崔 琪 ，俸明康 ，豐日落，王 濤，張紹山，李 瑩，陳 晨*，劉 圓*

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610225

3.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225

4.青藏高原民族藥用資源保護(hù)與利用國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225

敗醬科甘松屬植物甘松Nardostachys jatamansiDC.主要分布于四川省、甘肅省、青海省、云南省、西藏等地海拔2800～4500 m 的高山草甸區(qū)，歷版《中國(guó)藥典》均有收載，其藥用部位為干燥根及根莖，具有理氣止痛、開郁醒脾，外用祛濕消腫的功效；用于脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐；外用治牙痛、腳氣腫毒[1]，是古印度阿育吠陀（Ayurveda）和尤納尼醫(yī)（Unani）學(xué)體系的常用藥材，在我國(guó)為藏、蒙、維、傈僳、納西等傳統(tǒng)民族醫(yī)學(xué)臨床常用品種[2]，也是藏香的主要原料之一[3]。另外，甘松在精油、日化品等領(lǐng)域也有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

MADS-box 蛋白家族是一類N 端存在1 個(gè)氨基酸數(shù)目為58～60 的保守結(jié)構(gòu)域-MADS-box 結(jié)構(gòu)域[4]的重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，其名稱源自釀酒酵母的 MCMI、擬南芥的AGAMOUS、金魚草的 DEFICIENS 和人類的SRF4 4 種類[5]。常被分為Type I 型和Type II 型，Type I 型包括Mα、Mβ、Mγ、Mδ 亞族，目前僅少數(shù)TypeI 型蛋白的生物學(xué)功能已被探明，且與植物胚和胚乳的發(fā)育有關(guān)[6]，TypeII 型包括MIKCc和 MIKC*亞族[7]，MIKC*通常參與調(diào)控雄配子的生長(zhǎng)發(fā)育，MIKCc對(duì)花器官生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[8]，在花育的ABCDE 模型中，TypeII型蛋白中所涉及的花四聚體能調(diào)節(jié)不同花序中的特定表達(dá)過(guò)程[9]。MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子大多參與花器官的發(fā)育、開花時(shí)間和果實(shí)成熟等過(guò)程的調(diào)控[7]，少數(shù)參與調(diào)控植物側(cè)根的形成[10]。

甘松的藥用部位為營(yíng)養(yǎng)器官-根莖，開花時(shí)間及側(cè)根的發(fā)育影響其產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，甘松花及側(cè)根發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制的研究，可為其優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)及優(yōu)良種質(zhì)資源的培育提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段。MADS-box 家族基因?qū)﹂_花時(shí)間調(diào)控、花器官發(fā)育及側(cè)根發(fā)育至關(guān)重要，但甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子未見報(bào)道，因此，基于課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定和分析甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)功能，為進(jìn)一步探究甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子在花器官形成機(jī)制及側(cè)根發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與處理

甘松植株經(jīng)西南民族大學(xué)青藏高原研究院劉圓教授鑒定為甘松Nardostachys jatamansiDC.，現(xiàn)蕾后套袋收集同一株的種子。

將采集的甘松種子播種于花盆中，共6 盆，在培養(yǎng)箱中（溫度20 ℃；相對(duì)濕度50%；8 h/16 h 光照/黑暗）培育至長(zhǎng)出兩片真葉。3 盆噴灑50 mg/mL 吲哚乙酸溶液，另外3 盆噴灑同樣數(shù)量的清水作空白對(duì)照，24 h 后取處理后的甘松葉片，每份樣品采集3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80 ℃保存，送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 甘松MADS-box 家族的來(lái)源、篩選及序列分析

甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族序列來(lái)源于課題組上傳于NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，檢索號(hào)分別為SRR21656214、SRR21656215、SRR21656216、SRR21656217、SRR21656218、SRR21656219、SRR21656220、SRR21656221、SRR21656222、SRR21656223、SRR21656224、SRR21656225、SRR21656226、SRR21656227、SRR21656228、SRR21656229、SRR21656230、SRR21656231。利用數(shù)據(jù)中NR 和Swiss 注釋搜索甘松中潛在的MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，篩選的E值為1×10-5。利用數(shù)據(jù)在NCBI 查找其開放閱讀框（open reading frame，ORF），再利用CDD、pfam對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，篩選并剔除不完整的甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，最終獲得20 條MADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列，將其命名為 NcMADS01～NcMADS20。

1.3 甘松MADS-box 家族蛋白理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守基序（motif）分析

對(duì)篩選出的MADS-box 家族蛋白序列，利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析甘松MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)甘松MADS-box 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用 MEME（https://memesuite.org/meme/tools/meme）分析甘松MADS-box 蛋白保守基序及其分布，利用SWISS MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)甘松MADS-box 蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.4 甘松MADS-box 家族蛋白亞細(xì)胞定位、導(dǎo)肽、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用Cello（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。利用TargetP-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0）預(yù)測(cè)導(dǎo)肽，利用SignalP-4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò) TM-HMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成。

1.5 甘松MADS-box 家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用MEGA6 軟件以鄰位連接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建甘松MADS-box 蛋白序列與TAIR擬南芥官網(wǎng)（https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/mads_tffamily.jsp）中下載的擬南芥MADS-box 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用iTOL 軟件進(jìn)行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘松MADS-box 家族蛋白的篩選

甘松相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)源于課題組前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。本研究在Swiss-Prot、NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到了 39 個(gè) MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子，再通過(guò)ORFfinder 對(duì)其開放閱讀框進(jìn)行分析，進(jìn)一步通過(guò)CDD 和Pfam 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，刪除沒(méi)有完整保守結(jié)構(gòu)域以及重復(fù)的序列，最終得到 20 個(gè)MADS-box 蛋白，按照轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)編號(hào)從小到大的順序進(jìn)行編號(hào)，分別編號(hào)為 NcMADS01～NcMADS20。

2.2 甘松MADS-box 蛋白序列理化性質(zhì)分析

利用 Protparam 在線工具，對(duì) 20 條甘松MADS-box 蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，20 條NcMADS 蛋白序列長(zhǎng)度在90～365 aa，相對(duì)分子質(zhì)量在10 179.96～41 707.68。理論等電點(diǎn)（PI）在4.87～10.43，其中9 個(gè)蛋白等電點(diǎn)＜7 顯酸性，11 個(gè)蛋白等電點(diǎn)＞7 顯堿性。20 個(gè)NcMADS 蛋白中，3 個(gè)蛋白序列的不穩(wěn)定指數(shù)＜40，為穩(wěn)定蛋白，17 個(gè)蛋白序列的不穩(wěn)定指數(shù)＞40，為不穩(wěn)定蛋白。甘松MADS-box 蛋白脂肪系數(shù)在73.12～108.44，其中有2 個(gè)脂肪系數(shù)大于100。20 個(gè)甘松MADS-box蛋白的平均疏水指數(shù)-0.84～-0.15，均為負(fù)值，其中16 個(gè)小于-0.5，占比80%，可推出大部分甘松MADS-box 蛋白質(zhì)是親水蛋白質(zhì)，兩性蛋白質(zhì)為4個(gè)，占比20%（表1）。

表1 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族信息Table 1 Information of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.3 甘松MADS-box 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。甘松MADS-box 蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲作為二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的70%左右，這對(duì)蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)構(gòu)象具有一定的作用，無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角占比相對(duì)較?。ū?）。

表2 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structure of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

利用在線軟件SWISS-MODEL 對(duì)甘松的20 個(gè)MADS-box 家族基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖1），可從構(gòu)建的模型中清楚地觀察到各家族蛋白的空間結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈）。結(jié)果顯示甘松9 個(gè)亞族之間以及同一亞族不同蛋白之間的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈的比例均不相同，從而導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)存也存在一定差異，結(jié)構(gòu)的差異使得各自呈現(xiàn)不同的功能。

圖1 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Tertiary structures prediction of MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.4 甘松MADS-box 蛋白基序分析

