丁 銳，王奎龍，沈夢丹，吳 鑫，吳國清 ，曹 崗*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007

3.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012

4.浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室，浙江 杭州 310063

藥物在發(fā)揮藥效的同時，可能會產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，引起機體損傷，這種損傷稱之為藥物毒副作用，其中以藥物的肝腎毒性最為常見。中草藥肝腎毒性事件近幾年來也引起越來越多的關(guān)注，如馬兜鈴酸引起的腎毒性[1]及何首烏引起的肝毒性事件[2]，給患者帶來痛苦的同時也把中藥的安全性問題推向了風(fēng)口浪尖。在全球范圍內(nèi)，藥源性肝損傷[3]是肝病學(xué)家面臨的最具挑戰(zhàn)性的肝臟疾病之一，中草藥的肝腎毒性問題同樣嚴重[4]，隨著中藥及其制劑在國內(nèi)外廣泛的應(yīng)用，其安全性問題不容忽視[5]，否則將阻礙中藥的現(xiàn)代化及國際化進程。中藥炮制是一門傳統(tǒng)的制藥技術(shù)，可以達到增效減毒的作用[6-8]。峻下逐水類中藥是一類臨床常用的毒性中藥，大多采用醋制法炮制減毒，如芫花二氯甲烷部位醋制后可降低其對大鼠肝腎細胞的氧化損傷[9]，商陸也是其中的代表之一。商陸為商陸科植物商陸Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陸P.amerrcanaL.的干燥根，具有逐水消腫、通利二便的作用[10]。商陸成分復(fù)雜，其毒性成分主要為商陸皂苷類成分[11]，該類成分具有腸道[12-13]、肝臟[14-15]及腎臟[16-17]毒性。目前對于商陸醋制減毒的研究大多集中在商陸的胃腸道刺激性方面，但對于醋制是否能夠降低商陸的肝腎毒性卻鮮有報道，本研究通過整體動物模型，對血清生化指標(biāo)及組織病理切片的觀察，明確醋制能否降低商陸的肝腎毒性，并進一步通過代謝組學(xué)的方法探究其醋制減毒的作用機制。

代謝組學(xué)是繼蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)后發(fā)展起來的圍繞機體代謝的新興組學(xué)[18]。目前代謝組學(xué)在中藥以及藥物毒性研究方面已有較多報道[19-21]，Dong 等[22]運用代謝組學(xué)方法評價天南星對大鼠的腎毒性，為中藥毒性的動態(tài)和整體研究提供了一個有前景的工具。Luo 等[23]通過代謝組學(xué)的方法探討梔子誘導(dǎo)的肝毒性的作用機制，發(fā)現(xiàn)膽汁酸代謝和氨基酸代謝紊亂與梔子產(chǎn)生肝毒性密切相關(guān)。代謝組學(xué)已發(fā)展成為中藥研究領(lǐng)域一種常規(guī)的研究手段。本研究采用代謝組學(xué)的方法來研究商陸醋制降低肝腎毒性的作用機制，將為商陸醋制減毒機制的探索提供參考，為中藥炮制減毒機制研究提供借鑒。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠50 只，3～5 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號SCXK（滬）2022-0004。動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，恒定溫度濕度。動物實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號IACUC-20221017-14）。

1.2 藥材

商陸購自安徽亳州市場，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡寶昌教授鑒定為商陸P.acinosaRoxb.干燥根。

