高菲，王煜，杜嘉祥，杜旭光，趙建國，潘登科，吳森，趙要風

遺傳修飾豬模型在生物醫(yī)學及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究進展及應用

高菲1，王煜2，杜嘉祥3，杜旭光1，趙建國2，潘登科4，吳森1，趙要風1

1. 中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193 2. 中國科學院動物研究所，北京 100101 3. 成都中科奧格生物科技有限公司，成都 610000 4. 四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院，臨床免疫轉(zhuǎn)化醫(yī)學四川省重點實驗室，成都 610072

豬在解剖結(jié)構(gòu)、代謝、生理生化等特征方面比嚙齒類動物更接近人類，因此在模擬某些人類疾病以及提供異種移植器官等方面具有其他動物不可替代的優(yōu)勢，是理想的人類疾病動物模型和異種器官的供體。另外，豬作為我國畜牧業(yè)最重要的物種之一，豬的品種改良、疫病防控以及動物福利等問題都與人民生活息息相關(guān)。本文主要介紹了遺傳修飾豬模型在分子育種、人類疾病模型以及異種器官移植領(lǐng)域的研究進展及未來應用前景，希望增進相關(guān)領(lǐng)域研究人員對基因編輯等前沿技術(shù)的了解，理解遺傳修飾豬模型在生命科學研究中的重要意義。

遺傳修飾豬；分子育種；疾病模型；異種器官移植

近年來，動物模型在生命科學以及醫(yī)學研究領(lǐng)域起著十分重要的支撐作用。其中，基因編輯動物模型極大地推動了生命科學領(lǐng)域的發(fā)展。截至目前，科學家們已經(jīng)在小鼠、大鼠、豬、牛、羊等多個物種中成功制備基因編輯動物模型。這些動物模型在探索生命現(xiàn)象的基本規(guī)律、闡明生命活動的內(nèi)在機制、解析人類疾病的發(fā)病機理以及開發(fā)設(shè)計藥物治療靶點等方面發(fā)揮了重要作用。在這些動物模型中，由于豬在解剖學、生理學及遺傳背景、疾病特征、營養(yǎng)代謝等方面相較于嚙齒類動物與人類更相似，因此，豬在人類疾病模型、異種器官移植等生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。此外，豬作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物，其生產(chǎn)性狀的改良、提高抗病力以及優(yōu)良性狀聚合育種均可為畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。在過去20年，美國和歐盟等發(fā)達國家主導的以小鼠模型為基礎(chǔ)的國際小鼠敲除計劃(Knockout Mouse Project, KOMP)[1]、國際基因敲除小鼠聯(lián)盟 (International Mouse Knockout Consortium, IKMC)[2]和國際小鼠表型分析聯(lián)盟(International Mouse Phenotyping Consortium, IMPC)[3]等國際大科學計劃的實施，大大加快了發(fā)達國家在生命科學領(lǐng)域和基礎(chǔ)醫(yī)學領(lǐng)域的進步。在豬模型方面，美國國家豬資源研究中心(National Swine Resource and Research Center, NSRRC)是世界上第一家專門從事遺傳工程豬制備、模式豬遺傳物質(zhì)保存、模式豬病原微生物檢測及凈化的官方機構(gòu)，截至目前保存了60余種基因工程豬品系，成為最大的人類疾病模型豬種質(zhì)資源及信息資源庫(https://nsrrc.missouri.edu/Strain-Avail/)；丹麥Ellegaard哥根廷小型豬公司是世界上著名的實驗用豬商業(yè)品牌，實現(xiàn)了實驗用小型豬質(zhì)量標準化、生產(chǎn)規(guī)?；⒐唐坊?https:// minipigs.dk/products-services/gottingen-minipigs)；我國也是在國家“十二五”期間優(yōu)先規(guī)劃安排模式動物表型與遺傳研究國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，該設(shè)施是世界上第一個將豬和猴定位為模式動物的大科學設(shè)施，其中豬設(shè)施又名“天蓬工程”已于2022年10月試運行。該設(shè)施必將推動相關(guān)領(lǐng)域前沿研究成果的轉(zhuǎn)化應用，為動物育種、人類疾病治療、醫(yī)藥研發(fā)、異種器官移植等領(lǐng)域提供重大平臺支撐。

本文主要綜述了遺傳修飾豬模型在分子育種、人類疾病模型構(gòu)建以及異種器官移植等領(lǐng)域的研究進展及應用前景，以期相關(guān)領(lǐng)域的同行了解并掌握最新研究進展，明晰遺傳修飾豬模型在科學研究領(lǐng)域的重要性，進而推動生命科學領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。

1 遺傳修飾豬在分子育種方向的應用

包括牛、羊和豬在內(nèi)的大動物家畜提供了全世界人類日常生活所必需的動物蛋白和脂肪。在人口增長、城市化和收入增長的共同推動下，全球?qū)游锂a(chǎn)品的需求正在大幅增長，這也消耗了大量的糧食。然而，世界上仍有大約10億人長期營養(yǎng)不良[4]。而全球氣候變化只會加劇動物蛋白生產(chǎn)的缺乏[5]。目前為滿足全球糧食需求所做的諸多努力，也使本已不堪重負的環(huán)境進一步惡化[6,7]。據(jù)聯(lián)合國的預測，到本世紀中葉，世界人口將達到100億。因此，為提高動物生產(chǎn)效率和保障食品安全，培育出具有生長速度快、繁殖能力強、抗病性強、肉質(zhì)好等優(yōu)點的家畜新品種，減少家畜飼養(yǎng)中的糧食消耗，成為廣大育種工作者的奮斗目標。在過去的幾十年中，科學家們往往采用傳統(tǒng)雜交育種對家畜性狀進行遺傳改良，不僅周期長，同時對于抗病等性狀選育不能提供有效的解決方案。近年來，精準分子設(shè)計育種(基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù))的快速發(fā)展為加速家畜的遺傳改良提供了創(chuàng)新性的解決方案，并且在提高生產(chǎn)性能、增強對疾病的抵抗力、減少人畜共患病傳播的威脅以及改善動物福利等方面有很好的概念性的驗證[8～10]。同時，科研人員已經(jīng)利用全基因關(guān)聯(lián)分析和功能基因組學等手段，挖掘出多個與家畜生長和抗病相關(guān)的功能基因，鑒定了大量與家畜經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點，為進一步對家畜基因組進行高效、精確的基因修飾，實現(xiàn)精準分子育種提供了潛在靶點[11]。但這些靶點往往都是候選位點，基因組學分析僅能表明它們和對應優(yōu)異的經(jīng)濟與抗病表型存在關(guān)聯(lián)，但是否為真正的致因位點，仍需要制備靶基因編輯的動物模型進行驗證。雖然在小鼠、大鼠和兔等小動物模型中，

