曹 朗，王艷新，賈冠美

（保定市第二中心醫(yī)院眼科，河北 保定 072750）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病高發(fā)眼部并發(fā)癥，隨著病情加重患者視力逐漸降低，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)黃斑區(qū)牽引性視網(wǎng)膜脫落，導(dǎo)致失明[1]。DR 病理過程復(fù)雜，目前認(rèn)為長(zhǎng)期慢性高血糖是其重要的發(fā)病基礎(chǔ)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）是視神經(jīng)的主要構(gòu)成成分，在高糖刺激下將發(fā)生氧化損傷與過度凋亡，引發(fā)DR[2]。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗炎、抗輻射、增強(qiáng)免疫力、助造血及抗腫瘤等藥理活性，近年來在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中的作用逐漸受到關(guān)注。研究[3]認(rèn)為，當(dāng)歸多糖可通過降低糖尿病腎病大鼠血糖及腎組織中炎性指標(biāo)延緩病情發(fā)生。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA 分子，在進(jìn)化中具有高度保守性，且在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡中起到重要作用。研究[4]顯示，不同濃度梯度的高葡萄糖處理可降低人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-148a-3p 水平，其過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和細(xì)胞凋亡減少，表明其或可作為DR 診斷或治療的潛在靶點(diǎn)。本研究采用高糖誘導(dǎo)RGC 細(xì)胞株RGC-5，建立RGC-5 損傷模型，觀察當(dāng)歸多糖對(duì)其氧化應(yīng)激損傷及凋亡的影響，以及miR-148a-3p 在該過程中的作用，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 大鼠RGC 細(xì)胞株RGC-5，購自上海復(fù)旦細(xì)胞中心。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 當(dāng)歸多糖，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；陰性對(duì)照載體miR-NC、miR-148a-3p 過表達(dá)載體miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p 低表達(dá)載體miR-148a-3p inhibitor，上海雅吉生物科技有限公司合成；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，舜冉（上海）生物科技有限公司；兔抗大鼠B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗，美國Abcam 公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒，上海欽誠生物科技有限公司。

DxFLEX 流式細(xì)胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；qRT-PCR 儀，美國ABI 公司；CheniDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國Bio-rad 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) RGC-5 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下（37℃，5%CO2）培育，每3 天傳代培養(yǎng)1 次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組 取對(duì)數(shù)期RGC-5 細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)接種至24 孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖+低劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當(dāng)歸多糖100 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖+中劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當(dāng)歸多糖200 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖+高劑量組（含葡萄糖30 mmol/L 與當(dāng)歸多糖400 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)）[5]。培養(yǎng)48 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞SOD 活性及MDA 水平 收集培養(yǎng)48 h 后的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，冷凍保存?zhèn)溆?。采用SOD 及MDA 試劑盒檢測(cè)上清液中SOD 活性及MDA 水平。

1.6 AnnexinV/PITC 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集培養(yǎng)48 h 后的各組細(xì)胞，PBS 溶液洗滌，棄上清，取100 μL 細(xì)胞懸液（每毫升1×106個(gè)）接種至6 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心，PBS 洗滌，棄上清，與Anexin V-FITC 染液5 μL、PI 染液10 μL 混合均勻，避光孵育20 min，加入binding buff er 200 μL 標(biāo)記液洗滌2 次，60 min 內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡情況，Cell Quest TMD Analysis 軟件分析凋亡率。

1.7 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量收集培養(yǎng)48 h 后的各組細(xì)胞，PBS 溶液洗滌，移至離心管，RIPA 裂解液裂解，離心15 min，BCA 試劑盒測(cè)定并定量總蛋白。取待測(cè)蛋白50 μg，與4 倍上樣緩沖液混合，沸水浴變性，離心取上清，恒壓下電泳分離、轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠Bax、Bcl-2 一抗（1:500），4 ℃冷藏過夜，TBST 清洗，加入二抗（1:2 000），搖床孵育2 h，TBST 清洗，ECL液發(fā)光，暗室顯影，成像分析儀分析，以Bax、Bcl-2蛋白與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值代表蛋白表達(dá)量。

1.8 qRT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞miR-148a-3p 表達(dá)量 收集培養(yǎng)48 h 后的各組細(xì)胞，PBS 溶液洗滌，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，根據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系：雙倍核酸染料12 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 1 μL，加dd H2O 補(bǔ)充至總體積20 μL。擴(kuò)增條件：92 ℃預(yù)變性4 min；92 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為管家基因，2-△△Ct為目的基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取CT平均值。以U6為內(nèi)參基因，檢測(cè)miR-148a-3p 表達(dá)，2-△△Ct法分析并計(jì)算相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所用引物：miR-148a-3p Forward primer，5’-ACTGTGTCATGCACGCGTCAGTGG-3’；Reverse primer，5’-CGTACGCGTGCACCGCCTTGTGTA-3’；U6 Forward primer，5’-TACACAACAGTGCACACACC GTGC-3’；Reverse primer，5’-AAACTGTGCACGGTT CTGTCACGC-3’。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)期RGC-5 細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)接種至24 孔板中。將細(xì)胞分為高糖+miR-NC 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照LipofectamineTM3000 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照載體miR-NC）、高糖+miR-148a-3p mimics 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 過表達(dá)載體miR-148a-3p mimics）、高糖+miR-148a-3p inhibitor 組（含葡萄糖30 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 低表達(dá)載體miR-148a-3p inhibitor）、高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p mimics 組（含葡萄糖30 mmol/L 與當(dāng)歸多糖400 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 過表達(dá)載體miR-148a-3p mimics）、高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組（含葡萄糖30 mmol/L 與當(dāng)歸多糖400 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 低表達(dá)載體miR-148a-3p inhibitor）。轉(zhuǎn)染48 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 qRT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞miR-148a-3p 表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，操作同1.8，檢測(cè)細(xì)胞miR-148a-3p 表達(dá)量。