1.3 藥品與試劑

小鼠營養(yǎng)飼料由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供；寧化府名特醋購自太原市寧化府益源慶醋業(yè)有限公司；羧甲基纖維素鈉溶液（批號190710）購自上海展云化工有限公司；舒泰50（規(guī)格50 g/L，批號191123）購自法國維克貿(mào)易（上海）有限公司；鹽酸賽拉嗪注射液（規(guī)格2 mL/支，批號200112）購自吉林省華牧動物保健品有限公司；10%福爾馬林固定液（批號20210623）購自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；石蠟（批號C12221754）購自上海麥克林生化科技有限公司；包埋盒購自江蘇世泰實驗器材有限公司；無水乙醇（批號20200831）購自廣東光華科技股份有限公司；黏附載玻片（批號20082）、蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司；二甲苯購自上海凜恩科技發(fā)展有限公司；甲醇（批號211218）、乙腈（批號207025）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸（批號J1908039）、熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）對照品（批號128-13-2，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硬脂酸（批號S27A11X122357）、膽酸（cholic acid，CA）對照品（批號81-25-4）、鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）對照品（批號474-25-9）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）對照品（批號434-13-9）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）對照品（批號 640-79-9）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid hydrate，GDCA）對照品（批號360-65-6）、?；蛆Z去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）對照品（批號516-35-8）、?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholicacid，TUDCA）對照品（批號35807-85-3），以上均購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%；中性樹膠（批號20230407）、去氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）對照品（批號83-44-3，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司；?；敲撗跄懰幔╰aurodeoxycholic acid，TDCA）對照品（批號516-50-7，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Spring-S20 型純水機（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；Arcadia H 型石蠟包埋機、RM2255 型石蠟切片機（德國Leica 公司）；E200MV 型生物顯微鏡（南京尼康江南光學(xué)儀器有限公司）；Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；真空離心濃縮器（德國Eppendorf公司）；3100 型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 生品商陸正丁醇部位的制備 取生商陸10 kg，放置到提取罐中，加入8 倍量的70%乙醇回流提取2 h，殘渣加入6 倍量70%乙醇回流提取1 h，重復(fù)上述操作，合并3 次提取液，減壓濃縮，得醇浸膏。將商陸70%乙醇浸膏用適量水溶解，采用石油醚、二氯甲烷梯度萃取，最后加入4 倍量的水飽和正丁醇，多次萃取后，合并萃取液，回收溶劑，減壓干燥得到正丁醇浸膏，則為生品商陸正丁醇部位。

2.1.2 醋制商陸正丁醇部位制備 取生品商陸片，加入米醋拌勻，悶潤至透，置于炒鍋內(nèi)文火加熱，炒干，即得醋制商陸（每100 kg 商陸，用醋30 kg[4]）。取醋制商陸，按“2.1.1”項下方法制備醋制商陸正丁醇部位，生品及醋制商陸正丁醇部位得率均為20%。

2.2 成分分析

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取生醋品商陸正丁醇部位提取物各1 mg，甲醇定容至1 mL，12 000 r/min 離心10 min，取上清待測。

2.2.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min，18%～33% B；8～13 min，33%～90% B；13～20 min，90% B。柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量1 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 采用ESI 離子源，數(shù)據(jù)全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式，正、負離子模式掃描采集，通過LockSpray 技術(shù)確保每個保留時間采集到準(zhǔn)確的碎片信息。正、負離子模式毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度350 ℃；碰撞能量30～60 eV；MS1掃描時間為0.1 s，MS2掃描時間為0.01 s，采集離子范圍為m/z50～2000。

2.3 動物分組及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為對照組及生品商陸低、高劑量（27、54 mg/kg）[24]組和醋品商陸低、高劑量（27、54 mg/kg）組，每組10 只。各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組ig 5% CMC-Na 溶液，1 次/d，連續(xù)28 d。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測

末次給藥后，使用舒泰50（70 mg/kg）聯(lián)合鹽酸賽拉嗪注射液（5 mg/kg）麻醉小鼠后取血，采集到的血液待低溫靜置并分層后，4 ℃、3000 r/min 離心20 min，取上層血清，采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平。