可以對這些候選基因的同源基因位點進行相應的基因修飾，但因物種間差異過大，可能無法模擬出其本應在家畜中出現(xiàn)的表型。隨著基因編輯、受精卵顯微注射和體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)等技術(shù)的迅速發(fā)展，使得牛、羊和豬等大動物模型可以進行高效和精準的遺傳修飾，一方面不僅可以驗證基因組學所挖掘基因位點的可靠性；另一方面，如果基因編輯大動物模型表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)與抗病性狀，更可以直接進行性能測定及繁育，為未來基因編輯家畜新品種的培育奠定基礎(chǔ)(圖1)。然而，目前尚有輿論擔憂，轉(zhuǎn)基因食品會給環(huán)境、食品安全和人類健康帶來新的風險；因此，通過轉(zhuǎn)基因手段進行家畜育種改良及其商業(yè)化應用，后續(xù)還需要經(jīng)過嚴格的政策監(jiān)管，仍有很長的路要走。但基因編輯不同于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，不存在外源基因的引入，目前已有包括基因編輯豬“GalSafe豬”通過美國食品與藥物管理局(FDA)安全審核，準許進入市場，體現(xiàn)出基因編輯育種的巨大價值。2022年1月24日，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評價指南(試行)，規(guī)定了獲得基因編輯作物生物安全證書的程序：對認為不構(gòu)成環(huán)境或食品安全風險的基因編輯作物，開發(fā)人員只需提供實驗室數(shù)據(jù)并進行小規(guī)模田間試驗。2022年，我國“中央一號文件”指出，大力推進種源等農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)，全面實施種業(yè)振興行動方案，推進種業(yè)領(lǐng)域國家重大創(chuàng)新平臺建設(shè)，啟動農(nóng)業(yè)生物育種重大項目。這些國家利好政策，為未來利用基因編輯新技術(shù)進行家畜分子設(shè)計育種，實現(xiàn)品種培育的創(chuàng)新性發(fā)展，創(chuàng)制具有國家自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)異家畜新品種，打贏家畜種業(yè)翻身仗創(chuàng)造了重大機遇。本文聚焦于提高生產(chǎn)性能、提高抗病力以及優(yōu)良性狀聚合3個方面，重點介紹了遺傳修飾豬在分子育種方向的應用。與分子育種相關(guān)的遺傳修飾豬模型詳見表1。

1.1 提高生產(chǎn)性能

家畜肉產(chǎn)品是全世界人類主要的食物來源，所以畜牧業(yè)中重要的育種目標之一是提高家畜的產(chǎn)肉量和瘦肉率。肌肉生長抑制素(myostatin, MSTN)是TGF-β超家族成員之一，對哺乳動物骨骼肌的發(fā)育起負調(diào)控作用，抑制基因的表達可以促進骨骼肌細胞增殖與分化，增多肌纖維數(shù)目，加快肌肉生長，增加瘦肉率[12]。同時，基因在不同的物種中具有保守性。有研究報道牛、綿羊和狗等物種存在基因的天然突變，而這些動物均出現(xiàn)肌肉量顯著增加的“雙肌臀”表型，并且仍然可以正常存活和繁殖[13～15]。因此，基因常常作為家畜分子設(shè)計育種首選的靶標基因，目的是促進畜牧生產(chǎn)中動物肌肉生長，提高肉產(chǎn)量。早在20世紀末，已有研究表明基因敲除小鼠由于肌纖維增生和肥大而使全身骨骼肌重量增加約1倍[16]。我國是豬肉生產(chǎn)和消費大國，除引進國外商品豬種外，同時具有豐富的特色地方豬種質(zhì)資源。2015年，Qian等[17]利用鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)技術(shù)創(chuàng)制出基因編輯梅山豬，并觀察到明顯的“雙肌臀”表型。目前，科研人員已利用ZFNs、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶(transcriptional activator- like effect nucleases, TALENs)和規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)等多種類型的基因編輯技術(shù)，陸續(xù)對多種中國地方豬種和商品豬的基因進行編輯，創(chuàng)制出高瘦肉率的基因敲除豬[18～21]。其中，雖然對商品大白豬第3外顯子進行編輯后出現(xiàn)仔豬出生后存活率低和肢體畸形等問題，但將靶點設(shè)計在第1外顯子后可有效改善危害仔豬生產(chǎn)性能的問題[21,22]。同時，我國地方品種梅山豬和二花臉豬在純合敲除基因后，并沒有出現(xiàn)類似的健康問題?？傮w來說，通過編輯基因以提高家畜生產(chǎn)性能具有可行性。

圖1 大動物模型在分子育種中的應用

首先是與農(nóng)業(yè)大動物生產(chǎn)及抗病性狀關(guān)聯(lián)基因的挖掘與分析，其次是利用基因編輯工具實現(xiàn)靶基因的精準修飾，再次是借助受精卵顯微注射或者體細胞核移植技術(shù)制備遺傳修飾的大動物模型，以期獲得高產(chǎn)肉量、高奶產(chǎn)量且抗病的農(nóng)業(yè)動物新品種。

表1 分子育種相關(guān)的遺傳修飾豬模型

PRRSV: porcine reproductive and respiratory syndrome virus; TGEV: transmissible gastroenteritis virus; CSFV: classical swine fever virus。

豬胰島素樣生長因子2 (insulin-like growth factor 2, IGF2)是一種可以影響細胞增殖與分化的調(diào)控因子，也可以影響骨骼肌生長及脂肪沉積[23]。有研究報道，豬基因第3內(nèi)含子中第3072位存在G→A的突變，可有效避免轉(zhuǎn)錄抑制子的結(jié)合，從而提高基因的表達，提高生長速度[24,25]。這種有利突變廣泛出現(xiàn)在國外商品豬群中，而在中國地方豬種很少被發(fā)現(xiàn)。2018年，Xiang等[26]通過顯微注射Cas9 nickase mRNA和1對sgRNA至豬原核受精卵中，直接刪除基因位點中結(jié)合的序列，提高基因的表達水平，制備出產(chǎn)肉量明顯增加的巴馬香豬，同時證明了對基因非編碼區(qū)進行編輯也可以改善家畜經(jīng)濟性狀。Liu等[27]在豬胎兒成纖維細胞中利用CRISPR/Cas9破壞了ZBED6結(jié)合位點，進一步結(jié)合SCNT技術(shù)獲得了瘦肉率增加的兩廣小花豬。另一個用于改善家畜肉類產(chǎn)量的潛在候選基因是基因，它是F-box蛋白家族成員，為肌肉特異性表達基因[28]。基因存在無義突變的小鼠表現(xiàn)出肌肉肥大的表型[29]。Zou等[30]成功制備基因敲除豬，與野生型對照相比，敲除豬肌肉重量增加約4%。

新生仔豬對寒冷敏感，動物生產(chǎn)中往往需要加裝保溫措施來保證出生仔豬正常存活及生長。解偶聯(lián)蛋白1 (uncoupling protein 1, UCP1)在體脂調(diào)節(jié)及產(chǎn)熱抗寒中發(fā)揮重要作用[31]。家豬自從祖先進化至今，基因已發(fā)生部分缺失而失活，可能是仔豬不耐寒的原因之一。Zheng等[32]利用CRISPR/Cas9介導的非同源重組整合外源片段的策略，將小鼠脂聯(lián)素啟動子及小鼠基因定點插入到豬早已失活的基因座位中，并結(jié)合SCNT技術(shù)創(chuàng)制出定點整合豬，實現(xiàn)在豬成熟白色脂肪細胞的特異性表達。相較于野生型豬，定點整合豬在急性冷刺激條件下的體溫調(diào)節(jié)能力更強，既改善了動物福利，也極大地節(jié)省了畜牧業(yè)的經(jīng)濟損耗；同時也表現(xiàn)出背膘厚度和脂肪率顯著降低，以及瘦肉率顯著提高的優(yōu)異生產(chǎn)性能[32]。

1.2 提高抗病力

動物傳染病給全世界的養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，僅依靠疫苗和藥物治療很難徹底消除疾病。近年來，研究人員利用基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在家畜抗病育種中取得了突破性的進展。

