田 瑞 ，王崢濤，謝 燕*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)公共健康學(xué)院，上海 201203

山楂為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.或山里紅C.pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的干燥成熟果實(shí)[1]，含有豐富的黃酮類、有機(jī)酸類、萜類、多糖類等化學(xué)成分[2]，味酸性溫，具有健脾胃、助消化、通暢血脈、行氣散瘀的功效[3-4]，可用于肉食積滯、心血管疾病、疝氣、胸痹，婦女產(chǎn)后瘀阻腹痛、痛經(jīng)等疾病的治療[5]。山楂炭為臨床常用的山楂炮制品，是將山楂飲片經(jīng)武火炮制成表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色而得。山楂在炮制成山楂炭后，其性味轉(zhuǎn)為苦澀，收斂能力增強(qiáng)，由山楂通暢血脈、消散瘀滯的活血作用轉(zhuǎn)變?yōu)槠谑諠闹寡饔?，常被用于腸風(fēng)下血等癥狀。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山楂炭能夠較好地治療慢性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)直腸癌便血等疾病[6]。目前，采用HPLC、紫外分光光度法等對(duì)山楂炮制前后的化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，山楂制炭后其黃酮類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類成分均大幅降低，鈣離子含量有所增加，這可能與山楂炭產(chǎn)生止血作用有關(guān)[7-9]，但其發(fā)揮止血作用的活性成分仍不明晰，還需進(jìn)一步探究。

以活性評(píng)價(jià)為導(dǎo)向進(jìn)行化學(xué)成分分離是發(fā)現(xiàn)并確定中藥中化學(xué)活性成分的一種有效方法，即在化學(xué)成分的分離純化過程中，通過藥效實(shí)驗(yàn)定位中藥活性成分所在部位或流分，并有針對(duì)性地對(duì)所確定的活性部位或流分進(jìn)行分離純化，最終獲得中藥化學(xué)活性成分[10]。這極大地提高了活性成分的分離效率，許多結(jié)構(gòu)明確的中藥藥效成分都是通過該方法獲得[11-12]，如臨床應(yīng)用廣泛的抗瘧藥物青蒿素、具有廣譜抗腫瘤作用的喜樹堿等[13]。因此，本研究以止血活性為導(dǎo)向，采用體內(nèi)外止血藥效實(shí)驗(yàn)與化學(xué)成分分離技術(shù)相結(jié)合的方法，從山楂炭中分離純化得到發(fā)揮止血作用的活性成分，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，初步探討其作用機(jī)制，為山楂炭的臨床合理用藥、質(zhì)量控制等提供理論參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（體質(zhì)量300～350 g，合格證號(hào)20180006030200）、雌性及雄性ICR 小鼠（體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào)20180006021172）均購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0006。動(dòng)物在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)PZSHUTCM200522002）。

1.2 藥材

山楂購(gòu)自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏教授鑒定為薔薇科植物山楂C.pinnatifidaBge.的干燥成熟果實(shí)，按《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》2018 年版炮制成山楂炭。

1.3 藥品與試劑

云南白藥膠囊（批號(hào)ZFA2116）購(gòu)自云南白藥集團(tuán)股份有限公司；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)20160527，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）購(gòu)自陜西綠清生物工程有限公司；金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)C5-1007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心；綠原酸（批號(hào)110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-200907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.40%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；柱層析硅膠購(gòu)自青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20 購(gòu)自美國(guó)GE 公司；活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑盒（批號(hào)562633）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）試劑盒（批號(hào)565764）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）試劑盒（批號(hào)50728）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）試劑盒（批號(hào)565087）購(gòu)自日本希森美康株式會(huì)社；二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP，批號(hào)S30GR162961）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、乙醇、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；磷酸（HPLC 級(jí)）購(gòu)自CNW 公司；甲醇、乙腈（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.4 儀器

1260II 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Ultrashield? 400 Plus 400M 核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；CS-5100 型全自動(dòng)凝血儀（日本希森美康株式會(huì)社）；AggRAM 型血小板聚集儀（美國(guó)Helena 公司）；LC-3000 型半制備高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）。

2 方法

2.1 HPLC 分析

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，用少量甲醇溶解后，稀釋至刻度，混勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取生山楂及山楂炭細(xì)粉各1 g，分別置于具塞量瓶中，加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，取上清液，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，9% B；20～30 min，9%～17% B；30～45 min，17% B；45～55 min，17%～30% B；55～60 min，30%～42% B；60～80 min，42% B。檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min。