2.5 肝、腎組織病理切片觀察

小鼠脫頸椎處死后，用手術(shù)剪剪開小鼠的腹腔，取出兩側(cè)腎臟和肝臟，生理鹽水清洗，吸除多余水分，浸泡于福爾馬林溶液中。自來水清洗，腎臟組織用刀片對半切開后取一半，肝臟組織切取大葉上約3 mm 厚度，分別放入包埋盒中，自來水流水沖洗過夜，次日梯度乙醇脫水，浸于硬脂酸-石蠟（1∶1，56～58 ℃）30 min，然后浸于石蠟中40 min，使用包埋機包埋，待石蠟冷卻后，去掉包埋槽，蠟塊室溫放置過夜。組織切片前，將蠟塊放于-20 ℃冰箱40 min 以上，使用切片機切取病理切片約4 μm厚度置于載玻片上，60 ℃烘箱熔蠟1 h，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，通風(fēng)櫥中揮發(fā)盡二甲苯，于顯微鏡下觀察肝、腎組織病理變化。

2.6 血清代謝組學(xué)分析

2.6.1 樣品處理 精密移取100 μL 血清于1.5 mL離心管中，加入300 μL 冰甲醇，渦旋15 s 后于4 ℃放置過夜。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，在真空離心濃縮器中蒸發(fā)至近干，然后加入100 μL 含有同位素標(biāo)記的膽酸（2 μg/mL）的70%甲醇溶液進行重新溶解，離心，收集上清液于200 μL 小瓶中，進行UPLC-Q-TOF/MS 分析。

2.6.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，20% B；2～12 min，20%～52% B；12～18 min，52%～65% B；18～22 min，65%～90% B；22～26 min，90%～20% B；26～30 min，20% B。體積流量0.3 mL/min；進樣量2 μL。

2.6.3 質(zhì)譜條件 帶有負離子模式下的電噴霧電離（ESI）源，數(shù)據(jù)范圍為50～2000。毛細管電壓2.5 kV；取樣錐電壓40 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑溫度500 ℃；錐形氣體積流量100 L/h；MS1掃描時間為0.25 s，MS2掃描時間為0.10 s，僅采集前7 強母離子。

2.6.4 數(shù)據(jù)分析 UPLC-MS 原始數(shù)據(jù)在Waters MassLynx 軟件上進行分析。通過Progenesis QI 軟件導(dǎo)出CSV 格式文件，利用預(yù)測中的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）和單向方差分析的P值來識別潛在的生物標(biāo)志物。通過將m/z和 MS/MS 片段離子與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB，http://www.HMDB.ca）進行比較，確定潛在的代謝標(biāo)記物。使用 MetaboAnalyst 5.0（http://www.MetaboAnalyst.ca）對原始數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），將整理好的潛在生物標(biāo)記物導(dǎo)入MetaboAnalyst 進行通路分析，尋找與商陸醋制減毒相關(guān)的代謝通路。

2.6.5 9 種膽汁酸的半定量分析 精密稱量9 種膽汁酸對照品，用含有同位素標(biāo)記的膽酸（2 μg/mL）的70%甲醇溶液梯度稀釋各膽汁酸對照品，配制9種膽汁酸。按“2.6.2”“2.6.3”項下條件進樣，統(tǒng)計不同濃度下各膽汁酸的響應(yīng)強度，以內(nèi)標(biāo)為參照，按照各膽汁酸響應(yīng)強度/內(nèi)標(biāo)響應(yīng)強度的比值進行響應(yīng)強度歸一化處理，構(gòu)建膽汁酸濃度與歸一化后的響應(yīng)強度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。統(tǒng)計各樣本中9 種膽汁酸與內(nèi)標(biāo)的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本種各膽汁酸的相對含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 炮制前后商陸正丁醇部位皂苷類成分的鑒定及半定量分析

如圖1 所示，采用Masslynx 對炮制前后商陸正丁醇部位的保留時間及分子離子峰進行統(tǒng)計，結(jié)合保留時間和特征碎片等信息，從生醋品商陸正丁醇部位中共推測鑒定出6 種皂苷類成分，見表1、2。

圖1 商陸醋制前后正丁醇部位總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation

表1 正離子模式商陸醋制前后正丁醇部位成分分析Table 1 Analysis of components in n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation in positive ion mode