豬繁育與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)會引起母豬發(fā)熱、呼吸困難和流產(chǎn)，同時導致仔豬死亡率高，往往患病豬耳部發(fā)紫，也俗稱“藍耳病”，對養(yǎng)豬業(yè)造成了很大沖擊。豬繁育與呼吸綜合征病毒(PRRS virus, PRRSV)是一類入侵豬肺泡巨噬細胞的RNA病毒，傳染性高、變異快[33,34]。PRRSV在遺傳上主要分為兩種基因亞型，即歐洲亞型(1型PRRSV)和北美亞型(2型PPRSV)，它們在基因組水平上約有60%的核苷酸相似性[35]。高致病性PRRSV (highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)起源于2型PRRSV，比經(jīng)典的PRRSV更具毒性。自2006年以來，HP-PRRSV成為我國主要的流行毒株，進一步加劇了我國生豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟影響[36]。CD163屬于清道夫受體富含半胱氨酸家族(scavenger receptor cysteine-rich, SRCR)成員之一，是巨噬細胞表面的跨膜蛋白，也是PPRSV病原的受體[37]。2014年，Whitworth等[38, 39]利用CRISPR/Cas9結(jié)合豬原核受精卵顯微注射，獲得了基因第7外顯子突變豬，導致CD163蛋白失活，后續(xù)經(jīng)過活體攻毒試驗，突變豬沒有表現(xiàn)出病毒血癥、抗體反應、高燒或任何其他PPRS臨床表征，具有抵抗PRRSV侵染的能力，該研究首次利用基因編輯技術(shù)成功抵御豬病毒性傳染疾病。隨后，科學家們相繼制備出不同類型的基因突變豬[40～45]。其中，在不影響CD163蛋白的其他結(jié)構(gòu)域，僅刪除基因的SRCR5結(jié)構(gòu)域，也獲得了抵抗不同類型PRRSV的基因編輯豬[41～43]。另外，通過使用人源CD163蛋白中的同源結(jié)構(gòu)域替換豬SRCR5結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了嵌合CD163受體克隆豬，也對PRRSV具有抵抗性[44,45]。

冠狀病毒能夠感染人類和動物的呼吸道和腸道，嚴重影響機體健康。2019年末出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)，對人類的身體健康和生命安全產(chǎn)生重大威脅，也對整個世界造成了巨大的經(jīng)濟損失。冠狀病毒也影響畜牧業(yè)的生產(chǎn)，新生仔豬在感染豬傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV)或豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)后，腸細胞被病毒侵染破壞，進而出現(xiàn)吸收不良的腹瀉和脫水等臨床表征，死亡率高達100%。豬氨肽酶N (aminopeptidase N, APN)是一種高效表達在腸上皮細胞膜上的金屬肽酶，被認為是TGEV和PEDV的受體[46]。2019年，科研人員利用CRIPSR/Cas9技術(shù)陸續(xù)制備出敲除豬，經(jīng)過攻毒實驗后，這些敲除豬被證明可以有效抵御TGEV的入侵，但無法抵抗PEDV的感染[47～49]。此外，來自基因敲除豬的豬肺泡巨噬細胞能夠?qū)ωi德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)感染產(chǎn)生抵抗能力，而其肺成纖維細胞樣細胞能夠被高滴度PDCoV感染，表明APN是豬肺泡巨噬細胞中PDCoV的受體，但對于PDCoV感染肺源性成纖維細胞不是必需的[50]。據(jù)報道，和雙基因敲除豬對II型PRRSV和TGEV具有完全抗性，同時對PDCoV的敏感性降低，提供了APN可能是PDCoV受體之一的體內(nèi)證據(jù)[51]。

豬瘟是一種具有致死性的傳染病，引起急性發(fā)熱、死亡，嚴重危害生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，經(jīng)典豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)是一類正鏈RNA病毒，利用RNAi策略可以在體外對其進行干擾[52]。Xie等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在豬基因座位定點敲入shRNA表達元件以靶向敲降CSFV，成功制備抗CSFV的轉(zhuǎn)基因豬，減緩豬瘟的臨床表型。另有報道，Lu等[54]利用CRISPR/Cas9將抗CSFV的shRNA定點整合在豬內(nèi)源miR-17-92簇中進行搭便車式表達，同樣有效抑制CSFV的復制。非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是一類有囊膜的雙鏈DNA病毒，直徑可達200 nm，傳染性極強，致死率近100%[55]。迄今為止，并無有效的商業(yè)化疫苗和治療藥物對ASFV進行防控，只能夠通過加強封閉管理以切斷傳播途徑，是當前世界畜牧業(yè)面臨的一大難題。有研究推測，CD163蛋白的SRCR2結(jié)構(gòu)域是ASFV的潛在受體，但基因敲除豬無法抵御ASFV的感染[56, 57]。隨著科研人員深度、持續(xù)地探究ASFV的細胞感染機制，在未來有望發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的細胞受體，從而借助基因編輯技術(shù)創(chuàng)制抗ASFV豬新品種。

1.3 多基因同時修飾快速聚合多個優(yōu)良性狀

大動物的繁殖周期及世代間隔長，培育具有特定優(yōu)良性狀的家畜是一個緩慢的過程，往往需要很多年。通過基因編輯新技術(shù)同時對多個豬抗病與經(jīng)濟性狀相關(guān)聯(lián)的基因進行高效、精準的編輯，有望滿足育種者對于多種理想優(yōu)良性狀實現(xiàn)快速聚合的迫切需求。Xu等[51]使用CRISPR/Cas9和SCNT技術(shù)獲得了和基因同時敲除豬，并進一步分析了雙基因敲除豬在產(chǎn)肉和繁殖性能較野生型豬沒有差異，但同時具備了抵抗PRRSV和TGEV侵染的能力。Song等[58]利用hA3A-BE3-Y130F堿基編輯器結(jié)合豬原核期受精卵注射，通過一步法獲得了、和三基因同時突變豬，經(jīng)分析三基因編輯豬和表達缺失、表達增加，顯著提高了生長性能和傳染病抵抗能力，對實現(xiàn)家畜分子設(shè)計聚合育種具有理論及實踐意義。

2 遺傳修飾豬在人類疾病模型方向的應用

在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，嚙齒類動物一直是傳統(tǒng)生物醫(yī)學研究中首選的動物模型，然而，嚙齒類動物與人類存在解剖學和生理學上的差異，這也限制了它們的適用性。并且，許多嚙齒類動物模型不能完全模擬人類疾病，例如囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)、帕金森綜合征(Parkinson's disease, PD)和癌癥的小鼠模型等。近年來，豬作為新型的生物醫(yī)學模型的使用顯著增加，豬特別是小型豬(成年體重大約45～50 kg)是最合適的模擬人類疾病的動物模型之一。在自然狀態(tài)下，小型豬在解剖結(jié)構(gòu)以及心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、營養(yǎng)需要和礦物質(zhì)代謝等多項生理生化指標方面與人類更為接近，是非常理想的醫(yī)學實驗動物模型[59～61]。

盡管豬在自然狀態(tài)下是非常理想的醫(yī)學實驗動物模型，但隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，從傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)到新型的核酸酶技術(shù)如ZFNs、TALENs和CRISPRs系統(tǒng)，同時擁有高質(zhì)量豬參考基因組的助力[62]，制備轉(zhuǎn)基因模型、基因敲除/敲入模型、訂制個性化基因修飾豬模型取得了突飛猛進的進展。遺傳修飾豬模型在生物醫(yī)學領(lǐng)域發(fā)揮了極其重要的作用[63]。本文重點介紹了遺傳修飾豬模型在人類疾病模型方向的研究進展及應用前景。

2.1 人類重要疾病相關(guān)的豬模型

2.1.1 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的豬模型

神經(jīng)退行性疾病是由大腦和脊髓中的神經(jīng)元或其髓鞘喪失引起的功能性疾病。最常見的疾病包括AD、亨廷頓舞蹈癥(Huntington’s disease, HD)、PD和ALS。神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的遺傳修飾豬模型詳見表2。AD是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語、視空間功能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，但病因迄今未完全闡明。目前，學術(shù)界存在淀粉樣蛋白假說，該假說提出，在AD患者的大腦內(nèi)，淀粉樣蛋白(amyloid beta protein, Aβ)聚集后形成的寡聚體會形成斑塊，從而導致神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失等[64]。目前，淀粉樣前體蛋白()、早老素1 ()和早老素2 ()被認為是家族性早發(fā)AD的致病基因。2009年，Kragh等[65]構(gòu)建了轉(zhuǎn)人源的AD豬模型。雖然在該豬模型的不同腦區(qū)檢測到轉(zhuǎn)基因的高表達，但在1歲的豬中并未檢測到Aβ水平升高或記憶障礙。2013年，Jakobsen等[66]使用重組酶介導的盒式置換(recombinase-mediated cassette exchange, RMCE)技術(shù)制備了PSEN1突變豬模型，隨后在2016年成功制備了攜帶和PSEN1突變的AD豬[67]。研究發(fā)現(xiàn)，這些豬在10～18個月左右大腦中會積累Aβ-42，但它們?nèi)晕幢憩F(xiàn)出AD的生理特征[67]。使用體細胞核移植技術(shù)將攜帶3個人類基因(K670N/M671L、I716V和V717I)、(P301L)和(M146V和L286P)的多克隆載體注入濟州黑豬，在豬的大腦與其他組織中檢測到轉(zhuǎn)基因的表達，同時也積累了Aβ-40/42蛋白、總Tau蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白[68]。這些AD豬為神經(jīng)治療策略的開發(fā)和臨床前評估提供了十分有價值的模型。