1.11 檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷及凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，操作同1.5、1.6、1.7，檢測(cè)細(xì)胞SOD 活性及MDA 水平，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，以單因素方差分析比較多樣本資料，兩兩樣本資料比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷的影響 與對(duì)照組比較，高糖組SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組SOD活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

表1 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.2 當(dāng)歸多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 凋亡率的影響 與對(duì)照組比較，高糖組凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組凋亡率降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組凋亡率比較（ ） %

表2 各組凋亡率比較（ ） %

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 當(dāng)歸多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組Bax 蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表3，圖1。

表3 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量比較（）

表3 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量比較（）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

圖1 細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)

2.4 當(dāng)歸多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 中miR-148a-3p 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組miR-148a-3p 表達(dá)量降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+低劑量組miR-148a-3p 表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高糖+低劑量組比較，高糖+中劑量組miR-148a-3p 表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高糖+中劑量組比較，高糖+高劑量組miR-148a-3p 表達(dá)量升高（P ＜0.05）。見表4。

表4 各組miR-148a-3p 表達(dá)量比較（ ）

表4 各組miR-148a-3p 表達(dá)量比較（ ）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與高糖組比較，△P ＜0.05；與高糖+低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高糖+中劑量組比較，□P ＜0.05

2.5 miR-148a-3p 表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組miR-148a-3p 表達(dá)量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組miR-148a-3p 表達(dá)量及SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p mimics組miR-148a-3p 表達(dá)量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組miR-148a-3p 表達(dá)量及SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表5，表6。

表5 各組miR-148a-3p 表達(dá)量比較（ ）

表5 各組miR-148a-3p 表達(dá)量比較（ ）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

表6 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

表6 各組SOD 活性、MDA 水平比較（）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

2.6 miR-148a-3p 表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 凋亡率的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組凋亡率降低（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p mimics 組凋亡率降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組凋亡率降低（P＜0.05）。見表7。

表7 各組凋亡率比較（ ） %

表7 各組凋亡率比較（ ） %

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

2.7 miR-148a-3p 表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 表達(dá)的影響 與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-148a-3p mimics 組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），高糖+miR-148a-3p inhibitor 組Bax 蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p mimics組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p mimics 組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，高糖+當(dāng)歸多糖+miR-148a-3p inhibitor 組Bax 蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表8，圖2。

表8 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量比較（）

表8 各組Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量比較（）

注：與高糖+miR-NC 組比較，# P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p mimics 組比較，△P ＜0.05；與高糖+miR-148a-3p inhibitor 組比較，▲P ＜0.05

圖2 細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)

3 討論

RGC 是各級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中唯一參與視神經(jīng)纖維形成且將視網(wǎng)膜視覺信息傳遞至視覺中樞的神經(jīng)元，RGC 間相互鑲嵌構(gòu)成視網(wǎng)膜的內(nèi)層結(jié)構(gòu)，其軸突集合形成視神經(jīng)。RGC 損傷是DR 的早期特征及主要病因，持續(xù)高血糖是誘導(dǎo)其發(fā)生的重要原因之一[6]。研究[7]認(rèn)為，高糖誘導(dǎo)RGC 損傷與線粒體功能障礙、自身免疫、鈣離子超載、谷氨酸興奮毒性、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏及氧化應(yīng)激密切相關(guān)。研究[8]指出，保護(hù)RGC、減輕其高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可延緩DR 發(fā)生。

正常生理狀態(tài)下，機(jī)體中氧自由基為動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在高糖狀態(tài)下，RGC 中的SOD 活性降低，無法及時(shí)清除活性氧而致其聚集在細(xì)胞中，引起脂質(zhì)過氧化，生成大量MDA，引發(fā)氧化損傷[9]。氧化應(yīng)激進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，其途徑與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 有關(guān)，Bax 蛋白表達(dá)量升高對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)當(dāng)歸多糖處理后，高糖誘導(dǎo)的RGC 中SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高，MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量降低，且表現(xiàn)為劑量依賴性，提示當(dāng)歸多糖可減輕高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷，減少凋亡。當(dāng)歸多糖是傘形科植物當(dāng)歸的提取物，含有D-木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-半乳糖、半乳糖醛酸等多種成分，具有顯著的免疫促進(jìn)效應(yīng)及抗氧化活性，可減輕胰島β 細(xì)胞損傷，增強(qiáng)胰、腎、心、腦及眼中SOD 活性，降低MDA 含量，減輕過氧化損傷[11]。

miRNA 廣泛存在于真核生物中，通過與靶向基因的mRNA 完全或者不完全互補(bǔ)結(jié)合，使其降解或抑制其蛋白翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞功能[12-13]。本研究結(jié)果顯示，高糖可抑制miR-148a-3p 表達(dá)，過表達(dá)miR-148a-3p 可減輕高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷及凋亡，抑制其表達(dá)將加劇高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷及凋亡，提示miR-148a-3p 可作為治療DR 的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸多糖可上調(diào)高糖誘導(dǎo)的RGC 中miR-148a-3p 表達(dá)，且表現(xiàn)為劑量依賴性，而抑制miR-148a-3p表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)當(dāng)歸多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC 的影響，提示當(dāng)歸多糖可能通過上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)減輕高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，當(dāng)歸多糖可減輕高糖誘導(dǎo)的RGC 氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡，且表現(xiàn)為劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)有關(guān)。