2.2 小鼠體內(nèi)止血時(shí)間及凝血時(shí)間測(cè)定

2.2.1 樣品溶液的制備

（1）生山楂、山楂炭、活性炭水煎液的制備：分別稱取生山楂、山楂炭、活性炭粗粉各30 g，加水300 mL，浸泡30 min 后，煎煮1 h，濾過；第2次加水200 mL，煎煮30 min，濾過，將2 次所得濾液合并，減壓濃縮至每毫升相當(dāng)于原藥材60 mg，即得。

（2）山楂炭醇提液的制備：稱取山楂炭粗粉30 g，加入75%乙醇300 mL 加熱回流提取3 次，每次2 h，趁熱濾過，合并3 次所得濾液，減壓濃縮至每毫升相當(dāng)于原藥材60 mg，無(wú)醇味。

2.2.2 動(dòng)物分組及給藥 ICR 小鼠60 只隨機(jī)分為空白組、云南白藥（0.375 g/kg）組、活性炭水煎液（3.0 g/kg）組、生山楂水煎液（3.0 g/kg）組、山楂炭水煎液（3.0 g/kg）組和山楂炭醇提液（3.0 g/kg）組，每組10 只，雌雄各半。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，空白組ig 純水，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，1 次/d，連續(xù)7 d。

2.2.3 小鼠止血時(shí)間測(cè)定 末次給藥后1 h，采用剪尾法測(cè)定各組小鼠止血時(shí)間。小鼠麻醉后，于距鼠尾5 mm 處剪斷，觀察小鼠尾部出血情況，待血液自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔15 s 用濾紙吸附1 次，直至沒有血液流出（濾紙吸附時(shí)無(wú)血跡），停止計(jì)時(shí)，即為止血時(shí)間。

2.2.4 小鼠凝血時(shí)間測(cè)定 末次給藥后1 h，采用毛細(xì)管法測(cè)定小鼠凝血時(shí)間。小鼠麻醉后，用毛細(xì)管（長(zhǎng)10 cm，內(nèi)徑1 mm）在小鼠眼球后靜脈叢取血，自血液進(jìn)入毛細(xì)管時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔15 s 折斷毛細(xì)管約0.5 cm，緩慢向左右拉開，觀察折斷處是否出現(xiàn)血凝絲，當(dāng)出現(xiàn)血凝絲時(shí)，立即在另一端折斷驗(yàn)證，至兩端均出現(xiàn)血凝絲時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為凝血時(shí)間。

2.3 山楂炭不同極性部位的分離

稱取山楂炭粗粉1 kg，加入75%乙醇10 L 加熱回流提取3 次，每次2 h，趁熱濾過，合并3 次所得濾液，減壓濃縮至500 mL，取50 mL 水浴蒸干后，減壓干燥，得山楂炭醇提物（21.15 g），保存在干燥器內(nèi)備用。取剩余450 mL 山楂炭醇提液，依次用等量的石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇萃取5 次。將得到的石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇萃取液及水溶液減壓濃縮，水浴蒸干后，真空干燥至恒定質(zhì)量，得石油醚部位（9.72 g）、醋酸乙酯部位（31.14 g）、正丁醇部位（26.73 g）、水部位（130.14 g）。

2.4 山楂炭不同極性部位對(duì)小鼠體內(nèi)止血時(shí)間及凝血時(shí)間的影響

2.4.1 動(dòng)物分組及給藥 ICR 小鼠70 只隨機(jī)分為空白組、云南白藥（0.375 g/kg）組、山楂炭醇提物（3.0 g/kg，以生藥量計(jì)）組、石油醚部位（3.0 g/kg，以生藥量計(jì)）組、醋酸乙酯部位（3.0 g/kg，以生藥量計(jì)）組、正丁醇部位（3.0 g/kg，以生藥量計(jì)）組和水部位組（3.0 g/kg，以生藥量計(jì)），每組10 只，雌雄各半。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，空白組ig 0.5%CMC-Na 溶液，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，1 次/d，連續(xù)7 d。

2.4.2 小鼠止血時(shí)間及凝血時(shí)間測(cè)定 按照“2.2.3”及“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行小鼠止血時(shí)間及凝血時(shí)間的測(cè)定。