表2 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的遺傳修飾豬模型

暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江團隊、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學團隊和美國埃默里大學李世華團隊通力合作先后培育出世界首例轉(zhuǎn)基因HD豬模型[69]和HD基因精準敲入豬模型[70]，研究發(fā)現(xiàn)，該模型不僅能模擬HD病人在大腦中特異神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征，而且表現(xiàn)出類似HD“舞蹈樣”的異常行為，且這些病理特征及異常行為都可以穩(wěn)定地遺傳給后代[70]。該研究為開發(fā)治療HD新手段提供了可靠的動物模型，同時也方便科學家們繼續(xù)深入了解神經(jīng)細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

中國科學院動物研究所趙建國團隊利用TALENs技術(shù)制備了靶向和的PD模型，結(jié)果顯示DJ-1蛋白被破壞，但小豬在出生后2天內(nèi)死亡[71]。隨后該團隊利用CRISPR技術(shù)制備了靶向、和三基因的突變豬模型，但10月齡仔豬并未表現(xiàn)出行為異常[72]。中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學團隊利用CRISPR成功制備了靶向和的豬模型，同樣攜帶雙基因突變的7月齡仔豬也并未出現(xiàn)PD的典型癥狀[73]。此外，科學家們還制備了攜帶3個錯義突變的基因(E46K、H50Q和G51D)的巴馬小型豬模型，但在3月齡基因編輯仔豬中未出現(xiàn)α-突觸核蛋白免疫陽性病理及SN多巴胺能神經(jīng)元丟失的表征[74]。

ALS是一種逐漸導致全身癱瘓的神經(jīng)退行性疾病，Crociara等[75]制備出攜帶人SOD1的轉(zhuǎn)基因豬，且27月齡轉(zhuǎn)基因豬表現(xiàn)出后肢運動缺陷和運動神經(jīng)元變性，成功模擬了人類的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。

2.1.2 人類遺傳性發(fā)育疾病豬模型

人類遺傳性發(fā)育疾病一般是指由于遺傳物質(zhì)改變或致病基因突變而引起的疾病?？茖W家們陸續(xù)制備了一系列人類遺傳性發(fā)育疾病的遺傳修飾豬模型，詳見表3。

CF是一種常染色體隱性疾病，由調(diào)節(jié)陰離子轉(zhuǎn)運的基因突變引起[87]。臨床數(shù)據(jù)表明，大約70%的CF患者中，的突變是編碼CFTR蛋白的第508位氨基酸(苯丙氨酸)的3個堿基對的缺失。CF的一些癥狀包括腸道粘液阻塞(胎糞性腸梗阻)、胰管阻塞、膽囊凝固和肺部疾病。近年來，有數(shù)十種靶向小鼠基因的突變模型，但并未觀察到典型的CF癥狀[87,88]。然而，在修飾(模擬人類突變——508位苯丙氨酸缺失)的豬模型研究中，仔豬表現(xiàn)出典型的CF癥狀，包括胎糞性腸梗阻、肝臟病變和肺部疾病[76～79]。目前的豬模型正被用于侵入性研究肺部疾病，以期開發(fā)新的治療方法。

表3 人類遺傳性發(fā)育疾病豬模型

杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一種由基因缺失、點突變或重復序列引起的X連鎖遺傳病。該疾病以進行性肌無力、消瘦和肌肉變性為主要特征[89]。科研人員利用基因編輯工具已成功制備出可誘發(fā)肌營養(yǎng)不良的小鼠、大鼠、狗、兔和豬等動物模型，此外還發(fā)現(xiàn)在不同的物種中，其臨床癥狀的嚴重程度隨動物模型體型大小的增加而上升[90]。因此，在DMD的臨床前研究中，豬模型能更好地模擬人類疾病[91]。目前，利用基因編輯和SCNT技術(shù)先后成功制備了缺失外顯子52 (Δ52)的豬模型[80]和精準靶向DMD的27號外顯子的豬模型[81]。這些模型均表現(xiàn)出與人DMD患者相似的癥狀，例如血清肌酸激酶活性升高、肌纖維化和肌營養(yǎng)素丟失和心肌損傷等。然而，這兩個DMD豬模型壽命均較短。2020年，Moretti等[92]發(fā)現(xiàn)，在Δ52豬模型中肌肉注射腺相關(guān)病毒載體誘導表達截斷的肌營養(yǎng)蛋白(Δ51-52)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改善了Δ52豬的骨骼肌功能，同時也在DMD病人來源的誘導多能干細胞模型中驗證了這一方法的有效性，該研究為DMD病人的基因療法提供了參考與借鑒。因此，DMD豬模型在開發(fā)DMD藥物和治療方面具有很大的應用前景。

此外，科學家們還制備了大量與人類發(fā)育相關(guān)的遺傳疾病豬模型，這些模型大多涉及病因明確的人類遺傳病。例如，哈欽森–吉爾福德早衰綜合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HGPS)是一種極其罕見的遺傳性疾病，目前尚無治愈方法。該疾病的特點是過早衰老同時由于心血管并發(fā)癥可導致患者在青春期死亡。大多數(shù)HGPS患者攜帶雜合的c.1824C>T突變。然而在HGPS小鼠模型中被證明有效的治療方法，在開展HGPS治療的臨床試驗中收效甚微。因此，為了克服HGPS小鼠模型的缺陷，Dorado等[82]成功制備了攜帶雜合c.1824C>T突變的HGPS豬模型，HGPS豬模型再現(xiàn)了人類患者的心血管改變，如左室舒張功能障礙、心電活動改變和血管平滑肌細胞丟失等病征。HGPS豬模型將為該疾病候選療法的優(yōu)化提供非常合適的臨床前實驗用動物模型。

遺傳性I型酪氨酸血癥(hereditary tyrosinemia type I, HTI)是由富馬酸乙酰乙酸水解酶(fumarate acetoacetic acid hydrolase, FAH)缺乏引起的，該酶催化酪氨酸代謝的最后一步。嬰兒期表現(xiàn)為嚴重的肝臟受累，如果不治療，通常會導致死亡。Hickey等[93]利用SCNT技術(shù)成功制備了+/?豬模型。隨后，該課題組通過雜交產(chǎn)生第一個?/?豬。因?/?豬在子宮內(nèi)存在致命缺陷，需在妊娠期服用NTBC方可使?/?豬正常出生；然而出生后仍表現(xiàn)出嚴重的肝損傷。?/?豬為未來深入研究HTI和自發(fā)性急性肝衰竭以及肝細胞治療的臨床前試驗提供了一個代謝性肝病的基因工程大動物模型[83]。

苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺陷型即表現(xiàn)為苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)，可導致全身性高苯丙氨酸血癥，進而導致神經(jīng)毒性和嚴重發(fā)育障礙。膳食中苯丙氨酸(Phe)可預防高苯丙氨酸血癥的有害影響，但成人和青少年患者對飲食的依從性較差，導致特征性的神經(jīng)行為表型。因此，迫切需要新的治療方法。截止目前，PKU的嚙齒類動物模型不能充分反映神經(jīng)認知表型，因此Koppes等[84]制備了?/?豬模型。與經(jīng)典的PKU一致，同時伴有幼年生長遲緩、色素減退、腦室擴大、腦灰質(zhì)體積減少[84]。?/?豬為研究病理生理學以及評估新的治療干預措施提供了一個PKU臨床前大動物模型。