利用MEME 在線軟件分析了甘松MADS-box家族蛋白的保守基序，得到MADS-box 蛋白的10個(gè)保守基序，命名為motif1～motif10，長(zhǎng)度為12～50 aa。

其中motif1 為MADS 結(jié)構(gòu)域，motif2 和motif5為K-box結(jié)構(gòu)域。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，20個(gè)NcMADS-box蛋白序列含有2～7 個(gè)保守基序（圖2）。

圖2 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族motif 分布Fig.2 Motif analysis of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.5 甘松MADS-box 蛋白亞細(xì)胞定位

利用 Cello v.2.5 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) 20 個(gè)甘松MADS-box 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明甘松大部分MADS-box 蛋白定位在細(xì)胞核，說(shuō)明它們作為轉(zhuǎn)錄因子大部分能調(diào)控下游基因的表達(dá)[11]，而少數(shù)MADS-box 蛋白在細(xì)胞質(zhì)、線粒體中也有定位，其中 2 個(gè)定位到細(xì)胞質(zhì)，2 個(gè)定位到線粒體。NcMADS19 定位到細(xì)胞質(zhì)中，NcMADS16 定位到線粒體中；其余轉(zhuǎn)錄因子均定位到細(xì)胞核內(nèi)，說(shuō)明大部分MADS-box 蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用（表3）。

表3 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族亞細(xì)胞定位Table 3 Subcellular location prediction of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.6 導(dǎo)肽、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

導(dǎo)肽是將新合成的肽鏈引入不同細(xì)胞器的一段識(shí)別序列[12]。信號(hào)肽是導(dǎo)肽的一種，其位于蛋白質(zhì)的N 端，具有指導(dǎo)分泌型蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的作用。導(dǎo)肽和信號(hào)肽在蛋白定位過(guò)程中起重要作用。預(yù)測(cè)分析導(dǎo)肽和信號(hào)肽，利于進(jìn)一步研究蛋白的功能和作用途徑。利用TargetP2.0 分析22 個(gè)甘松MADS-box 蛋白是否具有信號(hào)肽和導(dǎo)肽結(jié)果表明：20 個(gè)NcMADS 蛋白均不含信號(hào)肽和導(dǎo)肽，為非分泌蛋白。同時(shí)利用TM-HMM Server.2.0 在線軟件對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)20 個(gè)NcMADS 蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)特征，這與親水性的分析結(jié)果是一致的。同時(shí)表明甘松22 個(gè)MADS-box 蛋白無(wú)法跨膜運(yùn)輸或者作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)核孔運(yùn)輸（表4）。

表4 甘松MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)肽預(yù)測(cè)Table 4 Leader peptide prediction of MADS-box transcription factors in N.jatamansi

2.7 甘松MADS-box 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA6 軟件，對(duì)篩選獲取的20 個(gè)甘松MADS-box 的蛋白序列和TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得到的97 個(gè)擬南芥MADS-box 蛋白序列進(jìn)行同源對(duì)比，采用鄰接法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在通過(guò)iTOL 進(jìn)行美化處理。結(jié)果顯示（圖3），20 個(gè)甘松MADS 蛋白聚類可分為9 個(gè)亞族。其中4 個(gè)Type I 型NcMADS蛋白聚類到擬南芥Type I 型（Mα 與Mδ）中Mα 中僅包含NcMADS19，Mδ 中包含NcMADS02、NcMADS03、NcMADS08；其余16 個(gè)NcMADS 蛋白分別聚到擬南芥MICK 型蛋白的不同亞族。其中AP3、STK/SHP、FUL、SOC1 亞族各包含1 個(gè)成員，分別為NcMADS04、NcMADS05、NcMADS14、NcMADS16；SEP 亞族包含2 個(gè)成員，分別是NcMADS09、NcMADS20；SVP 亞族中包含4 個(gè)成員，分別是NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18；還有6 個(gè)成員歸屬到ANR1 亞族，分別是 NcMADS01、NcMADS10、NcMADS11、NcMADS12、NcMADS15 和NcMADS17。