2.5 山楂炭止血作用化學(xué)物質(zhì)的分離及鑒定

取“2.3”項(xiàng)下所得醋酸乙酯部位進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4），將所得流分進(jìn)行薄層鑒別，合并相同流分，得到21 個(gè)流分（Fr.1～21）。

將Fr.1～21 減壓干燥后取適量，用含50%乙醇生理鹽水溶解，0.22 μm 微孔濾膜濾過，配制成每毫升相當(dāng)于生藥0.3 g 的供試藥液。以含50%乙醇生理鹽水為空白對(duì)照，采用試管法[14]考察各流分對(duì)大鼠體外全血凝固時(shí)間的影響。取雄性SD 大鼠，麻醉后，采用一次性真空采血管（0.109 mol/L 枸櫞酸鈉）進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，得抗凝全血。取0.1 mL 供試藥物和0.5 mL 抗凝全血加入至潔凈玻璃試管中，平行6 份，混勻，37 ℃水浴中孵育1 min，再向試管內(nèi)加入0.1 mL 相同溫度的0.025 mol/L CaCl2溶液，混勻，立即計(jì)時(shí)，每隔15 s 傾斜試管1 次。當(dāng)傾斜試管時(shí)血液凝固在底部無(wú)法流動(dòng)，停止計(jì)時(shí)，即為體外全血凝固時(shí)間。

將上述所得具有止血活性的流分采用Sephadex LH-20 及半制備HPLC 進(jìn)行分離純化，得到山楂炭中發(fā)揮止血作用的化合物，并結(jié)合核磁共振波譜的結(jié)果對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.6 體外凝血四項(xiàng)及血小板聚集率測(cè)定方法

稱取松柏醛20 mg，加2 mL 甲醇使溶解，得松柏醛的甲醇溶液（10 mg/mL），分別吸取50、100、200 μL，除去甲醇后，加入2 mL 生理鹽水，超聲溶解，將松柏醛配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL 的溶液，即為松柏醛低、中、高質(zhì)量濃度組。

取雄性SD 大鼠，麻醉后，用一次性真空采血管（0.109 mol/L 枸櫞酸鈉）進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，得抗凝全血，3000 r/min 離心10 min，取上層抗凝血漿。將供試藥液與抗凝血漿按1∶4 的比例混勻，37 ℃孵育3 min 后，置于一次性樣品杯中，用全自動(dòng)凝血分析儀對(duì)其APTT、PT、TT、FIB 進(jìn)行測(cè)定，以生理鹽水為空白對(duì)照，每組平行6 份。

取雄性SD 大鼠，麻醉后，用一次性真空采血管（0.109 mol/L 枸櫞酸鈉）進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，將所得抗凝全血1000 r/min 離心10 min，取上層富血小板血漿（PRP）；將剩余全血3000 r/min 離心10 min，取上層貧血小板血漿（PPP）；用PPP 稀釋調(diào)整PRP 中血小板濃度為1.5×108個(gè)/mL，備用。吸取供試品10 μL 與稀釋后的PRP 215 μL 混合，37 ℃孵育3 min 后，加入25 μL 濃度為10 μmol/L 的ADP激動(dòng)劑，立即放入血小板聚集儀測(cè)試，記錄聚集曲線，得血小板聚集率。每組平行6 份。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 山楂及山楂炭HPLC 圖譜對(duì)比

如圖1 所示，山楂在炮制成山楂炭后，極性較大成分的含量降低，而小極性成分的含量有所增加。山楂中原本含量較高的成分如綠原酸、金絲桃苷等顯著降低或消失，這可能與炮制過程中的高溫使山楂中一些極性大的成分破壞或降解，生成小極性成分有關(guān)。此外，山楂炭的HPLC 圖譜在tR=48.5、49.7 min 處出現(xiàn)2 個(gè)新的特征峰，表明在炮制過程中山楂中的一些成分可能在高溫下發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化而生成新的成分。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、生山楂 (B) 及山楂炭 (C) 的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance(A),Crataegi Fructus (B) and hawthorn charcoal (C)