血友病B (hemophilia B, HB)是一種X連鎖隱性出血性疾病，由凝血因子IX基因異常引起。如果沒有預防性治療，患者會頻繁的自發(fā)性出血?？茖W家們利用CRISPR/Cas9和SCNT相結(jié)合建立了HB豬模型[85, 86]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在HB豬模型的凝血因子IX位點過表達人類凝血因子IX，可有效緩解HB豬模型的出血癥狀[85]。因此，該研究不僅為探索血友病性的病理過程提供了大動物模型，而且為將來通過原位基因治療永久性糾正血友病提供了可能性。

2.1.3 癌癥模型

豬是研究癌癥的遺傳易感性、疾病進展、分子檢測和藥物治療評價的良好動物模型[94]。基因編輯豬的癌癥模型通常通過靶向DNA的變化來產(chǎn)生，這些變化影響原癌基因、腫瘤抑制基因和DNA修復基因的功能?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展極大地推動了乳腺癌[95]、結(jié)直腸癌[96]、胃癌[97]、肺癌[98]、骨肉瘤[99]等豬模型的制備，詳見表4。這些癌癥模型的特征程度不同。例如，在乳腺癌模型中，小豬在出生后18天內(nèi)死亡[95]；結(jié)腸直腸癌豬模型產(chǎn)生息肉但沒有腫瘤發(fā)生[96]；?/?胃癌豬模型僅建模成功，表型監(jiān)測還在進行中；的雜合敲除豬可導致老年動物自發(fā)骨肉瘤的發(fā)生，而純合敲除可導致7～8月齡豬多發(fā)大型骨肉瘤[99]。

2015年，Schook等[100]制備了一個腫瘤工具豬模型，即Cre誘導的腫瘤抑制因子(TP53)和致癌基因KRAS的豬模型。將編碼Cre的腺病毒注射到這些豬體內(nèi)會導致間質(zhì)源腫瘤的快速發(fā)展。該癌癥豬模型再現(xiàn)了軟組織肉瘤、胰腺癌和肝細胞癌的各種人類癌癥表型，并允許對早期癌癥的檢測進行分析和對腫瘤細胞微環(huán)境信號的研究。Sieren等[101]也成功制備了一種表達人突變的癌癥豬模型TP53，該遺傳修飾的豬模型主要發(fā)展成淋巴瘤和骨源性腫瘤，借助斷層掃描技術(shù)和核磁共振成像等手段可有效監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況，該模型將有助于開發(fā)臨床相關(guān)的非侵入性成像方法，以促進人類癌癥的早期檢測、診斷和治療。此外，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學團隊還成功構(gòu)建了Cre誘導Cas9表達的豬品系，利用該豬品系可實現(xiàn)體內(nèi)基因編輯，同時也可在該豬品系的成纖維細胞中進行單基因和多基因修飾、染色體重排等多種體外基因組編輯。該研究通過遞送Cre重組酶和sgRNAs成功滅活5個抑癌基因(、、、和)，并激活一個癌基因，這也導致了肺腫瘤的快速發(fā)展[98]。這項研究表明，該豬品系可以作為一種強大的工具，可通過時空特異調(diào)節(jié)豬體內(nèi)的基因表達和生物過程，同時簡化了基因編輯模型豬的制備。

表4 人類癌癥相關(guān)的遺傳修飾豬模型

雖然已經(jīng)開發(fā)了許多癌癥模型，但截止目前都還缺乏系統(tǒng)深入的表型監(jiān)測與機制探究，之后還需要更多的努力來生產(chǎn)更多的基因編輯癌癥模型，以更好地模擬人類癌癥表型，并能夠深入探索癌癥發(fā)生發(fā)展的機制，同時用于臨床前藥物測試、開發(fā)創(chuàng)新藥物和生物治療劑等。

2.1.4 人類代謝性疾病豬模型

人類代謝性疾病是由于某個代謝環(huán)節(jié)障礙而引起的疾病，一般受遺傳和環(huán)境因素兩方面的影響。常見的代謝性疾病包括脂肪營養(yǎng)不良、肌肉營養(yǎng)不良、肥胖、糖尿病、代謝性肝病、動脈粥樣硬化(高血脂、高膽固醇)等。與人類代謝性疾病相關(guān)的遺傳修飾豬模型詳見表5。

糖尿病是一種伴有嚴重并發(fā)癥的慢性疾病，目前已成為危害公眾健康的疾病之一。眾多的遺傳修飾豬模型已經(jīng)成功用于糖尿病研究。例如：胰島素基因突變可能導致永久性新生兒糖尿病(per-manent neonatal diabetes mellitus, PNDM)，INS轉(zhuǎn)基因豬在出生后不久血糖升高，隨后出現(xiàn)體重下降、空腹胰島素水平下降以及β細胞分泌胰島素顯著減少等糖尿病表型[102]；基因敲除仔豬表現(xiàn)出典型的糖尿病癥，如血糖水平較高，且在尿液中檢測到葡萄糖，這些仔豬的胰腺中沒有胰島素的表達[103]，該模型可用于糖尿病的治療研究，用于測試新藥的有效性和安全性，并為胰島移植研究提供最佳移植受體；轉(zhuǎn)基因克隆豬在口服葡萄糖耐量試驗中也顯示葡萄糖負荷后血糖水平顯著升高，進一步分析發(fā)現(xiàn)克隆豬的胰島較小且形狀不規(guī)則，且檢測到胰島素分泌不足，可作為3型成熟型青年糖尿病的豬模型[104]；葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide, GIP)的促胰島素作用在2型糖尿病中受損，研究人員利用胰島中表達GIP受體(GIPRdn)的轉(zhuǎn)基因豬模型證明了GIP在胰島素分泌、β細胞增殖中的重要作用[105]；胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide, IAPP)的形成可影響正常的糖脂代謝，而成熟的人類IAPP蛋白(human islet amyloid polypeptide, hIAPP)具有很強的錯折疊傾向，被認為是胰島淀粉樣變的主要原因之一，hIAPP的沉積則被認為是2型糖尿病的主要原因之一。Zou等[106]利用CRISPR成功制備了基因人源化小型豬，豬可用于進一步研究2型糖尿病的發(fā)病機制和相關(guān)并發(fā)癥的研究；此外，Kong等[107]利用組織特異多順反子系統(tǒng)制備了表達、和的轉(zhuǎn)基因豬，為有效模擬多基因代謝疾病提供了新的豬模型。

表5 人類代謝性疾病相關(guān)的遺傳修飾豬模型

Zhang等[108]利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建了靶向敲入3個人源的疾病風險基因(、和)的代謝性轉(zhuǎn)基因豬模型。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該豬模型與人類代謝疾病高度一致，通過短期飲食干預，該模型表現(xiàn)出2型糖尿病的早期癥狀，包括糖耐量異常、胰腺脂質(zhì)浸潤、胰島肥大、肝小葉炎癥和脂肪組織炎癥等[108]。為代謝性疾病的臨床研究提供了一個有價值的大動物模型。