圖3 甘松與擬南芥MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of MADS-box family transcription factors in N.jatamansi and Arabidopsis thaliana

3 討論

3.1 甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子是參與多項(xiàng)生理活動(dòng)的重要調(diào)控因子

MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和生殖發(fā)育過(guò)程中的多種生物學(xué)功能，尤其在花序、花、果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用[13]。中藥火麻仁中共鑒定出39 個(gè)MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子，其參與調(diào)控火麻仁的營(yíng)養(yǎng)和生殖結(jié)構(gòu)、開花時(shí)間、花器官形成[14]，茶樹中MADS-box 蛋白CsGLO1 和CsGLO2 可形成二聚體調(diào)控第2 輪花瓣和第3 輪雄蕊的發(fā)育[15]。馬鈴薯中XAL1 蛋白參與調(diào)控其塊莖的發(fā)育[16]。甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子尚未見報(bào)，本研究從甘松中鑒別出20 個(gè)功能未知的MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子，首次全面分析了甘松的MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子，有利于進(jìn)一步對(duì)甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能分析及后續(xù)驗(yàn)證。

與擬南芥相比，甘松MADS-box蛋白相對(duì)較少。一方面與所測(cè)轉(zhuǎn)錄組序列完整度有關(guān)，另一方面可能與甘松MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子的重復(fù)率較高或重復(fù)后拼接丟失率較高有關(guān)。這一結(jié)果表明，不同物種間MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子的差異較大，導(dǎo)致不同物種間MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子不同，各自的功能也差別較大，具有不同的進(jìn)化限制[17]。

3.2 甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子與其藥用價(jià)值的息息相關(guān)

抽薹開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通常稱為成花轉(zhuǎn)變[18]。多數(shù)以根莖入藥的藥材抽薹開花后藥效顯著降低。如當(dāng)歸抽薹過(guò)程中，多個(gè)生理指標(biāo)發(fā)生變化，開花后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，根部木質(zhì)化，喪失藥用價(jià)值[19]。防風(fēng)以干燥根入藥，抽薹前后，其主要有效成分人參炔醇含量逐漸自根部向地上部分轉(zhuǎn)移，隨后根部開始木質(zhì)化并中空腐爛，藥用價(jià)值顯著降低[20]。研究表明，MADS-box 家族中轉(zhuǎn)錄因子較多與植物抽薹開花相關(guān)。模式植物擬南芥中MADS-box 家族中AP1 蛋白能調(diào)控與抽薹相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，與擬南芥AP1 蛋白同源的的春甘藍(lán)AP1 蛋白也對(duì)植株抽薹有調(diào)控作用[21]，十字花科植物芥菜中SOC1 蛋白可直接作用于抽薹的決定基因LFY，此外SVP 蛋白結(jié)合SOC1 能調(diào)控AP1 蛋白從而影響其抽薹。MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子多參與調(diào)控植物抽薹過(guò)程以及開花時(shí)間[22]。萵苣LsRGL1 蛋白可通過(guò)調(diào)控赤霉素途徑控制抽薹開花時(shí)間[18]，LSMADS16 和LSMADS37 蛋白對(duì)萵苣高溫抽薹具有負(fù)調(diào)控作用。甘松以干燥根及根莖入藥，也面臨抽薹開花后有效成分含量降低的問(wèn)題，本研究鑒定出20 個(gè)甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子，其中NcMADS14 與擬南芥SOC1 同源，NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18與擬南芥SVP 蛋白同源明，推測(cè)這5 個(gè)蛋白可能參與調(diào)控甘松抽薹開花過(guò)程，為晰甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控其抽薹開花時(shí)間，減慢甘松根莖木質(zhì)化過(guò)程，保證藥材藥效提供理論基礎(chǔ)。

3.3 甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控花器官發(fā)育與藥用部位的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)

MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子在控制植物開花時(shí)間及花器官發(fā)育中起重要作用[23]，部分參與調(diào)控植物根的發(fā)育。2001 年，Theissen[24]提出了四聚體模型即ABCDE 模型：A 類和E 類基因控制花萼的形成，A 類、B 類和E 類基因共同控制花瓣的形成，B 類、C 類和E 類基因共同控制雄蕊的形成，而心皮由C類和E 類基因共同控制，胚珠由C 類、D 類和E 類基因共同控制。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，NcMADS04與擬南芥A 類基因FUL同源性高，其可能與甘松花萼形成相關(guān)，NcMADS16與擬南芥B 類基因AP3同源性高，推測(cè)NcMADS16可能參與調(diào)控甘松花瓣與雄蕊的形成過(guò)程。NcMADS05與擬南芥D 類基因SHP同源性高，可能參與甘松心皮的形成過(guò)程。NcMADS09、NcMADS20與擬南芥E 類基因SEP聚為一類，則二者可能為甘松的E 類基因，與ABCD類基因共同參與調(diào)控花器官的形成過(guò)程。本研究通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，甘松20 個(gè)MADS-box 家族中未有與擬南芥同源的C 類基因，可能是轉(zhuǎn)錄組拼接錯(cuò)誤導(dǎo)致甘松C 類基因缺失，需繼續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

SOC1 為開花整合因子，可通過(guò)整合光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、溫度途徑和年齡途徑等相關(guān)開花信號(hào)來(lái)控制開花時(shí)間[25]，已有研究表明臍橙中CsSOC1基因能響應(yīng)低溫信號(hào)，表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)臍橙成花[26]，胡蘿卜DcSOC1-1是光周期成花途徑的整合因子，長(zhǎng)日照使胡蘿卜抽薹延遲[27]。本研究發(fā)現(xiàn)NcMADS14 與擬南芥SOC1同源，推測(cè)其具有與SOC1 類似的功能。

NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18 與擬南芥SVP 蛋白同源，SVP 為開花抑制因子[28]，可直接結(jié)合在開花途徑整合因子SOC1 的啟動(dòng)子上，從而調(diào)節(jié)SOC1的轉(zhuǎn)錄，抑制其表達(dá)，延遲抽薹開花[29]。若將甘松中與擬南芥SOC1、SVP同源的基因合理地通過(guò)基因工程手段改造植株，則可獲得晚開花的植株。以延長(zhǎng)甘松采收時(shí)期，加大生產(chǎn)。

甘松以根及根莖入藥，本課題組前期研究表明，仿野生栽培甘松須根根尖數(shù)明顯多于野生品，且主根變細(xì)，嚴(yán)重影響仿野生栽培甘松的品質(zhì)[30]，ANR1是在根中特異性表達(dá)的基因，也是MADS-box 家族基因中第一個(gè)被鑒定的唯一通過(guò)NO3-對(duì)信號(hào)調(diào)控側(cè)根形成[31]。研究表明，ANR1在擬南芥根中特異性表達(dá)，菊花中CmANR1 通過(guò)同源/異源二聚體調(diào)節(jié)側(cè)根發(fā)育[32]。ANR1在水稻中的同源基因OsMADS25在NO3-存在時(shí)過(guò)表達(dá)，能顯著促進(jìn)水稻主根和側(cè)根生長(zhǎng)[10]。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，甘松MADS-box 家族基因轉(zhuǎn)錄因子中NcMADS01、NcMADS10、NcMADS11、NcMADS12、NcMADS15、NcMADS17 與擬南芥ANR1 同蛋白源性高，可能參與調(diào)控甘松根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。后期可通過(guò)探明其如何參與根發(fā)育調(diào)控，從而減少須根數(shù)，保持主根粗壯，從而獲得根及根莖性狀符合藥用規(guī)定且統(tǒng)一的優(yōu)良甘松品種。

4 結(jié)論

甘松MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和挖掘有待進(jìn)一步完善。本研究通過(guò)了解甘松MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能及參與的生理過(guò)程，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也為甘松的分子生物學(xué)研究提供一定的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突