三系不育系如豐源A[29]。

本研究利用基于Pi9 基因內(nèi)元序列開發(fā)的共顯性InDel 標(biāo)記CoInDF1R2，連續(xù)多年開展MAS 回交育種實踐，最后育成了高抗稻瘟病且綜合性狀優(yōu)良的三系不育系桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其配套保持系桃農(nóng)1B-Pi9-1，為三系雜交水稻育種創(chuàng)制了新的親本材料。在此基礎(chǔ)上，我們將繼續(xù)開展以下工作：使用更多不同稻區(qū)的稻瘟菌小種（菌株）接種，進一步明確受體親本與改良系的抗菌譜；將改良系引入不同生態(tài)稻區(qū)做苗瘟和穗瘟抗性鑒定，明確桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其雜交種的適宜種植區(qū)；用桃農(nóng)1A-Pi9-1 廣泛配組，選配廣譜高抗稻瘟病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適的強優(yōu)勢雜交組合F1代應(yīng)用于生產(chǎn)，同時分析桃農(nóng)1A-Pi9-1 的恢復(fù)源相對于桃農(nóng)1A 是否發(fā)生改變。

本研究中我們注意到，桃農(nóng)1A 剛育成時花粉敗育類型主要為典敗型，典敗率達99.86%[11]，與實驗室往年鏡檢結(jié)果相符。然而，2021年桃農(nóng)1A 圓敗花粉比例大大增加，達50%左右，出現(xiàn)這種現(xiàn)象很可能是由于2021年開花期持續(xù)高溫所致，前人有過相關(guān)報道[30]。