高甘油三酯血癥被認為是冠心病的獨立危險因素，其中載脂蛋白ApoCIII與血漿甘油三酸酯水平密切相關(guān)，因此被認為是主要的促成因素之一。雖然轉(zhuǎn)基因小鼠已被用于研究高甘油三酯血癥的動物模型，但小鼠的脂蛋白代謝特征與人類有很大差異。Wei等[109]通過核移植制備了表達人的轉(zhuǎn)基因小型豬；進一步分析顯示，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比，轉(zhuǎn)基因豬在飼喂日糧時血漿甘油三酯水平顯著升高且血漿甘油三酯清除明顯延遲，肝素后血漿中脂蛋白脂肪酶活性顯著降低?？傊摳吒视腿パY轉(zhuǎn)基因小型豬模型，對于研究與動脈粥樣硬化疾病相關(guān)的高脂血癥具有重要價值。此外有研究表明，基因中的D374Y功能獲得突變可導致嚴重的常染色體顯性高膽固醇血癥，并加速人類動脈粥樣硬化[110]。因此，Al-Mashhadi等[110]制備了肝臟特異性表達人D374Y的豬模型，D374Y-轉(zhuǎn)基因豬顯示肝臟低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)受體水平降低，LDL清除受損，嚴重高膽固醇血癥，同時可以通過無創(chuàng)成像可視化的觀察動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展過程。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因編輯小型豬被用于動脈粥樣硬化等人類心血管疾病的研究?？茖W家們先后制備了載脂蛋白E (apolipo-protein E,)敲除[111]、低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,)敲除[112]以及和雙敲除的豬模型[113]。其中，?/?豬飼喂正常日糧時，豬的血漿膽固醇水平適度升高，但在喂食高脂高膽固醇(high fat and high cholesterol, HFHC)飲食6個月后，豬的主動脈和冠狀動脈出現(xiàn)嚴重的高膽固醇血癥，并自發(fā)形成似人類動脈粥樣硬化病變；在敲除的豬模型中，當喂食標準的豬飼料(低脂、無膽固醇)時，+/–豬的總膽固醇(total cholesterol, TC)和LDL呈現(xiàn)中度但持續(xù)的增加，而?/?豬的TC和LDL水平顯著升高。?/?豬的嚴重高膽固醇血癥導致冠狀動脈和腹主動脈的動脈粥樣硬化病變，類似于人類動脈粥樣硬化。當喂食含有天然脂肪和膽固醇來源的食物時，這些表型更加嚴重，并在更短的時間內(nèi)形成[112]；和雙等位基因敲除豬基因修飾仔豬的血清生化分析表明，低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol, LDL-C)、TC和載脂蛋白B (apolipoprotein B, APOB)水平顯著升高[113]。在小腸中高度表達，并在飲食膽固醇吸收和膽汁膽固醇再吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用，敲除豬模型可用于膽固醇吸收方面的研究[114]。綜上所述，這幾個小型豬模型對家族性高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化等人類心血管疾病的研究具有重要價值。

2.2 人類疾病豬模型研究瓶頸

豬在解剖結(jié)構(gòu)、代謝、生理生化等特征方面比小鼠更接近于人類，因此在作為人類發(fā)育與代謝疾病模型方面具有其他動物不可替代的優(yōu)勢。然而區(qū)別于以小鼠模型為基礎(chǔ)的IKMC和IMPC計劃，豬模型由于在資金、技術(shù)以及管理上的特殊性，關(guān)于規(guī)模化制備豬模型的計劃在國際上遲遲未能開展，科研人員至今只是零星的、有針對性地對特異基因進行探索性地嘗試，不夠系統(tǒng)，缺乏規(guī)劃，資源整合度不高。其主要瓶頸在于規(guī)模化制備突變豬模型技術(shù)的缺乏。最近，中國農(nóng)業(yè)大學吳森團隊創(chuàng)建了不依賴于同源重組的靶向性基因捕獲系統(tǒng)HIT- trapping[115]，以及哺乳動物全基因組PB-CRISPR文庫[116]，可實現(xiàn)高效率、規(guī)?；幕蚓庉?，可為模式豬的規(guī)?；苽涮峁┬碌募夹g(shù)工具。此外，還存在重要疾病模型豬數(shù)量少且缺乏系統(tǒng)深入的追蹤研究。因此，未來需要針對某一類疾病利用規(guī)模化編輯手段制備相應的疾病模型豬，從而進行系統(tǒng)化研究。

3 遺傳修飾豬在異種器官移植方向的應用

3.1 推進異種器官移植研究能夠有效解決器官移植供需矛盾的突出問題

器官移植是治療終末期器官功能衰竭的最有效途徑，我國器官移植經(jīng)歷了從無到有，從探索到成功，歷經(jīng)半個多世紀幾代人的努力，成為世界第二大器官移植的國家。但器官資源短缺是一個世界性難題，美國每年等待器官移植患者達到11萬例，完成移植的有3萬例，供求比接近1∶4。我國每年約有30萬名患者需要器官移植，但每年器官移植手術(shù)僅1.8萬例左右，供需比接近1∶17[117]。器官來源短缺已成為亟待解決的社會問題，異種器官移植可能是解決這一難題的重要途徑[118]。

異種移植作為器官移植領(lǐng)域的技術(shù)高地，將其研究轉(zhuǎn)化為臨床應用將有不可估量的社會經(jīng)濟效益。美國、德國等歐美國家在此領(lǐng)域的研究成果層出不窮，德國和歐盟政府已投巨資進行了相關(guān)研究，力求搶占該領(lǐng)域的制高點。中國的異種器官移植研究較晚，但近10年來發(fā)展很快，國家和地方先后立項10余項，特別是供體豬制備方面與國外差距很小。

3.2 推進異種器官移植研究是占領(lǐng)前沿醫(yī)療科技制高點的重要機會

1905年法國第一例異種腎移植取得成功，1964年異種腎移植臨床實驗取得成功，1966年美國首次異種移植臨床試驗取得成功[119]，2002年(α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，α-1,3-galactosyltransferase)基因敲除豬(GTKO)的出現(xiàn)更是進一步促進了異種移植供體豬的研究[120]。2019年10月，美國哈佛醫(yī)學院麻省總醫(yī)院團隊成功將基因工程改造的豬皮膚用于人類燒傷傷口的覆蓋。這是第一例由美國FDA批準的非人類器官移植臨床試驗，也是首次成功將基因編輯的動物組織直接移植到人類傷口上的嘗試。

2020年1月2日，雜志將異種移植進入人體臨床實驗列入年度展望的十大科學頭條，同年12月美國食品和藥物管理局(FDA)批準了美國聯(lián)合治療公司(United Therapeutics Corporation)的子公司Revivicor研發(fā)的GalSafe (去除α-gal糖蛋白)豬在食用和醫(yī)學上的雙用途。2021年9～12月，美國紐約大學朗格尼醫(yī)學中心先后將GalSafe豬腎臟移植到腦死亡患者身上，豬腎與受者腿部血管連接并保持在體外，在移植后觀察了54個小時，結(jié)果顯示：豬腎臟移植后立即開始工作，產(chǎn)生尿液和代謝廢物，期間第6、24、48和54小時的豬腎臟活檢未發(fā)現(xiàn)超急性排斥反應或抗體介導的排斥反應跡象[121]。2021年9月，美國阿拉巴馬大學團隊將一只10基因修飾(敲除豬的3種抗原基因和生長激素受體，表達兩種補體調(diào)節(jié)蛋白、兩種凝血調(diào)節(jié)蛋白及兩種免疫調(diào)節(jié)基因)豬的腎臟移植到腦死亡患者身上，術(shù)后觀察74個小時，未發(fā)生超急性排斥反應[122]。2022年6～7月，美國紐約大學朗格尼醫(yī)學中心繼腎臟移植之后，開展了兩例豬心臟向腦死亡患者的移植實驗[121]。

美國馬里蘭大學醫(yī)學院在獲取FDA的緊急授權(quán)后，2022年1月7日成功將10基因修飾豬的心臟移植到一名57歲男性心衰患者體內(nèi)，術(shù)后42天內(nèi)未觀察到排斥現(xiàn)象，表明經(jīng)基因編輯后的動物心臟可以在人體內(nèi)發(fā)揮作用且不會立即被排斥。令人遺憾的是，在術(shù)后第43天和術(shù)后第50天都注射了免疫球蛋白用于預防潛在的感染風險，隨后出現(xiàn)病情惡化，患者在第59天時去世。另外值得關(guān)注的是，豬巨細胞病毒(pig cytomegalovirus, PCMV)也可能是這次移植案例中引起失敗的重要原因。但這一里程碑式的科學事件，為異種器官移植的未來帶來了希望，再次推動了異種移植進入臨床研究[121]。