3.2 血清生化分析

如圖2 所示，與對照組比較，商陸生品能夠呈劑量相關(guān)性地升高血清中ALT、AST 活性及BUN、Scr 水平（P＜0.05、0.01），表明商陸生品導(dǎo)致肝腎功能損傷，商陸醋品顯著降低了生品所導(dǎo)致的肝腎功能指標(biāo)的升高（P＜0.05），并呈劑量相關(guān)性。

圖2 商陸醋制前后對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 (,n=4)Fig.2 Effect of P.acinosa before and after vinegar preparation on serum biochemical indexes in mice (,n=4)

3.3 肝、腎組織病理分析

如圖3 所示，對照組小鼠肝細胞排列整齊有序，肝組織結(jié)構(gòu)整體完好，中央靜脈以中心向周圍放射狀排列，附近無炎癥發(fā)生；生品商陸低劑量組肝組織細胞排列較亂，胞體較大，細胞變性明顯，中央靜脈周圍炎癥細胞浸潤，部分細胞壞死；生品商陸高劑量組肝組織細胞排列混亂，肝細胞變性嚴重，胞體大，胞質(zhì)疏松化，中央靜脈周圍炎癥細胞浸潤，脂肪空泡多，細胞壞死程度嚴重，肝損傷嚴重；醋品商陸高劑量組肝細胞排列略微緊湊，中央靜脈周圍炎癥緩和，部分可見脂肪空泡和壞死細胞；醋品商陸低劑量組肝細胞排布整齊，中央靜脈周圍炎癥反應(yīng)少見，壞死細胞和脂肪空泡數(shù)量明顯減少。

表2 負離子模式商陸醋制前后正丁醇部位成分分析Table 2 Analysis of components in n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation in negative ion mode

圖3 各組小鼠肝臟病理變化 (HE,×100)Fig.3 Pathological changes in liver of mice in each group (HE,× 100)

如圖4 所示，對照組小鼠腎小球形態(tài)、大小正常，邊界清晰，腎小管排列緊密整齊，內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)完整；生品低劑量組部分腎小球萎縮，腎小管上皮細胞空泡化，一些腎小管內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)較不完整，腎間質(zhì)少量炎性細胞浸潤；生品高劑量組腎小球萎縮，內(nèi)皮和系膜細胞彌漫性增生，近曲小管結(jié)構(gòu)消失，遠曲小管繼續(xù)擴張，腎小管上皮細胞壞死脫落到管腔中，內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)消失，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤嚴重，部分腎間質(zhì)纖維化；醋品高劑量組腎小球大小、形態(tài)較為正常，腎小管內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)較完整，部分腎小管呈現(xiàn)上皮細胞空泡化，存在輕微炎性細胞浸潤；醋品低劑量組腎小球形態(tài)、大小正常，腎小管排列整齊緊密，內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)基本完整。

圖4 各組小鼠腎臟病理變化 (HE,×100)Fig.4 Pathological changes in kidney of mice in each group (HE,× 100)

3.4 血清代謝組學(xué)的差異性分析

如圖5、6 所示，與生品組比較，醋制組的血清代謝組與對照組更接近，說明商陸醋制后改善了生品導(dǎo)致的代謝紊亂。

圖5 商陸醋制前后的PCA 得分圖Fig.5 PCA score of P.acinosa before and after vinegar preparation

圖6 商陸醋制前后的PLS-DA 得分圖Fig.6 PLS-DA score of P.acinosa before and after vinegar preparation

3.5 血清代謝物鑒定

根據(jù)Progenesis QI 軟件分析結(jié)果，篩選VIP＞1 的代謝物，進一步將篩選的代謝物通過m/z和MS/MS 片段離子與HMDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.HMDB.ca）進行比對，確定潛在的代謝物。共鑒定出50 種潛在代謝物（表3），其中11 種為膽汁酸。

表3 潛在生物代謝標(biāo)記物的識別Table 3 Identification of potential biomarkers

3.6 通路富集分析

使用MetaboAnalyst 5.0 對鑒定的代謝物進行通路富集分析，闡述商陸醋制后調(diào)節(jié)何種代謝通路從而降低肝腎毒性作用，共發(fā)現(xiàn)11 條富集通路，其中初級膽汁酸代謝為最主要的代謝通路（圖7）。