3.2 山楂與山楂炭體內(nèi)止血及凝血作用比較

如表1 所示，與空白組比較，各給藥組的止血時(shí)間和凝血時(shí)間均有所降低，表明各組均具有一定的促進(jìn)止血及凝血效果，其中云南白藥組、山楂炭水煎液組、山楂炭醇提液組的效果較好，具有顯著性差異（P＜0.01），山楂炭醇提液組止血作用最強(qiáng)；活性炭水煎液組及生山楂水煎液組的止血作用較弱。山楂炭水煎液組的止血時(shí)間及凝血時(shí)間較生山楂水煎液組分別縮短了47.88%和41.64%，表明山楂在炮制成山楂炭后，止血作用大幅增加。活性炭組的止血時(shí)間及凝血時(shí)間均較各山楂炭組長(zhǎng)，說(shuō)明山楂炭的促凝作用可能還與山楂炭中炭素以外的物質(zhì)有關(guān)。山楂炭醇提液組的止血時(shí)間及凝血時(shí)間均較山楂炭水煎液組進(jìn)一步降低，表明山楂炭醇提液中的止血活性成分含量較其水煎液中更多。

表1 山楂炭對(duì)小鼠止血時(shí)間及凝血時(shí)間的影響 (,n=10)Table 1 Effect of hawthorn charcoal on bleeding time and coagulation time in mice (,n=10)

表1 山楂炭對(duì)小鼠止血時(shí)間及凝血時(shí)間的影響 (,n=10)Table 1 Effect of hawthorn charcoal on bleeding time and coagulation time in mice (,n=10)

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與云南白藥組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下表同*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs blank group;#P ＜ 0.05 ##P ＜0.01 vs Yunnan Baiyao group,same as below tables

3.3 山楂炭不同極性部位體內(nèi)止血及凝血作用評(píng)價(jià)

如表2 所示，與空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組止血時(shí)間均顯著降低（P＜0.01），表現(xiàn)出明顯的止血作用，其中山楂炭醋酸乙酯部位組止血時(shí)間最短，其止血作用最好。與止血時(shí)間結(jié)果相似，與空白組比較，云南白藥組、山楂炭醇提物組、山楂炭石油醚組、山楂炭醋酸乙酯組均能縮短小鼠體內(nèi)凝血時(shí)間（P＜0.05、0.01），具有顯著的促凝效果；而山楂炭正丁醇部位組及水部位組的凝血時(shí)間與空白組接近，未表現(xiàn)出明顯的促凝效果。此外，山楂炭醋酸乙酯部位組的小鼠體內(nèi)止血時(shí)間及凝血時(shí)間均較云南白藥組更短，在4 個(gè)極性部位中表現(xiàn)出最好的體內(nèi)止血作用，說(shuō)明其為山楂炭發(fā)揮體內(nèi)止血作用的有效部位。

表2 山楂炭不同極性部位對(duì)小鼠止血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響 (,n=10)Table 2 Effect of different polar parts of hawthorn charcoal on bleeding time and coagulation time in mice (,n=10)

表2 山楂炭不同極性部位對(duì)小鼠止血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響 (,n=10)Table 2 Effect of different polar parts of hawthorn charcoal on bleeding time and coagulation time in mice (,n=10)

3.4 山楂炭醋酸乙酯部位各流分體外凝血作用評(píng)價(jià)

將收集所得Fr.1～21 進(jìn)行體外凝血效果考察，如圖2 所示。與空白組比較，F(xiàn)r.2、5、9、15 可降低體外全血凝固時(shí)間（P＜0.05、0.01），表現(xiàn)出促進(jìn)凝血的效果，F(xiàn)r.4、8 可顯著延長(zhǎng)體外全血凝固時(shí)間（P＜0.05、0.01），表現(xiàn)出抑制凝血的效果，其余流分對(duì)凝血效果影響不明顯。其中，F(xiàn)r.5、15 顯示出顯著的促進(jìn)凝血的效果，推測(cè)其為山楂炭止血作用的藥效流分。

圖2 山楂炭醋酸乙酯部位各流分對(duì)體外全血凝固時(shí)間的影響 (,n=6)Fig.2 Effect of different fractions from ethyl acetate parts of hawthorn charcoal on in vitro whole blood coagulation time(,n=6)