3.3 豬做為異種器官移植供體的主要優(yōu)勢和研究現(xiàn)狀

自20世紀90年代開始，豬被公認為是最佳的異種器官移植供體來源，豬的主要生理指標與人存在許多相似之處。國內(nèi)外研究表明，豬的心率、血壓、腎臟大小和腎小球濾過率、內(nèi)生肌酐清除率等主要生理指標都與人接近或一致，且與靈長類動物模型相比，具有繁殖快、基因修飾難度相對較低等優(yōu)點[123]。豬到非人靈長類動物(non-human primates, NHP)的移植模型被引入異種移植基礎(chǔ)研究多年，其腎臟、心臟在非人靈長類體內(nèi)已經(jīng)能夠長期存活，腎臟移植最長達到557天，原位心臟移植195天，異位心臟移植945天[124, 125]。

由于人和豬之間在進化上的巨大差異，直接進行豬到人的器官移植會產(chǎn)生強烈的免疫排斥反應，導致移植失敗。因此，進行異種移植前需要對供體豬進行基因改造，具體信息如圖2所示?；蚋脑煲环矫嫘枰档鸵浦参锏拿庖咴?，減少移植后的免疫排斥反應；另一方面需要增強豬器官/組織/細胞對人補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的兼容性[117,126]。

3.3.1 敲除豬基因，消除α-Gal引起的超急性排斥

豬血管內(nèi)皮等細胞表達的1,3-α-Gal糖鏈不存在于人類，可被人體內(nèi)天然的抗α-Gal抗體識別而產(chǎn)生超急性免疫排斥反應(hyperacute rejection, HAR)。在基因工程技術(shù)尚未應用的早期，人們就利用多種方法中和抗Gal抗體以消除超急性排斥反應。Phelps等[127]和Lai等[128]相繼完成了敲除豬基因，為消除Gal糖鏈引起的超急性免疫排斥反應做出了卓越的貢獻。

3.3.2 敲除豬和基因，消除Sda和Neu5Gc引起的排斥反應

基因敲除基本解決了異種器官移植超急性排斥反應，然而人們在采用失活后的豬器官進行異種器官移植仍然會出現(xiàn)抗體的沉積、補體的激活和微血管血栓的形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，豬的細胞表面還存在多種抗原，包括豬Sda血型抗原和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid, Neu5Gc)。豬Sda抗原是由豬的一種β-1,4-N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-N-acetyl-galactosa-minyltrans-ferase 2, B4GalNT2)催化合成[129]。Neu5Gc抗原是由單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH)催化生成的一種唾液酸[130]。Sda血型抗原和Neu5Gc蛋白是重要的non-Gal抗原，這兩個基因的敲除進一步降低了豬對人異種抗體的結(jié)合[131]。

圖2 異種移植供體豬的基因改造

異種移植主要面臨異種抗原、補體/凝血系統(tǒng)不兼容和細胞性排斥的問題。針對這三大問題，用于異種移植的遺傳修飾豬模型主要從三大異種抗原敲除、轉(zhuǎn)入補體調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)入凝血調(diào)節(jié)蛋白和抑制細胞性排斥4個方面進行基因改造。

3.3.3 在豬體內(nèi)表達人補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD46抑制補體激活

除上述3大異種抗原外，豬細胞表面還存在著一些異種抗原，會被其他滴度較低的抗體識別，引發(fā)補體介導的體液性排斥。補體調(diào)節(jié)蛋白是一類可以保護組織細胞免受自身補體系統(tǒng)攻擊的調(diào)節(jié)蛋白。通過在豬血管內(nèi)皮等細胞表面表達人源的補體調(diào)節(jié)蛋白，可以較好的抑制人的補體系統(tǒng)對移植物的殺傷[132]。CD46能夠在經(jīng)典和旁路兩條途徑中同時發(fā)揮調(diào)控補體激活的功能，通過裂解補體C3、C4來減少補體的結(jié)合[133]；CD55能夠競爭性結(jié)合補體C4，減少經(jīng)典途徑下C3轉(zhuǎn)化酶的生成，從而抑制了攻膜復合物的形成[134]。

3.3.4 在豬體內(nèi)表達人THBD、EPCR、TFPI和CD39增強凝血系統(tǒng)的兼容性

異種移植在解決了超急性排斥、補體介導的細胞毒作用之后，還面臨著移植物廣泛的微血管血栓和移植受體的凝血紊亂問題，凝血紊亂涉及抗體、補體、固有免疫細胞以及血小板等多種因素的相互作用[135]。豬的組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitors, TFPI)不能有效抑制人因子Xa和VIIa/TF(組織因子)復合物以防止凝血酶形成[136]。同樣，豬血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin, THBD)不能與人凝血酶相結(jié)合，無法活化抗血栓的蛋白C (activity protein C, APC)。除此之外，豬CD39在內(nèi)皮細胞活化后會失活，其表達不足以抑制人血小板聚集[137]。其中THBD及內(nèi)皮細胞蛋白C受體 (endothelial cell protein C receptor, EPCR)在豬到猴的異種心臟移植實驗中，使受體猴長期存活狀況得到明顯改善[135]。

3.3.5 在豬體內(nèi)表達人、基因，減少細胞性排斥

CD47蛋白在體內(nèi)的各類細胞上廣泛性表達，能夠與髓系細胞(特別是巨噬細胞)表面受體SIPAα (signal regulatory protein-α)相互識別，區(qū)分自我和非我的細胞，而豬CD47蛋白不能與人SIPAα受體相互識別，會導致巨噬細胞引發(fā)的細胞性排斥反應，這在異種移植中較為明顯[138]。NK細胞能夠識別自身的MHCI類分子而被抑制，人白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)與豬白細胞抗原(Swine leukocyte antigen, SLA)存在差異，在轉(zhuǎn)入基因后能夠減少來自NK細胞造成的損傷[139]。

3.4 提高供體豬的生物安全和優(yōu)化基因改造

近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)在分子生物學領(lǐng)域得到廣泛應用，成功實現(xiàn)了多基因同時敲除、依賴于CRISPR/Cas9的外源基因定點敲入等，配合日益成熟的克隆豬制備技術(shù)，使多基因修飾豬的改造速度駛?cè)肟燔嚨?，在一頭豬中實現(xiàn)多基因的同時修飾成為可能。美國Revivicor、eGenesis公司先后宣布獲得10基因(4KO·6TG)、13基因(PERVKO·3KO·9TG)異種移植供體豬。

同時，異種移植面臨生物安全問題。生物安全問題主要是指種間交叉感染的風險，例如病原傳播、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等，因為未經(jīng)凈化的豬只可能會攜帶導致人類感染的病原體，包括彎曲桿菌、傷寒沙門氏菌等細菌，也包括圓環(huán)病毒、豬巨細胞病毒、豬逆轉(zhuǎn)錄病毒等。針對移植器官的病原體感染風險，目前可以通過建設(shè)屏障環(huán)境，結(jié)合剖腹產(chǎn)手術(shù)培育無特定病原體(designated pathogen free, DPF)的異種移植供體豬。2017年美國哈佛大學楊璐菡團隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)完成了豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)相關(guān)基因的敲除，去除了豬內(nèi)源性病毒感染風險，同時證明：攜帶內(nèi)源性病毒的豬不會將病毒傳染給胚胎，無內(nèi)源性病毒感染的小豬在生長過程中也不會重新被PERV病毒感染，人內(nèi)源性病毒逆轉(zhuǎn)錄酶也不能引起豬內(nèi)源性病毒的繼續(xù)復制[140]。但PERV敲除的必要性、對人的感染性以及對豬基因組的破壞等方面仍存在較多爭議，美國FDA未將其列入必需范圍，供體豬無PERV-C亞型即可。目前完成的數(shù)例豬到人心臟、腎臟移植實驗中也均未采用PERVKO豬，但會進行病原體和PERV的感染監(jiān)測[122]。