圖7 通路富集分析Fig.7 Pathway enrichment analysis

進一步使用Masslynx 軟件結(jié)合同位素膽酸內(nèi)標(biāo)，對初步鑒定的9 種膽汁酸進行半定量分析，比較各組血清中不同膽汁酸的含量差異，如圖8 所示，部分次級膽汁酸（DCA、LCA）在商陸給藥后含量顯著升高（P＜0.05、0.01），醋制后能夠減少次級膽汁酸的含量。而結(jié)合型膽汁酸（GCDCA、GDCA、TCDCA、TDCA）在生品給藥后含量顯著降低（P＜0.05、0.01），醋制后能夠提高結(jié)合型膽汁酸的含量（P＜0.05、0.01）。但商陸醋制前后初級膽汁酸（CA、CDCA）的含量變化并不顯著，并且醋制前后與對照組比較均無顯著性差異。表明商陸醋制后可以通過減少次級膽汁酸的含量并增高結(jié)合型膽汁酸的含量改善生品誘導(dǎo)的膽汁酸代謝譜的改變，可能是其減毒的作用機制。

圖8 9 種膽汁酸相對含量統(tǒng)計分析 (,n=6)Fig.8 Statistical analysis of relative content of nine bile acids (,n=6)

4 討論

商陸為商陸科植物商陸P.acinosaRoxb.或垂序商陸P.americanaL.的干燥根，味苦、性寒；歸肺、脾、腎、大腸經(jīng)；具有逐水消腫、通利二便的功效[25]。商陸生品有毒，常采用醋制法炮制減毒，目前對商陸醋制減毒的研究主要集中在胃腸道方面，但胃腸道毒性反應(yīng)僅僅是商陸毒性作用的一個方面。文獻報道及課題組前期研究均顯示商陸具有肝腎毒性作用[14-17,26-27]，并發(fā)現(xiàn)商陸主要毒性部位為正丁醇部位[12]，主要毒性成分為皂苷類成分[11]?；诖?，本研究擬通過對商陸醋制前后肝腎毒性的比較并結(jié)合代謝組學(xué)的研究手段探索商陸醋制降低肝腎毒性的作用機制。

通過對醋制前后商陸正丁醇部位成分的分析發(fā)現(xiàn)，6 種皂苷類成分的含量在醋制后顯著降低，推測可能是由于此類成分中的糖苷鍵結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在醋制酸性以及加熱的條件下發(fā)生水解生成苷元導(dǎo)致含量下降，但苷元及皂苷的毒性差異仍需進一步的實驗研究。通過整體動物模型發(fā)現(xiàn)生品商陸會導(dǎo)致ALT、AST、BUN、Scr 等肝腎功能指標(biāo)表達增高，醋制后能夠顯著降低這些指標(biāo)，并呈劑量相關(guān)性。進一步通過肝、腎的組織病理切片證實商陸正丁醇部位會導(dǎo)致肝腎組織損傷，醋制后一方面肝臟炎癥反應(yīng)、脂肪空泡和壞死細胞明顯減少；另一方面腎臟中腎小球形態(tài)接近正常組織、腎小管組織亦恢復(fù)正常，說明醋制確實能夠減緩生品商陸的肝腎毒性作用。為了進一步闡明商陸醋制減毒的作用機制，進一步采用非靶向代謝組學(xué)對各組小鼠血清樣本進行分析。PCA 及PLS-DA 的分析結(jié)果顯示，生品商陸會導(dǎo)致小鼠代謝的紊亂，而醋制后能夠改善代謝紊亂。進一步通過Progenesis QI 軟件篩選VIP 值大于1 的代謝物，結(jié)合HMDB 和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）等公共數(shù)據(jù)庫對代謝物的二級質(zhì)譜圖進行比對，初步篩選鑒定出50 種可能與商陸醋制減毒相關(guān)代謝物。對鑒定出的代謝物進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，10 種代謝途徑可能與商陸醋制減毒相關(guān)，主要涉及初級膽汁酸合成、硫代謝、卟啉和葉綠素、酪氨酸和花生四烯酸的代謝等，而其中最顯著的是初級膽汁酸生物合成代謝通路。