3.5 山楂炭醋酸乙酯部位分離流分的HPLC 圖譜

如圖3 所示，山楂炒炭后新生成的成分（tR=48.5、49.7 min）分別主要存在于Fr.5 和Fr.8 中，而在Fr.15 中未發(fā)現(xiàn)明顯的特征峰，結(jié)合Fr.5 顯著的促進(jìn)止血作用，推測(cè)tR=48.5 min 處的新生成成分可能與山楂炭止血作用有關(guān)；而Fr.8 并未表現(xiàn)出止血作用，推測(cè)tR=49.7 min 處的新生成成分不具有止血活性，因此，對(duì)tR=48.5 min 處的成分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

圖3 Fr.2 (A)、Fr.5 (B)、Fr.8 (C)、Fr.15 (D) 及山楂炭醋酸乙酯部位 (E) 的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of Fr.2 (A),Fr.5 (B),Fr.8 (C),Fr.15 (D) and ethyl acetate extract of hawthorn charcoal (E)

3.6 山楂炭止血藥效成分的分離及鑒定

對(duì)有明顯止血作用的Fr.5 進(jìn)行一系列分離后，得到山楂炭中發(fā)揮止血作用的化學(xué)物質(zhì)，即tR=48.5 min 的化學(xué)成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。該化合物為淡黃色油狀物；m/z177 [M-H]-，分子式為C10H10O3。1H-NMR（CD3OD,400 MHz）δ: 9.58 (1H,d,J=7.8 Hz,H-9),7.56 (1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.16(1H,d,J=8.1 Hz,H-6),6.87 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.69 (1H,dd,J=16.0,7.8 Hz,H-8),3.91 (3H,s,3-OCH3)；13C-NMR（CD3OD,100 MHz）δ: 126.2 (C-1),110.7 (C-2),150.3 (C-3),148.1 (C-4),115.2 (C-5),123.8 (C-6),154.9 (C-7),125.3 (C-8),194.8 (C-9),55.1(3-OCH3)。根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)，通過與文獻(xiàn)報(bào)道[15]對(duì)比，確定該化合物為松柏醛（圖4）。

圖4 松柏醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及HPLC 圖譜Fig.4 Chemical structure and HPLC chromatogram of coniferaldehyde

3.7 松柏醛對(duì)體外凝血四項(xiàng)及血小板聚集率的影響

如表3 所示，不同質(zhì)量濃度的松柏醛作用于血漿后，所測(cè)得的APTT 及PT 與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，表明其對(duì)外源性及內(nèi)源性凝血途徑無(wú)影響；但中、高質(zhì)量濃度的松柏醛可以顯著降低TT（P＜0.05、0.001），且與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，表明松柏醛的凝血作用與其影響共同凝血途徑相關(guān)；并且松柏醛還能夠顯著增加FIB 含量（P＜0.05、0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明松柏醛的促凝作用可能與激活纖維蛋白原有關(guān)；此外，松柏醛能夠顯著提高血小板聚集率（P＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性，表明松柏醛可以促進(jìn)血液中血小板的聚集，從而發(fā)揮止血作用。

表3 松柏醛對(duì)APTT、PT、TT、FIB 及血小板聚集率的影響 (,n=6)Table 3 Effect of coniferaldehyde on APTT,PT,TT,FIB and platelet aggregation rate (,n=6)

表3 松柏醛對(duì)APTT、PT、TT、FIB 及血小板聚集率的影響 (,n=6)Table 3 Effect of coniferaldehyde on APTT,PT,TT,FIB and platelet aggregation rate (,n=6)

4 討論

中藥在炮制過程中其化學(xué)成分發(fā)生較大的改變，這可能是其炮制前后藥效發(fā)生改變的主要原因。中藥在炒炭過程中，其化學(xué)成分會(huì)發(fā)生較大的改變，大量化合物發(fā)生裂解、脫水、美拉德等反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為具有止血活性的新成分，從而使炭藥具有更好的止血作用，如側(cè)柏[16]、荷葉[17]在炮制成炭藥后，其所含黃酮苷受熱大部分分解為槲皮素等黃酮苷元類成分，可以顯著降低APTT 或PT，發(fā)揮止血作用。此外，一些中藥在制炭過程中，某些成分在高溫下發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為新的化學(xué)成分，如蒲黃[18]中槲皮素和鼠李糖在炮制過程中轉(zhuǎn)化為新成分huaicarbon A/B，且具有良好的止血活性。生山楂的活性成分主要為黃酮類及有機(jī)酸類成分[19]，本研究選擇黃酮類成分金絲桃苷、蘆丁、槲皮素，有機(jī)酸類成分綠原酸進(jìn)行HPLC 圖譜考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山楂在炮制成山楂炭后其黃酮及有機(jī)酸類成分大幅下降，說(shuō)明山楂炭的止血作用與黃酮及有機(jī)酸類成分的相關(guān)性不大。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與生山楂相比，山楂炭中有新成分生成，且這些成分主要為小極性化合物，可能是生山楂由活血作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹寡饔玫囊淮笤颉?/p>