此外，在供體豬的外源基因表達和移植手術(shù)免疫抑制劑方案上，也進行了更多深入的研究。臨床醫(yī)生的觀點似乎更傾向于選擇并不是那么復雜的基因型，但所挑選的每個基因要具備很好的保護效果。美國哈佛醫(yī)學院David K.C Cooper教授在2021年9月召開的異種移植大會上也提出：改造的基因數(shù)量并非越多越好，基因表達量也應處于合適的范圍內(nèi)[141]。這對供體豬的改造策略提出了更高的要求。非臨床免疫制劑Anti-CD40 mAb在豬到猴的異種移植實驗中被證實具有針對性的保護效果，開發(fā)適用于異種移植的免疫抑制劑也是需要解決的問題[133]。

3.5 異種移植研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)

雖然異種器官移植的技術(shù)難題相繼被攻破，但在未來仍存在倫理、監(jiān)管等諸多障礙。當下異種器官移植正處于風口浪尖，科技的每一次重大進步必然會對倫理道德提出更高的要求，而倫理道德的高標準又指引科學技術(shù)朝著正確方向邁進，但最終目的都是為人類健康服務。

4 結(jié)語與展望

豬在解剖學尺寸和結(jié)構(gòu)、生理學、免疫學以及基因組等方面與人類具有很高的相似性，因此豬作為大型模式動物在人類生物醫(yī)學研究中相比嚙齒類動物更受歡迎。此外，得益于基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，在分子育種、人類疾病構(gòu)建以及異種器官移植領(lǐng)域的豬模型相關(guān)科研成果不斷涌現(xiàn)。

近年來，中國農(nóng)業(yè)大學、中國科學院動物研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、四川省人民醫(yī)院等多家科研院所系統(tǒng)開展了基因修飾豬模型方面的研究，建立了具有國際領(lǐng)先地位的豬模型研究平臺，在分子育種、人類疾病模型構(gòu)建以及異種器官移植方面取得了一系列原創(chuàng)性成果。此外，由中國農(nóng)業(yè)大學主導的豬表型與遺傳研究設(shè)施將建設(shè)成為集培育、表型與遺傳分析于一體的可以對豬進行全尺度、多方位研究的大型綜合研究設(shè)施。該設(shè)施也將成為世界上第一個實現(xiàn)將豬做成模式動物功能的大型綜合研究設(shè)施，這是在我國乃至國際上的一個創(chuàng)舉性的工作。大設(shè)施致力于解決表型和基因遺傳機制中的核心生命科學問題，在心血管疾病、代謝性疾病、醫(yī)藥健康、器官移植等多方面進行戰(zhàn)略重大布局，并積極推動畜牧業(yè)健康快速發(fā)展，建立在國際種業(yè)競爭中的優(yōu)勢地位。該設(shè)施的建設(shè)必將確立我國在國際上以豬為模式動物開展生命科學研究的領(lǐng)先地位，推動相關(guān)領(lǐng)域前沿技術(shù)研究成果的轉(zhuǎn)化應用，為人類疾病治療、醫(yī)藥研發(fā)、異種器官移植、動物育種等領(lǐng)域提供重大平臺支撐。

綜上所述，基因編輯的大動物豬模型將是未來研究人類生命活動規(guī)律的重要參考，也是突破傳統(tǒng)模式動物研究瓶頸的新途徑和新希望。結(jié)合迅猛發(fā)展的基因編輯技術(shù)，建立一批具有自主知識產(chǎn)權(quán)、在生物醫(yī)學及新藥研發(fā)等領(lǐng)域有重要價值的人類重大疾病小型豬模型，對了解基因功能、闡明相關(guān)疾病發(fā)病機理、尋找疾病早期分子標志、研究新的治療方法、驗證新的藥物靶標和開發(fā)新藥具有重要意義，從而提升我國相關(guān)研究領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的競爭力。同時，智能分子設(shè)計育種符合我國現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的需求，對進一步加快養(yǎng)殖園區(qū)建設(shè)，加強品種改良和疫病防控，提升質(zhì)量效益，盡快形成一批優(yōu)質(zhì)畜牧產(chǎn)品生產(chǎn)供應基地，推動全國現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的意義。

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Advances and applications of genetically modified pig models in biomedical and agricultural field

Fei Gao1, Yu Wang2, Jiaxiang Du3, Xuguang Du1, Jianguo Zhao2, Dengke Pan4, Sen Wu1, Yaofeng Zhao1

Compared with rodents, pigs are closer to humans in terms of anatomy, metabolism and physiology, so they are ideal animal models of human diseases and xenotransplantation donors. In addition, as one of the most important livestock in China, pigs are closely related to our lives in terms of breeding improvement, disease prevention and animal welfare. In this review, we mainly summarize the research progress and future application of genetically modified pig models in the fields of xenotransplantation, molecular breeding and human disease models. We wish to take this opportunity to raise the awareness of researchers in related fields on cutting-edge technologies such as gene editing and understand the significance of genetically modified pig models in life science research.

genetically modified pig models; molecular breeding; disease models; xenotransplantation

趙要風，教授，博士生導師，國家杰出青年科學基金獲得者，科技部重點領(lǐng)域創(chuàng)新團隊負責人，“萬人計劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才入選者，國家“模式動物(豬)表型與遺傳研究設(shè)施”副首席科學家。目前擔任中國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學會動物生物技術(shù)分會理事長，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室主任。先后承擔863計劃、973計劃、轉(zhuǎn)基因重大專項、國家自然科學基金等國家級項目10余項。趙要風課題組主要研究方向為動物免疫遺傳學。近5年圍繞家養(yǎng)動物重要免疫相關(guān)基因開展了一系列研究工作：建立了豬口蹄疫、藍耳病等病毒性疾病抗病基因高通量篩選平臺，為通過基因編輯進行分子抗病育種奠定了基礎(chǔ)；深入研究了家養(yǎng)動物免疫球蛋白(抗體)和其他重要免疫基因的表達和轉(zhuǎn)運機制，探討了這些基因在疾病抗性中的可能功能；建立了動物納米抗體及家養(yǎng)動物單克隆抗體創(chuàng)制平臺，深入研究了抗體在家養(yǎng)動物疾病防控中的可能途徑。相關(guān)研究成果發(fā)表在、、等期刊上。

2022-10-08;

2022-11-26;

2022-12-28

國家重點研發(fā)計劃(編號：2021YFA0805900)和海南省崖州灣種子實驗室“揭榜掛帥”項目(編號：B21HJ0103)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2021YFA0805900) and Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory (No. B21HJ0103)]

高菲，博士，工程師，研究方向：畜禽干細胞與胚胎工程。E-mail: gaofei2020019@cau.edu.cn

王煜，在讀博士研究生，研究方向：大動物遺傳修飾。E-mail: wangyu950306@163.com

杜嘉祥，碩士，研究方向：異種器官移植。E-mail: jxdu@clonorgan.com

高菲、王煜和杜嘉祥并列第一作者。

杜旭光，博士，副教授，研究方向：動物克隆與基因組編輯。E-mail: xuguangdu@cau.edu.cn

趙建國，博士，研究員，研究方向：豬基因編輯與功能基因組。E-mail: zhaojg@ioz.ac.cn

潘登科，博士，研究員，研究方向：異種器官移植。E-mail: pandengke2002@163.com

吳森，博士，教授，研究方向：畜禽基因編輯技術(shù)開發(fā)及應用。E-mail: swu@cau.edu.cn

趙要風，博士，教授，研究方向：豬基因編輯基礎(chǔ)及應用。E-mail: yaofengzhao@cau.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-313

(責任編委: 李明洲)