肝臟在膽汁酸代謝中占重要地位，與膽汁酸的合成、分泌、轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)，一些研究顯示膽汁酸的變化可以作為肝損傷的代謝組學(xué)標(biāo)志物，如梔子中京尼平苷可通過調(diào)節(jié)甘膽酸等多種膽汁酸代謝，尤其是初級膽汁酸的生物合成從而誘導(dǎo)肝損傷[23,28]。初級膽汁酸是一種重要的內(nèi)源性代謝物，它們在肝臟中由膽固醇合成，并形成結(jié)合性膽汁酸后經(jīng)由膽管分泌至腸道，在腸道菌群的作用下進一步代謝為次級膽汁酸，在空腸末端或回腸，通過門靜脈系統(tǒng)再回流入肝臟，形成肝腸循環(huán)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸代謝異常可能與商陸醋制減毒相關(guān)，為進一步探索商陸醋制前后如何影響膽汁酸代謝降低肝腎毒性的作用機制，本研究進一步對差異膽汁酸進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)商陸能夠增加血清中去氧膽酸、石膽酸等次級膽汁酸的含量并減少結(jié)合型膽汁酸的含量，醋制后能夠提高結(jié)合型膽汁酸含量并降低次級膽汁酸含量，改善膽汁酸代謝譜的紊亂，說明商陸醋制后可以改善膽汁酸代謝失衡。研究顯示，膽汁酸代謝譜的改變會造成肝臟炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟的損傷，且次級膽汁酸的肝細胞毒性作用明顯強于結(jié)合型膽汁酸[30-31]。另一方面，次級膽汁酸進入腎臟后，也會誘發(fā)腎小管上皮細胞的損傷，導(dǎo)致腎臟功能的受損[32]?；诖?，本研究推測商陸導(dǎo)致的肝腎毒性可能與其導(dǎo)致的膽汁酸代謝紊亂密切相關(guān)，商陸醋制后可能會通過改善膽汁酸代謝失衡從而降低肝腎毒性作用。

此外，酪氨酸代謝及花生四烯酸代謝可能也與商陸醋制減毒相關(guān)[33-34]。酪氨酸代謝通路的產(chǎn)物甲狀腺激素可以導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，進而使肝功能的進一步惡化[35]?；ㄉ南┧崾巧矬w內(nèi)分布最廣泛且具有重要生物活性的一種omega-6 多不飽和脂肪酸[36]?；ㄉ南┧峒捌浯x產(chǎn)物可以影響環(huán)氧化酶P450 途徑，參與各種組織的炎性反應(yīng)，在肝臟功能損傷中具有重要作用[33]。硫代謝及卟啉和葉綠素代謝也是商陸醋制降低肝腎毒性的重要代謝通路。

本研究表明，商陸正丁醇部位可能是其導(dǎo)致肝腎毒性的主要部位，醋制后能夠降低商陸正丁醇部位的肝腎毒性。商陸誘導(dǎo)的肝腎毒性與膽汁酸代謝紊亂相關(guān)，醋制能夠顯著改善膽汁酸代謝紊亂，從而降低肝腎毒性。但本研究也存在一些不足之處，如對膽汁酸代謝失衡缺乏深入的探索，研究顯示膽汁酸代謝特別是結(jié)合型膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸需要腸道菌群參與，因此，本研究推測商陸醋制改善膽汁酸代謝失衡降低肝腎毒性作用可能與腸道菌群紊亂密切相關(guān)。后續(xù)研究中本研究將通過對腸道菌群的研究探索商陸醋制調(diào)節(jié)腸道菌群改善膽汁酸代謝紊亂的具體作用機制，推進商陸醋制減毒作用機制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突