炭藥在炮制過程中產(chǎn)生的炭素（活性炭）具有良好的吸附作用，有助于激活凝血因子及血小板因子，被認(rèn)為是炭藥止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[20]。本研究考察活性炭對(duì)小鼠的體內(nèi)止血作用發(fā)現(xiàn)，其能降低小鼠體內(nèi)止血及凝血時(shí)間，但并不具有顯著性。而山楂炭及其醋酸乙酯部位均表現(xiàn)出較云南白藥組更強(qiáng)的止血作用，因此推測(cè)山楂炭中發(fā)揮止血作用的物質(zhì)包括但不限于活性炭（炭素）。并且發(fā)現(xiàn)山楂炭醇提液具有更好的止血作用，這可能是由于乙醇回流與常規(guī)的水煎煮相比能夠有效地提取出山楂炭中的黃酮類、三萜類等小極性化合物[21-22]，表明山楂炭中的小極性成分可能與山楂炭止血作用有關(guān)。

本研究以生物活性為導(dǎo)向分離藥效成分：采用柱色譜分離與藥效實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，篩選得到山楂炭的藥效部位——醋酸乙酯部位，并對(duì)其進(jìn)一步分離，篩選得到山楂炭止血化學(xué)成分所在流分，再根據(jù)HPLC 圖譜對(duì)其中可能的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，并通過波譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，最終得到具有止血活性的苯丙素類化合物松柏醛。結(jié)合HPLC 圖譜分析，認(rèn)為松柏醛即為山楂炭HPLC 圖譜中tR=48.5 min的新生成成分；松柏醛幾乎不存在于生山楂中，但在山楂炭中的含量明顯提升，可能是生山楂中的木質(zhì)素類成分在高溫炮制過程中β-O-4 化學(xué)鍵發(fā)生斷裂而生成[23-24]；且松柏醛表現(xiàn)出良好的止血作用。因此，推測(cè)松柏醛是山楂炭止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

凝血四項(xiàng)是目前評(píng)價(jià)出血性疾病的重要指標(biāo)，不同的檢測(cè)項(xiàng)目所反映的凝血作用途徑也不同，PT反映血漿中凝血因子II、V、VII 和X 的水平，是臨床上反映外源性凝血系統(tǒng)的常用檢測(cè)方法；APTT能反映血漿凝血因子VIII、IX、XI 和XII 的水平，是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)最常用的篩選試驗(yàn)；TT 主要反映凝血共同途徑纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程中，是否存在纖維蛋白原異常、以及是否發(fā)生纖溶、存在抗凝物的情況；FIB 是血凝塊的重要結(jié)構(gòu)組成，它能反映血液中的纖維蛋白原含量[25]。血小板具有黏附、聚集等生理特性，也是影響凝血的關(guān)鍵因素，當(dāng)出現(xiàn)血管損傷時(shí)，血小板會(huì)黏附在受損的血管壁上，使血小板聚集以抑制血液的流出[26]。凝血四項(xiàng)及血小板聚集率的結(jié)果顯示，松柏醛能夠促進(jìn)血小板的聚集，主要通過激活纖維蛋白原與共同凝血途徑發(fā)揮凝血作用，而與外源性及內(nèi)源性凝血途徑相關(guān)性不大。

綜上，本研究確定山楂炭不同極性部位中，醋酸乙酯部位為山楂炭發(fā)揮止血作用的藥效部位；并以止血活性為導(dǎo)向從山楂炭醋酸乙酯部位中分離得到松柏醛，其可以通過共同凝血途徑、激活纖維蛋白原系統(tǒng)及促進(jìn)血小板聚集而發(fā)揮止血作用。初步明確了山楂炭中發(fā)揮止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及山楂炒炭止血的機(jī)制，為山楂炭的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為豐富中藥炭藥物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制的研究提供一定借鑒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突